Monitoramento de colonização bacteriana e manutenção em raízes de Arabidopsis Arabidopsis thaliana em um sistema hidropônico flutuante

Resumo

Aqui nós descrevemos um ensaio hidropônico do crescimento de planta para quantificar a presença da espécie e para visualizar a distribuição espacial das bactérias durante a colonização inicial de raizes de planta e após sua transferência em ambientes diferentes do crescimento.

Resumo

As bactérias formam microbiomas complexos de rizosfera em forma de micróbios interagindo, organismos maiores e o ambiente abiótico. Em condições laboratoriais, a colonização por rizosfera por bactérias promotoras de crescimento vegetal (PGPB) pode aumentar a saúde ou o desenvolvimento de plantas hospedeiras em relação às plantas não colonizadas. No entanto, em configurações de campo, os tratamentos bacterianos com PGPB muitas vezes não fornecem benefícios substanciais para as culturas. Uma explanação é que esta pode ser devido à perda do PGPB durante interações com os micróbios endógenos do solo sobre o tempo da planta. Essa possibilidade tem sido difícil de confirmar, uma vez que a maioria dos estudos se concentra na colonização inicial e não na manutenção do PGPB dentro das comunidades de rizosfera. É a hipótese de que a montagem, a coexistência e a manutenção de comunidades bacterianas são moldadas por características determinísticas do microambiente da rizosfera, e que essas interações podem impactar a sobrevida do PGPB em ambientes nativos. Para estudar esses comportamentos, um ensaio hidropônico de crescimento vegetal é otimizado usando Arabidopsis Arabidopsis thaliana para quantificar e visualizar a distribuição espacial de bactérias durante a colonização inicial das raízes das plantas e após a transferência para o crescimento diferente Ambientes. A reprodutibilidade e utilidade deste sistema são então validadas com o bem estudado PGPB Pseudomonas Simiae. Para investigar como a presença de múltiplas espécies bacterianas pode afetar a colonização e a dinâmica de manutenção na raiz da planta, uma comunidade modelo de três cepas bacterianas (um Arthrobacter, Curtobacteriume microbacterium espécies) originalmente isoladas da rhizofera a . Arabidopsis thaliana é construída. Mostra-se que a presença destas espécies bacterianas diversas pode ser medida usando este ensaio hidropônico da planta-maintanence, que fornece uma alternativa aos estudos de comunidade bacterianos de sequenciamento-baseados. Estudos futuros que utilizam este sistema podem melhorar a compreensão do comportamento bacteriano em microbiomas de plantas multiespécies ao longo do tempo e em mudanças nas condições ambientais.

Introdução

A destruição das culturas por doenças bacterianas e fúngicas resulta na diminuição da produção de alimentos e pode perturbar severamente a estabilidade global¹. Com base na descoberta de que os micróbios em solos supressores são responsáveis pelo aumento da saúde vegetal², os cientistas perguntaram se o microbioma vegetal pode ser aproveitado para apoiar o crescimento das plantas, modificando a presença e abundância de particular espécies bacterianas³. As bactérias encontradas para ajudar no crescimento ou no desenvolvimento de planta são denominadas coletivamente bactérias promotoras do crescimento de planta (PGPB). Mais recentemente, os estudos mudaram de simplesmente identificar potencial PGPB para compreender como interkingdom interações no solo, em torno de raízes, ou na rizosfera (a área diretamente circundante e incluindo a superfície radicular) pode estar impactando PGPB atividade⁴.

A colonização por rizosfera pelo PGPB pode aumentar a saúde ou o desenvolvimento de plantas hospedeiras em resposta a diversos estressores em relação às plantas não colonizadas⁵. Entretanto, os resultados são frequentemente mais variáveis em condições nativas do solo comparadas àquelas observadas nas configurações de estufa e de laboratório de perto controladas⁶. Uma hipótese para essa diferença é que o crescimento ou o comportamento do pgpb pode ser inibido por bactérias ou fungos nativos do solo nos campos^7,8. Efeitos benéficos por bactérias rizosfera geralmente dependem da capacidade das bactérias para 1) localizar e mover-se para a raiz, 2) colonizar a raiz através da formação de biofilme, e 3) interagir com a planta hospedeira ou patógenos através da produção de pequenas moléculas metabolitos^7,9. Qualquer um desses comportamentos de colonização pode ser afetado pela presença e atividade de micróbios vizinhos¹⁰.

