ניטור מושבת חיידקי ותחזוקה על השורשים האראדותזיס thaliana במערכת ידרופוני צף

Summary

כאן אנו מתארים ידרופוני צמח שיטת הצמיחה כדי נוכחות המינים ככמת ולהמחיש את התפלגות מרחבית של חיידקים במהלך הקולוניזציה הראשונית של שורשי הצמח ולאחר העברתם לסביבות צמיחה שונות.

Abstract

חיידקים צורה מורכבת מיקרו-המוני microbiomes מעוצב על ידי חיידקים אינטראקציה, אורגניזמים גדולים יותר, הסביבה אביוטיים. בתנאי מעבדה, מושבת ריזוספירה באמצעות גידול בקטריה לקידום חיידקים (PGPB) יכול להגביר את הבריאות או פיתוח של צמחים מארחים ביחס לצמחים uncolonized. עם זאת, בהגדרות שדה, טיפולים חיידקיים עם PGPB לעתים קרובות לא מספקים יתרונות משמעותיים יבולים. הסבר אחד הוא כי זה עשוי להיות עקב אובדן של PGPB במהלך האינטראקציות עם חיידקים בקרקע אנדוגניים על תוחלת החיים של הצמח. אפשרות זו הייתה קשה לאישור, מכיוון שרוב המחקרים מתמקדים בקולוניזציה הראשונית ולא בתחזוקת PGPB בתוך קהילות הריון. היפותזה כאן היא כי האסיפה, דו-קיום, ותחזוקה של קהילות חיידקי מעוצבים על ידי תכונות דטרמיניסטיות של הסביבה מיקרוזוספירה, וכי אינטראקציות אלה עלולות להשפיע על הישרדות PGPB בהגדרות מקוריות. כדי ללמוד התנהגויות אלה, הידרופוני צמח-צמיחה ממוטבת באמצעות Arabidopsis thaliana לכמת ולהמחיש את ההתפלגות המרחבית של חיידקים במהלך הקולוניזציה הראשונית של שורשי הצמח ולאחר העברת צמיחה שונים סביבות. מערכת זו של המערכת ואת כלי השירות מאומתים אז עם היטב-למד PGPB פסאודומונס simiae. כדי לחקור כיצד נוכחות של מינים חיידקיים מרובים עשויים להשפיע על הקולוניזציה והדינמיקה תחזוקה על שורש הצמח, קהילה מודל משלושה זנים חיידקיים ( Arthrobacter, curtobacterium, ו microbacterium מינים) מבודדים במקור מתוך מבנה הבית . זה מראה כי הנוכחות של מינים אלה חיידקים מגוונים ניתן למדוד באמצעות זה ידרופוני צמח-maintanence שיטת, אשר מספק אלטרנטיבה מבוססי רצף לימודי הקהילה החיידקית. מחקרים עתידיים באמצעות מערכת זו עשויים לשפר את ההבנה של התנהגות חיידקית של microbiomes צמח רב מינים לאורך זמן, בתנאים סביבתיים שינוי.

Introduction

הרס יבול על ידי מחלות חיידקי ופטרייתי תוצאות הוריד מזון והוא יכול לשבש באופן חמור את היציבות הגלובלית¹. מבוסס על גילוי כי חיידקים בקרקעות מדכאים אחראים על הגדלת בריאות הצמח², מדענים שאלו אם מיקרובידום הצמח יכול להיות ממונף כדי לתמוך בצמיחה הצמח על ידי שינוי הנוכחות והשפע של מסוים מין חיידקי³. חיידקים שנמצאו כדי לסייע בצמיחה הצמח או פיתוח הם באופן קולקטיבי הצומח צמיחה-קידום חיידקים (PGPB). לאחרונה, מחקרים השתנו פשוט לזיהוי PGPB פוטנציאלי כדי להבין כיצד אינטראקציה בין הממלכה בקרקע, סביב שורשים, או בתוך הריון (האזור שמסביב ישירות וכולל משטח השורש) עשוי להשפיע PGPB פעילות⁴.

