Überwachung der bakteriellen Kolonisation und Erhaltung von Arabidopsis thaliana Roots in einem schwimmenden Hydroponischen System

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir einen hydroponischen Pflanzenwachstumstest zur Quantifizierung des Artenvorkommens und zur Visualisierung der räumlichen Verteilung von Bakterien während der anfänglichen Besiedlung von Pflanzenwurzeln und nach deren Übertragung in verschiedene Wachstumsumgebungen.

Zusammenfassung

Bakterien bilden komplexe Rhizosphären-Mikrobiome, die durch interagierende Mikroben, größere Organismen und die abiotische Umgebung geformt werden. Unter Laborbedingungen kann die Besiedlung der Rhizosphäre durch pflanzenwachstumsfördernde Bakterien (PGPB) die Gesundheit oder die Entwicklung von Wirtspflanzen im Vergleich zu nicht kolonisierten Pflanzen erhöhen. In Feldumgebungen bieten bakterielle Behandlungen mit PGPB jedoch oft keine wesentlichen Vorteile für Die Kulturen. Eine Erklärung ist, dass dies auf den Verlust der PGPB während der Wechselwirkungen mit endogenen Bodenmikroben über die Lebensdauer der Pflanze zurückzuführen sein kann. Diese Möglichkeit war schwer zu bestätigen, da sich die meisten Studien auf die anfängliche Kolonisierung konzentrieren und nicht auf die Aufrechterhaltung von PGPB innerhalb von Rhizosphärengemeinschaften. Es wird hier vermutet, dass die Montage, Koexistenz und Aufrechterhaltung von Bakteriengemeinschaften durch deterministische Merkmale der Rhizosphäre Mikroumgebung geformt sind, und dass diese Wechselwirkungen das ÜBERLEBEN von PGPB in nativen Umgebungen beeinflussen können. Um diese Verhaltensweisen zu untersuchen, wird ein hydroponischer Pflanzenwachstumstest mit Arabidopsis thaliana optimiert, um die räumliche Verteilung von Bakterien während der anfänglichen Besiedlung von Pflanzenwurzeln und nach der Übertragung auf verschiedene Wachstumsergebnisse zu quantifizieren und zu visualisieren. Umgebungen. Die Reproduzierbarkeit und nützlichkeit dieses Systems werden dann mit dem gut untersuchten PGPB Pseudomonas simiaevalidiert. Um zu untersuchen, wie das Vorhandensein mehrerer Bakterienarten die Besiedlungs- und Erhaltungsdynamik auf der Pflanzenwurzel beeinflussen kann, eine Modellgemeinschaft aus drei Bakterienstämmen (ein Arthrobacter, Curtobacteriumund Microbacterium Ursprünglich aus der A. thaliana Rhizosphäre isoliert, ist konstruiert. Es wird gezeigt, dass das Vorhandensein dieser verschiedenen Bakterienarten mit diesem hydroponischen Pflanzen-Maintanence-Assay gemessen werden kann, der eine Alternative zu Sequenzierungsbasierten bakteriellen Gemeinschaftsstudien bietet. Zukünftige Studien mit diesem System können das Verständnis des bakteriellen Verhaltens in Mehrarten-Pflanzenmikrobiomen im Laufe der Zeit und in sich verändernden Umweltbedingungen verbessern.

Einleitung

Die Zerstörung von Pflanzen durch bakterielle und Pilzkrankheiten führt zu einer geringeren Nahrungsmittelproduktion und kann die globale Stabilität stark stören¹. Basierend auf der Entdeckung, dass Mikroben in unterdrückenden Böden für die Erhöhung der Pflanzengesundheit verantwortlich sind², haben Wissenschaftler gefragt, ob das Pflanzenmikrobiom genutzt werden kann, um das Pflanzenwachstum zu unterstützen, indem das Vorhandensein und die Fülle bestimmter Bakterienarten³. Bakterien, die beim Pflanzenwachstum oder bei der Entwicklung helfen, werden kollektiv als pflanzenwachstumsfördernde Bakterien (PGPB) bezeichnet. In jüngerer Zeit haben sich Studien von der einfachen Identifizierung potenzieller PGPB zu dem Verständnis verschoben, wie Interkingdom-Wechselwirkungen im Boden, um Wurzeln oder in der Rhizosphäre (das Gebiet, das direkt um die Wurzeloberfläche liegt) DIE PGPB beeinflussen können. Aktivität⁴.