Foi elaborado um sistema para quantificar e visualizar esses distintos estágios bacterianos de colonização da rizosfera (Figura 1). Essa abordagem facilitará estudos investigando por que a manutenção de PGPB a longo prazo não é, por vezes, observada após a transferência de plantas para novos ambientes, como durante o plantio de mudas pré-inoculadas. A Arabidopsis Arabidopsis thaliana foi escolhida como modelo vegetal devido ao seu uso extensivo em estudos laboratoriais, bem como aos amplos dados disponíveis sobre suas interações microbianas¹¹. Há três estágios no sistema: 1) crescimento de A. Arabidopsis thaliana , 2) colonização bacteriana e 3) manutenção bacteriana (ver Figura 1). Porque a. Arabidopsis thaliana é uma planta terrestre, era importante assegurar-se de que não sofresse o esforço de água indevido no sistema hidropônico¹². Inspirados nos métodos utilizados por Haney et al.¹³, as mudas são cultivadas em malha plástica para separar a parte aérea do meio de crescimento líquido. Este sistema não parece comprometer a saúde eo desenvolvimento do hospedeiro da planta, e melhora a. Arabidopsis thaliana crescimento em líquido¹¹. À medida que a planta atira flutua acima da superfície, as raízes são totalmente expostas à colonização por bactérias inoculadas no meio de crescimento bacteriano líquido. Isto permite que as bactérias do interesse sejam examinadas para a colonização nos nutrientes que são as mais favoráveis ao crescimento, ao então desloc condições para permitir que a planta continue crescendo em um meio nutriente projetado suportar seu crescimento. Ambos os estágios incluem agitação constante para prevenir a anóxia da raiz¹³. As bactérias podem ser visualizadas ou quantificadas a partir das raízes da planta após a transferência do meio de colonização ou do meio de manutenção. Este sistema hidropônico é muito flexível, permitindo que as condições experimentais e as tensões aplicadas sejam facilmente alteradas, dependendo dos interesses dos pesquisadores.

Este método descrito é importante no contexto do corpo maior da literatura sobre interações planta-micróbe porque fornece um sistema robusto para estudar estas interações na superfície da raiz ao igualmente ser customizável às preferências do crescimento de bactérias diferentes. Laboratórios de biologia vegetal muitas vezes executam experimentos de colonização de planta-micróbe em ágar sólido, permitindo apenas movimento planar (se isso) de bactérias, exigindo também a manipulação potencialmente destrutiva de plantas durante a transferência subsequente. Em contrapartida, os laboratórios de microbiologia têm freqüentemente priorizado a saúde das bactérias dentro de seus experimentos, em detrimento das plantas^14,15. Essas diferentes prioridades de laboratórios centrados em plantas e Microbiologia têm historicamente dificultado a comparação de resultados entre esses grupos, uma vez que cada um tipicamente otimiza as condições experimentais para otimizar seu organismo de interesse¹⁵. O sistema de flutuação-malha-planta-crescimento descrito aqui impede a submersão completa da planta, uma vantagem notável aos estudos microbiologia-orientados precedentes, ao igualmente otimizar temporariamente o crescimento e a sobrevivência das bactérias para facilitar a colonização. Assim, o ensaio que apresentamos aqui pode abordar as preocupações de ambos os biólogos de plantas (sobre a hidratação e manipulação tátil da planta), satisfazendo os critérios dos microbiologistas (permitindo diferentes condições de crescimento bacteriano e múltiplas interações de espécies)⁷. Este protocolo é projetado ser adaptável para o uso com várias bactérias, plantas, e condições ambientais.

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Protocolo

Nota: a configuração experimental é descrita para maior clareza e usada para gerar os resultados representativos incluídos neste relatório, mas as condições podem ser modificadas conforme desejado. Todos os passos devem ser realizados usando EPI e após reccomendations institucionais e federais para a segurança, de acordo com o status BSL das bactérias utilizadas.