הקולוניזציה של ריזוספירה על ידי PGPB יכול להגביר את הבריאות או התפתחות של צמחים מארחים בתגובה לשעולים מגוונים ביחס הצמחים לבטל הכובש⁵. עם זאת, התוצאות הן לעתים קרובות יותר משתנה בתנאי הקרקע הילידים לעומת אלה שנצפו בחממה מבוקרת היטב הגדרות מעבדה⁶. השערה אחת להבדל זה היא כי הצמיחה או התנהגות של pgpb יכול להיות מעוכבים על ידי חיידקים הקרקע הילידים או פטריות בשדות^7,8. השפעות מועילות על ידי חיידקים ריזוספירה תלויים בדרך כלל על היכולת של חיידקים 1) לאתר ולנוע לעבר השורש, 2) ליישב את השורש באמצעות היווצרות ביוilm, ו 3) אינטראקציה עם הצמח המארח או פתוגנים באמצעות ייצור של מולקולה קטנה מטבוליטים^7,9. כל אחד מאותם התנהגויות מושבת עשוי להיות מושפע על ידי נוכחות ופעילות של חיידקים שכנים¹⁰.

עיצבנו מערכת לכמת ולהמחיש את שלבי הקולוניזציה החיידקית הנפרדים של הריזוספירה (איור 1). גישה זו תסייע למחקרים לחקור מדוע תחזוקה לטווח ארוך PGPB הוא לפעמים לא נצפתה לאחר העברת צמחים לסביבות חדשות, כגון במהלך השתילה של שתילים מחוסנת מראש. Arabidopsis thaliana כפי שנבחרו כמודל צמח בשל השימוש הנרחב שלה לימודי מעבדה, כמו גם נתונים מספיק זמין על אינטראקציות מיקרוביאלית שלה¹¹. ישנם שלושה שלבים במערכת: 1 . thaliana צמיחה, 2) מושבת חיידקים, ו 3) שמירה חיידקית (ראה איור 1). מכיוון ש -thaliana היא צמח יבשתי, היה חשוב להבטיח כי זה לא סבל לחץ מים מופרז במערכת ידרופוני¹². בהשראת השיטות בשימוש על ידי Haney et al.¹³, השתילים גדלים על רשת פלסטיק כדי להפריד את לירות מתוך מדיום הצמיחה נוזל. מערכת זו אינה מהווה פגיעה בבריאות ובפיתוח של מארח הצמח, והיא משפרת את צמיחת ה -thaliana בנוזל משנת¹¹. כמו הצמח לירות צף מעל פני השטח, השורשים חשופים לחלוטין הקולוניזציה על ידי חיידקים מחוסן לתוך בינוני נוזלי הצמיחה חיידקי. זה מתיר חיידקים של עניין להיבדק עבור מושבת חומרים מזינים כי הם התורמת ביותר לצמיחה, בעוד אז הסטה תנאים כדי לאפשר לצמח להמשיך לצמוח במדיום מזינים שנועד לתמוך בצמיחה שלה. שני השלבים כוללים טלטול קבוע כדי למנוע אנאוקאיה של שורש¹³. חיידקים יכולים להיות מדמיינו או כימות מן השורשים הצמח לאחר העברת מתוך מדיום או מדיום תחזוקה. מערכת ידרופוני זו היא גמישה מאוד, המאפשר תנאים ניסיוניים ומלחצים שהוחלו להשתנות בקלות בהתאם לאינטרסים של החוקרים.