Rhizosphäre Kolonisation durch PGPB kann die Gesundheit oder die Entwicklung von Wirtspflanzen als Reaktion auf verschiedene Stressoren im Vergleich zu unkolonisierten Pflanzen^{erhöhen 5}. Allerdings sind die Ergebnisse bei einheimischen Bodenverhältnissen oft variabler als in den eng kontrollierten Gewächshäusern und Laborumgebungen⁶. Eine Hypothese für diesen Unterschied ist, dass das Wachstum oder Verhalten von PGPB durch einheimische Bodenbakterien oder Pilze in den Feldern^7,8gehemmt werden kann. Günstige Effekte von RhizosphäreBakterien hängen in der Regel von der Fähigkeit der Bakterien ab, 1) zu lokalisieren und sich in Richtung der Wurzel zu bewegen, 2) die Wurzel durch Biofilmbildung zu besiedeln und 3) mit der Wirtspflanze oder Krankheitserregern über die Produktion kleiner Moleküle zu interagieren Metaboliten^7,9. Jedes dieser Kolonisierungsverhalten kann durch das Vorhandensein und die Aktivität benachbarter Mikroben beeinflusst werden¹⁰.

Wir haben ein System entwickelt, um diese ausgeprägten bakteriellen Besiedlungsstadien der Rhizosphäre zu quantifizieren und zu visualisieren (Abbildung 1). Dieser Ansatz wird Studien erleichtern, die untersuchen, warum die langfristige PGPB-Wartung nach der Übertragung von Pflanzen in neue Umgebungen, wie z. B. bei der Anpflanzung von vorgeimpften Sämlingen, manchmal nicht beobachtet wird. Arabidopsis thaliana als Pflanzenmodell aufgrund seiner umfangreichen Verwendung in Laborstudien sowie der umfangreichen verfügbaren Daten über seine mikrobiellen Wechselwirkungen¹¹. Es gibt drei Stufen im System: 1) A. thaliana Wachstum, 2) bakterielle Besiedlung und 3) bakterielle Erhaltung (siehe Abbildung 1). Da A. thaliana eine terrestrische Pflanze ist, war es wichtig sicherzustellen, dass sie nicht übermäßigen Wasserstress im hydroponischen System erlitt¹². Inspiriert von den Methoden von Haney et al.^13,werden die Sämlinge auf Kunststoffgitter numeriert, um den Trieb vom flüssigen Wachstumsmedium zu trennen. Dieses System scheint die Gesundheit und Entwicklung des Pflanzenwirts nicht zu beeinträchtigen, und es verbessert das A. thaliana Wachstum in flüssigen¹¹. Während der Pflanzentrieb über der Oberfläche schwebt, werden die Wurzeln vollständig der Besiedlung durch Bakterien ausgesetzt, die in das flüssige bakterielle Wachstumsmedium eingeimpft werden. Dies ermöglicht es Bakterien von Interesse auf die Besiedlung in Nährstoffen untersucht werden, die am meisten förderlich für das Wachstum sind, während dann die Bedingungen verschieben, damit die Pflanze weiterhin in einem Nährstoffmedium wachsen, das entwickelt wurde, um sein Wachstum zu unterstützen. Beide Stadien beinhalten stetiges Schütteln, um Anoxie der Wurzel¹³zu verhindern. Bakterien können aus den Pflanzenwurzeln nach dem Transfer aus dem Besiedlungsmedium oder dem Pflegemedium visualisiert oder quantifiziert werden. Dieses hydroponische System ist sehr flexibel, so dass experimentelle Bedingungen und angewandte Spannungen je nach Interessen der Forscher leicht verändert werden können.