1. caracterização de bactérias

1. Determine a morfologia das bactérias na placa de agar de médio crescimento. Reressuscitem as células em um OD aproximado₆₀₀ = 0,5 e a placa de um volume de 1 μl no meio de agar de escolha. Adicione X-GAL às placas de agar para uma concentração final de 20 mg/mL para diferenciar melhor os membros individuais da comunidade bacteriana específica. Cresça em 24 ° c ou 30 ° c até a forma das colônias, a seguir tome retratos e notas na morfologia da colônia.
2. Definir a correlação entre a densidade óptica de cada cepa bacteriana e o número de CFU (unidades formadoras de colônias) por mL¹⁶. Ressuscitem as bactérias em 1 mL de água em uma placa de 24 poços para um OD aproximado₆₀₀ = 5, executam duas vezes diluições seriais, monitoram o OD₆₀₀ de todas as diluições, e a placa cada para determinar o CFU/ml viável em cada amostra em densidades ópticas múltiplas.
3. Determine a tolerância máxima de sonication para cada cepa bacteriana. Para fazer isso, as células alíquotas em uma placa de 24 poços contendo meio líquido, reservando algumas células como uma amostra de controle unsonicated. Usando um ultrasonicator com um acessório do chifre de 24 pontas, aplique três círculos de 12 s do sonication em 40 ampères com pulsos de 2 s.
   Nota: o uso de um ultrasonicator de 24 poços é aconselhado a facilitar a multiplexação a jusante de amostras de plantas de processamento, mas se não estiver disponível, use um ultrasonicator equipado com uma microtip e realize cada amostra sonication independentemente. Sempre use Earmuffs nominal de pelo menos 25 NRR proteção.
4. Realize 10 vezes diluições seriadas das amostras sonicated e unsonicated e mancha em placas de agar. Determine se há uma redução em células viáveis após a sonicação. Em caso afirmativo, use uma amostra fresca e repita a etapa do sonication usando um tempo total reduzido da sonication ou uma amplitude até que o tratamento não tenha nenhum efeito no CFU/mL final¹⁷.

2. preparação de mudas de Arabidopsis Arabidopsis thaliana em malha plástica

1. Crie discos da malha plástica usando um perfurador de furo padrão.
   1. Colete os discos em um recipiente de vidro com uma tampa frouxa da folha de alumínio, e esterilize usando uma autoclave ajustada a um ciclo seco de 20 minutos¹³.
   2. Usando tweezers Flame-sterilized, distribua aproximadamente 40 discos sterilized da malha em uma única camada através da superfície de uma placa do ágar da planta-crescimento-média. Use sais de 0,5 x Murashige e Skoog (MS), contendo 500 mg/L de tampão MES [2-(N-morpholino) ácido etanólico] e 1,5% de agar Bacto, como meio de crescimento vegetal, com 50 μg/mL de benomilo adicionado ao limite de contaminação fúngica das mudas.
2. Prepare sementes axênicas de A. Arabidopsis thaliana como descrito anteriormente¹⁷.
   1. Coloc aproximadamente 100 – 300 sementes cada em uns tubos de centrifugação individuais em uma cremalheira e coloc em um vidro resealable ou em um recipiente plástico pesado ("frasco") em uma capa das emanações.
   2. Usando o cuidado, coloc uma taça de 100 mL do alvejante no frasco, adicione 3 mL do HCl concentrado ao alvejante, e sele imediatamente o frasco e permita que os fumos esterilize sementes por pelo menos 4 h.
   3. Retire cuidadosamente os tubos de sementes esterilizadas debaixo do jarro e vedação.
3. Coloque duas sementes no centro de cada malha. Placas de vedação com fita cirúrgica e incubar por 2 – 6 dias a 4 ° c na escuridão para vernalizar sementes.
4. Para germinar e cultivar mudas, coloque o lado do agar de placa para baixo em uma câmara de crescimento de plantas por 8 – 10 dias em configurações de dia curto: 9 h de luz a 21 ° c e 15 h de escuro a 18 ° c (Figura 1, etapa 2).