שיטה זו מתוארת חשובה בהקשר של גוף הספרות הגדול יותר על אינטראקציות של חיידק הצמח, משום שהיא מספקת מערכת חזקה לחקר אינטראקציות אלה במשטח השורש, בעוד שניתן להתאמה אישית להעדפות הצמיחה של חיידקים שונים. מעבדות ביולוגיה של הצמח לעתים קרובות ביצוע ניסויים מושבת חיידק המפעל על מוצק אגר, המאפשר תנועה מישורי בלבד (אם זה) של חיידקים תוך דרישה גם מניפולציה הרסנית פוטנציאלי של צמחים במהלך ההעברה הבאה. לעומת זאת, מעבדות מיקרוביולוגיה מעדיפות לעתים קרובות את בריאותם של החיידקים בתוך הניסויים שלהם, לרעת הצמחים^14,15. סדרי עדיפויות שונים אלה של מעבדות צמחים ומיקרוביולוגיה ממוקדת היסטורית הפכו את זה קשה להשוות את התוצאות בין קבוצות אלה, מאז כל אחד בדרך כלל מייעל את התנאים הניסיוניים כדי לייעל את האורגניזם שלהם עניין¹⁵. מערכת צף-שינוי-צמח-הצמיחה המתואר כאן מונע שרידה צמח מלא, יתרון בולט למחקרים קודמים מונחה מיקרוביולוגיה, תוך שזמנית גם אופטימיזציה של הצמיחה והישרדות של חיידקים כדי להקל על הקולוניזציה. לפיכך, שיטת הטיפול שאנו מציגים כאן עשויה להתייחס לחששות משני הביולוגים של הצמח (על שחות יתר ומניפולציה מישוש של הצמח) תוך סיפוק הקריטריונים של מיקרוביולוגים (המאפשרים התפתחות שונה של הגידול בקטריאלי ומספר אינטראקציות של מינים)⁷. פרוטוקול זה נועד להיות ישימה לשימוש עם חיידקים שונים, צמחים, ותנאים סביבתיים.

Protocol

הערה: הכיוונון הנסיוני מתואר בבהירות ומשמש להפקת תוצאות הנציג הכלולות בדו ח זה, אך ניתן לשנות את התנאים כרצונך. כל השלבים יש לבצע באמצעות PPE ובעקבות מוסדיים והפדרלי מומלצים עבור בטיחות, על פי מצב BSL של החיידקים בשימוש.

1. אפיון חיידקים

1. לקבוע את המבנה של חיידקים על בינונית הצמיחה צלחת אגר. להשעות את התאים בקירוב OD₆₀₀ = 0.5 וצלחת 1 μl נפח על בינונית אגר של בחירה. הוסף X-גל לוחות אגר לריכוז הסופי של 20 מ"ג/mL כדי להבדיל טוב יותר חברים בודדים של הקהילה חיידקים ספציפיים. לגדול 24 ° צ' או 30 ° צ' עד לטופס המושבות, ואז לצלם תמונות של והערות על מורפולוגיה המושבה.
2. הגדר את הקורלציה בין צפיפות אופטית של כל זן חיידקי ומספר CFU (המושבה היוצרים יחידות) לכל mL¹⁶. להשעות חיידקים ב 1 מ ל של מים בצלחת 24-הבאר כדי OD₆₀₀ = 5, ביצוע מדלל סדרתי שני קיפול, הצג OD₆₀₀ של כל הדילול, וצלחת כל לקבוע את Cfu קיימא/mL בכל מדגם בצפיפויות אופטיות מרובות.
3. קבע את העמידות הsonication המירבית עבור כל זן חיידקי. כדי לעשות זאת, תאים סדרת מחלקים לתוך צלחת 24 המכיל בינוני נוזלי, להזמין כמה תאים כמדגם בקרת unsonicated. באמצעות ultrasonicator עם מצורף 24-tip הקרן, להחיל שלושה סיבובים של 12 s של sonication ב 40 amp עם 2 פעימות.
   הערה: השימוש של ultrasonicator 24 והוא מומלץ להקל על ריבוב הזרם של דגימות הצמח עיבוד, אבל אם אחד אינו זמין, להשתמש ultrasonicator מצויד מיקרוטיפ ולבצע כל דוגמה sonication באופן עצמאי. ללבוש תמיד אטמי אוזניים מדורגים לפחות 25 nrr הגנה.
4. לבצע מדלל סדרתי 10 מקפלים של sonicated ו unsonicated דגימות וספוט על צלחות אגר. קבע אם יש הפחתה בתאים קיימא לאחר sonication. אם כן, השתמש במדגם טרי וחזור על צעד sonication באמצעות סכום מופחת sonication זמן או משרעת עד לטיפול אין השפעה על CFU/mL הסופי¹⁷.