Diese beschriebene Methode ist im Kontext des größeren Literaturkörpers über Pflanzen-Mikroben-Wechselwirkungen wichtig, da sie ein robustes System zur Untersuchung dieser Wechselwirkungen an der Wurzeloberfläche bietet und gleichzeitig an die Wachstumspräferenzen von verschiedenen Bakterien. Pflanzenbiologie-Labore führen oft Pflanzen-Mikroben-Kolonisationsexperimente an festen Agarn durch, sodass nur eine planare Bewegung (wenn dies) von Bakterien möglich ist, während gleichzeitig die potenziell destruktive Manipulation von Pflanzen während der späteren Übertragung erforderlich ist. Im Gegensatz dazu haben mikrobiologische Labore häufig die Gesundheit der Bakterien in ihren Experimenten priorisiert, zum Nachteil der Pflanzen^14,15. Diese unterschiedlichen Prioritäten pflanzen- und mikrobiologischer Labore haben es in der Vergangenheit schwierig gemacht, die Ergebnisse zwischen diesen Gruppen zu vergleichen, da jede in der Regel experimentelle Bedingungen optimiert, um ihren Organismus von Interesse zu optimieren¹⁵. Das hier beschriebene Floating-Mesh-Pflanzen-Wachstumssystem verhindert das vollständige Eintauchen von Pflanzen, ein bemerkenswerter Vorteil früherer mikrobiologisch-orientierter Studien, während gleichzeitig das Wachstum und Überleben von Bakterien vorübergehend optimiert wird, um die Kolonisation zu erleichtern. So kann der Test, den wir hier vorstellen, Bedenken sowohl von Pflanzenbiologen (über Überfeuchtung und taktile Manipulation der Pflanze) als auch die Erfüllung der Kriterien von Mikrobiologen (die unterschiedliche bakterielle Wachstumsbedingungen und mehrere Wechselwirkungen der Arten)⁷. Dieses Protokoll ist so konzipiert, dass es für den Einsatz mit verschiedenen Bakterien, Pflanzen und Umweltbedingungen anpassungsfähig ist.

Protokoll

HINWEIS: Der Versuchsaufbau wird aus Gründen der Übersichtlichkeit beschrieben und verwendet, um die repräsentativen Ergebnisse in diesem Bericht zu generieren, aber die Bedingungen können nach Belieben geändert werden. Alle Schritte sollten mit PSA und folgenden institutionellen und föderalen Rückforderungen für die Sicherheit durchgeführt werden, entsprechend dem BSL-Status der verwendeten Bakterien.

1. Charakterisierung von Bakterien

1. Bestimmen Sie die Morphologie von Bakterien auf dem Wachstumsmedium Agarplatte. Resuspend Zellen bei einem ungefähren OD₆₀₀ = 0,5 und Platte ein 1 L Volumen auf Agar Medium der Wahl. Fügen Sie X-gal zu Agar-Platten zu einer Endkonzentration von 20 mg/ml hinzu, um einzelne Mitglieder der spezifischen Bakteriengemeinschaft besser zu unterscheiden. Wachsen Sie bei 24 °C oder 30 °C, bis sich Kolonien bilden, und machen Sie dann Fotos und Notizen zur Koloniemorphologie.
2. Definieren Sie die Korrelation zwischen der optischen Dichte jedes Bakterienstamms und der Anzahl der KBE (Koloniebildeinheiten) pro ml¹⁶. Resuspend Bakterien in 1 ml Wasser in einer 24-Well-Platte auf eine ungefähre OD₆₀₀ = 5, führen sie zweifach serielle Verdünnungen durch, überwachen OD₆₀₀ aller Verdünnungen und platten jeweils die lebensfähige KBE/ml in jeder Probe bei mehreren optischen Dichten.
3. Bestimmen Sie die maximale Beschallungstoleranz für jeden Bakterienstamm. Dazu werden Zellen in eine 24-Well-Platte mit flüssigem Medium eingebracht, die einige Zellen als unbeschallte Kontrollprobe vorbehält. Mit einem Ultraschallgerät mit 24-Spitzen-Hornaufsatz, wenden Sie drei Runden von 12 s Beschallung bei 40 Ampere mit 2 s Impulsen.
   HINWEIS: Die Verwendung eines 24-Well-Ultraschallgerätes wird empfohlen, um das nachgeschaltete Multiplexing von Verarbeitungsanlagenproben zu erleichtern, aber wenn einer nicht verfügbar ist, verwenden Sie einen Ultraschallgerät, der mit einer Mikrospitze ausgestattet ist, und führen Sie jede Probenbeschallung unabhängig durch. Tragen Sie immer Ohrenschützer mit einem Nennwert von mindestens 25 NRR-Schutz.
4. Führen Sie 10-fache serielle Verdünnungen der beschallten und unbeschallten Proben durch und erkennen Sie auf Agarplatten. Bestimmen Sie, ob es eine Verringerung der lebensfähigen Zellen nach der Beschallung gibt. Wenn ja, verwenden Sie einen frischen Proben- und wiederholten Beschallungsschritt mit einer reduzierten Gesamtbeschallungszeit oder Amplitude, bis die Behandlung keine Auswirkungen auf die endgültige CFU/mL¹⁷hat.