3. colonização de plantas em meio de crescimento bacteriano líquido

1. Adicione 1 mL de meio de crescimento bacteriano a cada poço de uma placa esterilizada de 24 poços, exceto para as cavidades de controle somente de mídia. Use o caldo Lennox Luria (10 g de triptona, 5 g de extrato de levedura, 5 g de NaCl) como o meio de crescimento bacteriano.
2. Transferir as mudas germinadas incorporadas em malha de placas de agar para o líquido (Figura 1, etapa 3a).
   1. Descasque delicadamente a malha que contem duas plântulas germinadas acima e fora da placa do ágar usando o fórceps flama-sterilized. Escolha a malha com mudas igualmente dimensionadas e não danificadas.
   2. Se a remoção do agar não for Lisa, descarte a malha e a planta. Transfira um flutuador a cada poço do líquido do crescimento bacteriano, lado da raiz para baixo.
3. Inocular bactérias em poços contendo mudas flutuantes.
   1. Ressuscitem as bactérias cultivadas durante a noite em placas de agar para um OD₆₀₀ equivalente a 10⁸ CFU/ml no líquido de médio crescimento bacteriano. Adicionar 10 μL de suspensão bacteriana a cada poço para uma concentração final de 10⁶ CFU bactérias por poço.
   2. Se preparar uma mistura de bactérias, ressuscitem cada um para o OD₆₀₀ equivalente a 10⁸ CFU/ml, misture em proporções iguais, e adicione 10 μL da mistura final por poço de líquido.
4. Selar a placa para o crescimento estéril. Sem tocar no lado pegajoso, pressione cuidadosamente o filme permeável a gás através da placa. Assegure-se de que cada poço esteja selado individualmente aplicando a pressão em torno de cada um dos anéis feitos pelos poços. Recoloque a tampa plástica da placa confortavelmente sobre a placa e o filme permeável a gás (Figura 1, passo 3B).
5. Incubar as placas por 18 h em uma câmara de crescimento vegetal, as mesmas condições que as mudas foram originalmente germinadas, exceto em um agitador de placa orbital definido para 220 rpm.

4. manutenção da colonização bacteriana

1. Para enxaguar todos os flutuadores (plantas no engranzamento), adicione 1 mL da água estéril aos poços de uma placa 24-well nova. Remova o filme permeável a gás. Usando fórceps estéril, transfira flutuadores aos poços com água (Figura 1, etapa 4a). Enxágüe descansando por 10 min à temperatura ambiente (RT) sem agitação.
   Nota: para determinar a eficiência da colonização bacteriana das raízes, em vez de sua capacidade de manter a colonização ao longo do tempo, as plantas podem ser sacrificadas nesta etapa, levando-os diretamente para o passo 5,1.
2. Encha os poços de uma placa nova de 24 poços com 1 mL de meio de crescimento vegetal. Transfira uma malha para cada poço. Cubra com um selo permeável a gás e incubar por 72 h no agitador da placa orbital a 220 rpm na câmara de crescimento vegetal (Figura 1, etapa 4b).
3. Repita a enxaguadela como realizada na etapa 4,1 com flutuadores após o período de incubação de 72 h.

5. coleção das bactérias para contagens viáveis da pilha

Nota: o número de bactérias por raiz de plântulas pode ser determinado em qualquer ponto temporal de incubação. A colonização pode ser monitorada entre 0 h e 18 h, enquanto a manutenção pode ser monitorada a partir de 18 h em diante. As plantas destinadas à imagem latente podem prosseguir diretamente à seção 6.

1. Retire as mudas da malha (Figura 1, etapa 5). Coloc delicadamente o fórceps flama-sterilized abaixo das folhas (mas no lado da folha da malha), e comprima levemente a haste. Mexa as mudas para cima e para longe da malha para desalojar a raiz sem quebrá-la. Se a raiz quebrar, raspe delicadamente a parte inferior da malha para recolher o comprimento cheio.
2. Remova as bactérias das raízes das plantas. Transfira as bactérias para poços de uma placa 24-bem contendo 1 mL de ddH₂0. SONICATE as amostras conforme descrito na etapa 1,3.
   Nota: usando um microscópio, procure todas as bactérias restantes na superfície da raiz em uma amostra sonicated. Se as bactérias permanecem, aumente o tempo ou a intensidade total do sonication até que nenhuma bactéria permaneça ligada, até o nível o mais elevado de sonication que não afeta contagens viáveis da pilha como determinado na seção 1.
3. Quantificar as bactérias nas raízes.
   1. Realize diluições seriais de 10 vezes das amostras sonicadas até uma diluição de 10^-6 em meio de crescimento bacteriano. Adicione 50 μL de cada diluição a placas de agar individuais e espalhe com grânulos de vidro estéreis (ou espalhador bacteriano). Incubar as placas com a temperatura ideal para as bactérias até que as colônias individuais são Countable.
   2. Uma vez distinguível, contar o número de cada morfologia da colônia (conforme determinado na seção 1), e calcular CFU de cada espécie bacteriana por plântula. Descarte todas as amostras que mostrem contaminação, pois a contaminação durante a colonização ou manutenção pode afetar a presença bacteriana.