2. הכנת שתילים מערידרופזיס על רשת פלסטיק

1. יצירת דיסקים של רשת פלסטיק באמצעות האגרופן חור רגיל.
   1. לאסוף את הדיסקים במיכל זכוכית עם כיסוי רופף של רדיד אלומיניום, ולעקר באמצעות החיטוי להגדיר 20 דקות יבש מחזור¹³.
   2. באמצעות להבה, מלקחיים מעוקר, להפיץ כ 40 בדיסק רשת שינוי מעוקר בשכבה אחת על פני השטח של הצמח-צמיחה-בינונית הצלחת אגר. השתמש 0.5 x מורראשיג ו Skoog (MS) מלחים, המכיל 500 mg/L של מאגר MES [2-(N-גוורנולינו) ו 1.5% Bacto אגר, כמו גידול בינוני הצמח, עם 50 μg/mL benomyl להגביל זיהום פטרייתי של השתילים.
2. הכינו זרעי אקאנמית של א. thaliana כפי שתוארה בעבר¹⁷.
   1. מניחים כ-100 – 300 זרעים כל אחד לצינורות צנטריפוגה בודדים בארון תקשורת ומקום לתוך זכוכית מחדש או מיכל פלסטיק כבד ("צנצנת") בתוך מכסה.
   2. באמצעות זהירות, במקום גביע של 100 mL של אקונומיקה לתוך הצנצנת, להוסיף 3 מ ל HCl מרוכז ל אקונומיקה, ומיד לאטום את הצנצנת ולאפשר אדים לעקר זרעים לפחות 4 h.
   3. בזהירות להסיר את הצינורות של זרעים מעוקר מתחת לצנצנת ולאטום.
3. מניחים שני זרעים במרכז כל רשת. חותם לוחיות עם סרט כירורגי ו מודלת עבור 2 – 6 ימים ב 4 ° צ' בחשיכה כדי להעניש זרעים.
4. כדי לנבוט ולצמוח שתילים, למקם את הצלחת אגר בצד למטה בחדר הצמיחה צמח עבור 8 – 10 ימים תחת הגדרות יום קצר: 9 h של אור ב 21 ° צ' ו 15 h של כהה ב 18 ° צ' (איור 1, שלב 2).

3. מושבת צמחים בינונית-גידול בקטריאלי נוזלי

1. הוסף 1 מ ל של בינוני גדילה בקטריאלי לכל באר של צלחת 24-באר סטרילי, למעט מדיה בלבד בקרת בארות. השתמש במרק לוריא (10 גרם של טריטונים, 5 גר' תמצית שמרים, 5 גרם של הנאל) כמדיום הגדילה החיידקי.
2. להעביר את השתילים מונבטים מוטבע רשת שינוי מלוחות אגר לנוזל (איור 1, שלב 3a).
   1. בעדינות לקלף את רשת השינוי המכילה שני שתילים מונבטים למעלה ולמטה את הצלחת אגר באמצעות מלקחיים להבה מעוקר. לבחור רשת עם שתילים בגודל שווה ולא ניזוק.
   2. אם ההסרה של אגר אינו חלק, למחוק את הרשת ואת הצמח. העבר מצוף אחד לכל באר של נוזלי גדילה בקטריאלי, בצד השורש למטה.
3. מחסן חיידקים לבארות המכילים שתילים צפים.
   1. להשעות את החיידקים מחדש לילה על לוחות אגר כדי OD₆₀₀ שווה ערך ל 10⁸ cfu/mL בנוזל בינוני הצמיחה חיידקי. הוסף 10 μL של השעיה בקטריאלי לכל טוב עבור ריכוז סופי של 10⁶ בקטריה cfu לכל טוב.
   2. אם הכנת שילוב של חיידקים, מחדש כל אחד ל-OD₆₀₀ שווה ל 10⁸ cfu/mL, לערבב בפרופורציות שווה, ולהוסיף 10 μl של המיקס הסופי לכל טוב של נוזל.
4. לאטום את הצלחת לצמיחה סטרילית. מבלי לגעת בצד הדביק, לחץ בזהירות על הסרט חדירות הגז על פני הצלחת. ודא כי כל באר נאטם באופן אינדיבידואלי על ידי הפעלת לחץ סביב כל אחת מטבעות שנעשו על ידי הבארות. החלף את מכסה הפלסטיק של הצלחת על הצלחת ועל הסרט חדירות גז (איור 1, שלב 3b).
5. מודקת לוחיות עבור 18 h בחדר הגידול צמח, תחת אותם תנאים כמו השתילים היו מונבטים במקור, למעט על שייקר צלחת מסלולית להגדיר 220 rpm.