2. Herstellung von Arabidopsis thaliana Sämlingen auf einem Kunststoffgitter

1. Erstellen Sie Scheiben des Kunststoffgewebes mit einem Standardlochstanzer.
   1. Sammeln Sie die Scheiben in einem Glasbehälter mit einer lockeren Abdeckung aus Aluminiumfolie, und sterilisieren Sie mit einem Autoklaven auf einen 20 min Trockenzyklus^{eingestellt 13}.
   2. Verteilen Sie mit einer flammensterilisierten Pinzette ca. 40 sterilisierte Netzscheiben in einer einzigen Schicht über die Oberfläche einer pflanzenwachstumsmittleren Agarplatte. Verwenden Sie 0,5x Murashige- und Skoog-Salze (MS), die 500 mg/L MES-Puffer [2-(N-Morpholino)Ethansulfonsäure] und 1,5 % Bacto-Agar als Pflanzenwachstumsmedium enthalten, wobei 50 g/ml Benomyl der Grenze der Pilzkontamination der Sämlinge zugesetzt werden.
2. Bereiten Sie axtische Samen von A. thaliana wie zuvor beschrieben¹⁷.
   1. Legen Sie jeweils ca. 100–300 Samen in einzelne Zentrifugenrohre in ein Rack und legen Sie sie in einen wiederverschließbaren Glas- oder schweren Kunststoffbehälter ("Jar") in eine Dunstabzugshaube.
   2. Mit Vorsicht, legen Sie einen Becher von 100 ml Bleichmittel in das Glas, fügen Sie 3 ml konzentrierte HCl auf die Bleichmittel, und sofort versiegeln Sie das Glas und lassen Sie Dämpfe Samen für mindestens 4 h sterilisieren.
   3. Entfernen Sie vorsichtig die Schläuche von sterilisierten Samen unter dem Glas und versiegeln.
3. Legen Sie zwei Samen in die Mitte jedes Netzes. Platten mit chirurgischem Klebeband versiegeln und 2–6 Tage bei 4 °C in der Dunkelheit bebrüten, um Samen zu vernalisieren.
4. Um Sämlinge zu keimen und anzubauen, legen Sie die Platte Agarseite in einer Pflanzenwachstumskammer für 8–10 Tage unter kurzen Tageseinstellungen: 9 h Licht bei 21 °C und 15 h Dunkel bei 18 °C (Abbildung1, Schritt 2).

3. Kolonisierung von Pflanzen in flüssigem bakteriellem Wachstumsmedium

1. Fügen Sie 1 ml bakterielles Wachstumsmedium zu jedem Brunnen einer sterilen 24-Well-Platte hinzu, mit Ausnahme von reinen Medienkontrollbrunnen. Verwenden Sie Lennox Luria Broth (10 g Trypton, 5 g Hefeextrakt, 5 g NaCl) als bakterielles Wachstumsmedium.
2. Übertragen Sie die in Mesh eingebetteten keimten Sämlinge von Agarplatten in die Flüssigkeit (Abbildung1, Schritt 3a).
   1. Schälen Sie das Netz mit zwei gekeimten Sämlingen vorsichtig mit flammensterilisierten Zangen auf und von der Agarplatte. Wählen Sie Mesh mit gleich großen und unbeschädigten Sämlingen.
   2. Wenn das Entfernen aus dem Agar nicht glatt ist, entsorgen Sie dieses Netz und die Pflanze. Übertragen Sie einen Schwimmer auf jede Bohrung von bakteriellen Wachstum Flüssigkeit, Wurzelseite nach unten.
3. Inokulieren Sie Bakterien in Brunnen, die schwimmende Sämlinge enthalten.
   1. Resuspend Bakterien wachsen über Nacht auf Agar-Platten zu einem OD₆₀₀ entspricht 10⁸ KBE/ml in der bakteriellen Wachstumsmedium Flüssigkeit. Fügen Sie jedem Brunnen 10 l bakterielle Suspension für eine Endkonzentration von 10⁶ KBE-Bakterien pro Brunnen hinzu.
   2. Wenn Sie eine Mischung von Bakterien vorbereiten, setzen Sie jede auf die OD₆₀₀ entsprechend 10⁸ KBE/ml, mischen Sie in gleichen Anteilen, und fügen Sie 10 l der endlichen Mischung pro Bohrgut Flüssigkeit hinzu.
4. Versiegeln Sie die Platte für steriles Wachstum. Ohne die klebrige Seite zu berühren, drücken Sie vorsichtig den gasdurchlässigen Film über die Platte. Stellen Sie sicher, dass jeder Brunnen einzeln versiegelt wurde, indem Sie Druck um jeden der Ringe ausüben, die von den Brunnen gemacht werden. Ersetzen Sie den Kunststoffdeckel der Platte kuschelig über der Platte und der gasdurchlässigen Folie (Abbildung1, Schritt 3b).
5. Inkubieren Sie die Platten für 18 h in einer Pflanzenwachstumskammer, unter den gleichen Bedingungen wie die Sämlinge ursprünglich gekeimt wurden, außer auf einem Orbitalplatten-Shaker auf 220 U/min eingestellt.