6. coleção de raízes de plantas intactas para microscopia

1. Usando fórceps, retire as mudas de malha como na seção 5.
2. Transfira cada planta para lâminas de microscópio.
   1. Coloque a ponta da raiz no slide e arraste para longe da ponta para definir o disparo para baixo Flush com o slide, assegurando uma raiz endireitada para melhor imagem. Adicione uma gota de água ou meio de crescimento vegetal estéril às amostras para hidratar as interfaces entre as lamelas e os slides.
   2. Coloc um lamela de vidro apenas acima da coroa da raiz (a região encaixotado mais superior em Figura 1) e abaixo das folhas do tiro para evitar inclinar da lamínula (para permitir a imagem latente da coroa da raiz), e pressione para baixo delicadamente¹⁷.
3. Se usando bactérias fluorescentes, a imagem usando filtros apropriados da excitação/emissão para diferenciar as bactérias de se e a raiz¹⁸da planta.

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Resultados

O bem caracterizado PGPB P. Simiae WCS417r é conhecido por colonizar as raízes de a. Arabidopsis thaliana na cultura hidropônica. Esta bactéria naturalmente fluorescente pode ser facilmente visualizada usando microscopia nas raízes das mudas após a colonização (Figura 2). Embora seja possível a imagem do comprimento total dessas mudas de a. Arabidopsis thaliana ' (4 – 6 mm de comprimento) raízes, fazê-lo para muitas pla...

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Discussão

Plantas em todos os ambientes interagem com milhares a milhões de diferentes bactérias e fungos^5,7. Essas interações podem impactar negativamente e positivamente a saúde das plantas, com potenciais efeitos na produção de culturas e no rendimento alimentar. Trabalhos recentes também sugerem que a colonização variável de culturas por PGPBs pode ser responsável por tamanho de planta imprevisível e produtividade de culturas em ensaios de campo

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Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Required Materials
1.5 mL eppendorf tubes	any	N/A
24-well plates	BD Falcon	1801343
Aeraseal	Excel Scientific	BE255A2
Autoclave	any	N/A
Bacteria of Interest	any	N/A	Stored at -80?C in 40% glycerol preferred
BactoAgar	BD	2306428; REF 214010
bleach	any	N/A
Conviron	any	N/A	Short Day Light-Dark Cycles: 460-600 µmoles/m²/s set at 9/15 hours light/dark at 18/21?C, with inner power outlet
Dessicator Jar: glass or heavy plastic	any	N/A
Ethanol	any	N/A
Flame	any	N/A
Forceps	any	N/A
Incubator	any	N/A	At optimal temperature for growth of specified bacteria
Hydrochloric Acid	any	N/A
Lennox LB Broth	RPI	L24066-1000.0
Microcentrifuge	any	N/A
Micropipetters	any	N/A	Volumes 5 µL to 1000 µL
Microscope (preferably fluorescence)	any	N/A	Could be light if best definition not important
MS Salts + MES	RPI	M70300-50.0
Orbital Plate Shaker	any	N/A	Capable of running at 220 rpm for at least 96 hours
Petri Dishes	any	N/A	50 mL total volume
Reservoirs	any	N/A
Spectrophotometer	any	N/A
Standard Hole Punch	any	N/A	Approximately 7mm punch diameter
Sterile water	any	N/A
Surgical Tape	3M	MMM1538-1
Teflon Mesh	McMaster-Carr	1100t41
Ultrasonicator	any	N/A
Vortex Mixer	any	N/A
X-gal	GoldBio	x4281c	other vendors available
Suggested Materials
24 Prong Ultrasonicator attachment	any	N/A	For sonicating multiple samples at once. Can be done individually
Alumaseal II	Excel Scientific	FE124F
Glass beads	any	N/A
Multipetter/Repetter	any	N/A
Sterile 96-well plates	any	N/A	For serial dilutions. Can be replaced by eppendorf tubes
Biological Materials Used
Arabidopsis thaliana seeds	any	N/A	We recommend Arabidopsis Biological Resource Center for seed stocks
Arthrobacter nicotinovorans			Levy, et al. 2018
Curtobacterium oceanosedimentum			Levy, et al. 2018
Microbacterium oleivorans			Levy, et al. 2018
Pseudomonas simiae WCS417r			Published in a similar system in Haney, et al. 2015. Strain used developed in Cole, et al. 2017