4. תחזוקת מושבת חיידקים

1. כדי לשטוף את כל צף (צמחים על רשת שינוי), להוסיף 1 מ ל של מים סטריליים לבארות של צלחת 24-באר חדש. הסרת סרט חדיר גז. באמצעות מלקחיים סטריליים, העברת צף בארות עם מים (איור 1, שלב 4a). לשטוף על ידי מנוחה 10 דקות בטמפרטורת החדר (RT) ללא עצבנות.
   הערה: כדי לקבוע את יעילות הקולוניזציה החיידקית של שורשים ולא את יכולתם לשמור על המושבות לאורך זמן, הצמחים יכולים להיות מוקרבים בשלב זה על ידי לקיחת אותם ישירות לשלב 5.1.
2. למלא את הבארות של צלחת חדשה 24-באר עם 1 מ ל של גידול בינוני הצמח. העבר שינוי אחד לכל באר. מכסה עם חותם חדיר גז, הדגירה של 72 h על שייקר צלחת המסלול ב 220 rpm בחדר הצמיחה צמח (איור 1, שלב 4b).
3. חזור על השטיפה כפי שבוצעה בשלב 4.1 עם צף לאחר תקופת הדגירה 72 h.

5. אוסף של חיידקים עבור ספירות תאים קיימא

הערה: מספר החיידקים לכל שורש שתיל יכול להיקבע בכל נקודת זמן דגירה. ניתן לנטר את הקולוניזציה בין 0 h ל-18 שעות, בעוד שניתן לנטר את התחזוקה מ -18 ואילך. הצמחים המיועדים לדימות יכולים להמשיך ישירות לסעיף 6.

1. הסר את השתילים מרשת השינוי (איור 1, שלב 5). מניחים בעדינות מלקחיים מעוקר להבה מתחת לעלים (אבל בצד העלה של הרשת), ולצבוט בקלות את הגבעול. להזיז את השתילים מעלה והרחק מרשת לעקור את השורש מבלי לשבור אותו. אם השורש נשבר, בעדינות לגרד את החלק התחתון של הרשת כדי לאסוף את האורך המלא.
2. להסיר חיידקים משורשים הצמח. להעביר את החיידקים כדי בארות של צלחת 24-היטב המכילים 1 מ ל של ddH₂0. Sonicate את הדגימות כמתואר בשלב 1.3.
   הערה: בעזרת מיקרוסקופ, חפשו את כל החיידקים הנותרים על משטח השורש במדגם sonicated. אם החיידק נשאר, להגדיל את הזמן הsonication הכולל או האינטנסיביות עד החיידקים לא להישאר מאוגדים, עד לרמה הגבוהה ביותר של sonication שאינו משפיע על ספירות תאים קיימא כפי שנקבע בסעיף 1.
3. לכמת את החיידקים על שורשים.
   1. בצע דילול 10-קיפול סדרתי של דגימות sonicated עד 10^-6 דילול במדיום גידול חיידקי. הוסף 50 μL של כל דילול לצלחות אגר בודדים להתפשט עם חרוזי זכוכית סטרילית (או spreader חיידקי). הצלחות דגירה בטמפרטורה אופטימלית עבור חיידקים עד מושבות הפרט הם countable.
   2. לאחר להבדיל, לספור את מספר כל מורפולוגיה המושבה (כפי שנקבע בסעיף 1), ולחשב CFU של כל זן חיידקי לכל שתיל. להיפטר כל הדגימות מראה זיהום, כמו זיהום במהלך הקולוניזציה או תחזוקה עלול להשפיע על נוכחות חיידקית.

6. אוסף שורשי צמחים שלמים למיקרוסקופיה

1. באמצעות מלקחיים, להסיר את השתילים מרשת כמו בסעיף 5.
2. העבר כל צמח לשקופיות מיקרוסקופ.
   1. הצב את קצה השורש בשקופית וגרור הרחק מהקצה כדי להגדיר את הריקון למטה עם השקופית ולהבטיח שורש מיושר עבור הדמיה מיטבית. הוסף טיפת מים או בינונית הצמיחה סטרילי הצמח לדגימות כדי הממשקים מימה בין הכיסויים שקופיות.
   2. מניחים שמיכות זכוכית בדיוק מעל הכתר השורש (האזור העליון באיור 1) ומתחת העלים לירות כדי למנוע את הנטייה של שמיכות (כדי לאפשר הדמיית השורש), ולחץ למטה בעדינות¹⁷.
3. אם השימוש בחיידקים פלורסנט, התמונה באמצעות מסנני עירור/פליטה מתאימים כדי להבדיל חיידקים זה מזה ואת שורש הצמח¹⁸.

תוצאות

PGPB מאופיין ב P. simiae WCS417r ידוע ליישב את שורשיו של א. thaliana בתרבות ידרופוני. זה חיידק פלורסנט באופן טבעי יכול בקלות להיות דמיינו באמצעות מיקרוסקופ על שורשי שתילים לאחר הקולוניזציה (איור 2). למרות שניתן לדמות את האורך המלא של אלה שתילים. thaliana (4 – 6 מ...

Discussion

צמחים בכל הסביבות אינטראקציה עם אלפים למיליוני חיידקים שונים ופטריות^5,7. אינטראקציות אלה יכולות להשפיע בצורה שלילית וחיובית על בריאות הצמח, עם השפעות פוטנציאליות על תפוקת יבול וייצור מזון. העבודה האחרונה מרמזת גם כי התיישבות משתנה של יבולים על ידי PGPBs עשוי ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Required Materials
1.5 mL eppendorf tubes	any	N/A
24-well plates	BD Falcon	1801343
Aeraseal	Excel Scientific	BE255A2
Autoclave	any	N/A
Bacteria of Interest	any	N/A	Stored at -80?C in 40% glycerol preferred
BactoAgar	BD	2306428; REF 214010
bleach	any	N/A
Conviron	any	N/A	Short Day Light-Dark Cycles: 460-600 µmoles/m²/s set at 9/15 hours light/dark at 18/21?C, with inner power outlet
Dessicator Jar: glass or heavy plastic	any	N/A
Ethanol	any	N/A
Flame	any	N/A
Forceps	any	N/A
Incubator	any	N/A	At optimal temperature for growth of specified bacteria
Hydrochloric Acid	any	N/A
Lennox LB Broth	RPI	L24066-1000.0
Microcentrifuge	any	N/A
Micropipetters	any	N/A	Volumes 5 µL to 1000 µL
Microscope (preferably fluorescence)	any	N/A	Could be light if best definition not important
MS Salts + MES	RPI	M70300-50.0
Orbital Plate Shaker	any	N/A	Capable of running at 220 rpm for at least 96 hours
Petri Dishes	any	N/A	50 mL total volume
Reservoirs	any	N/A
Spectrophotometer	any	N/A
Standard Hole Punch	any	N/A	Approximately 7mm punch diameter
Sterile water	any	N/A
Surgical Tape	3M	MMM1538-1
Teflon Mesh	McMaster-Carr	1100t41
Ultrasonicator	any	N/A
Vortex Mixer	any	N/A
X-gal	GoldBio	x4281c	other vendors available
Suggested Materials
24 Prong Ultrasonicator attachment	any	N/A	For sonicating multiple samples at once. Can be done individually
Alumaseal II	Excel Scientific	FE124F
Glass beads	any	N/A
Multipetter/Repetter	any	N/A
Sterile 96-well plates	any	N/A	For serial dilutions. Can be replaced by eppendorf tubes
Biological Materials Used
Arabidopsis thaliana seeds	any	N/A	We recommend Arabidopsis Biological Resource Center for seed stocks
Arthrobacter nicotinovorans			Levy, et al. 2018
Curtobacterium oceanosedimentum			Levy, et al. 2018
Microbacterium oleivorans			Levy, et al. 2018
Pseudomonas simiae WCS417r			Published in a similar system in Haney, et al. 2015. Strain used developed in Cole, et al. 2017