4. Aufrechterhaltung der bakteriellen Besiedlung

1. Um alle Schwimmer (Pflanzen auf Mesh) zu spülen, fügen Sie 1 ml steriles Wasser in die Brunnen einer neuen 24-Well-Platte. Gasdurchlässige Folie entfernen. Mit sterilen Zangen, übertragen Schwimmer zu Brunnen mit Wasser (Abbildung1, Schritt 4a). Spülen Sie durch Ausruhen für 10 min bei Raumtemperatur (RT) ohne Rührung.
   HINWEIS: Um die bakterielle Besiedlungseffizienz der Wurzeln zu bestimmen, anstatt ihre Fähigkeit, die Besiedlung im Laufe der Zeit aufrechtzuerhalten, können Pflanzen in diesem Schritt geopfert werden, indem sie direkt zu Schritt 5.1 gebracht werden.
2. Füllen Sie die Brunnen einer neuen 24-Well-Platte mit 1 ml Pflanzenwachstumsmedium. Übertragen Sie ein Netz auf jeden Brunnen. Mit einer gasdurchlässigen Dichtung abdecken und 72 h auf dem Orbitalplatten-Shaker bei 220 Umdrehungen pro Minute in der Pflanzenwachstumskammer inkubieren (Abbildung1, Schritt 4b).
3. Wiederholen Sie die Spülung wie in Schritt 4.1 mit Schwimmern nach der 72 h Inkubationszeit.

5. Sammlung von Bakterien für lebensfähige Zellzahl

HINWEIS: Die Anzahl der Bakterien pro Sämlingswurzel kann zu jedem Inkubationszeitpunkt bestimmt werden. Die Kolonisation kann zwischen 0 h und 18 h überwacht werden, während die Wartung ab 18 h überwacht werden kann. Pflanzen, die für die Bildgebung bestimmt sind, können direkt zu Abschnitt 6 übergehen.

1. Entfernen Sie die Sämlinge aus dem Netz (Abbildung1, Schritt 5). Legen Sie die flammensterilisierten Zangen vorsichtig unter die Blätter (aber auf der Blattseite des Netzes), und kneifen Sie den Stiel leicht. Wiggle die Sämlinge auf und weg aus dem Netz, um die Wurzel zu vertreiben, ohne sie zu brechen. Wenn die Wurzel bricht, kratzen Sie vorsichtig den Netzboden, um die volle Länge zu sammeln.
2. Entfernen Sie Bakterien von Pflanzenwurzeln. Übertragen Sie die Bakterien in die Brunnen einer 24-Well-Platte, die 1 ml ddH₂0 enthält. Sonicate die Proben wie in Schritt 1.3 beschrieben.
   HINWEIS: Suchen Sie mit einem Mikroskop nach verbleibenden Bakterien auf der Wurzeloberfläche auf einer beschallten Probe. Wenn Bakterien bleiben, erhöhen Sie die gesamte Beschallungszeit oder -intensität, bis keine Bakterien gebunden bleiben, bis zu dem höchsten Grad der Beschallung, die nicht lebensfähige Zellzahl beeinflusst, wie in Abschnitt 1 bestimmt.
3. Quantifizieren Sie die Bakterien an den Wurzeln.
   1. Führen Sie serielle 10-fache Verdünnungen der beschallten Proben bis zu einer Verdünnung von 10^-6 im bakteriellen Wachstumsmedium durch. Fügen Sie 50 l jeder Verdünnung zu einzelnen Agarplatten hinzu und verteilen Sie sie mit sterilen Glasperlen (oder bakteriellem Streuer). Inkubieren Sie Platten bei der optimalen Temperatur für Bakterien, bis einzelne Kolonien zählbar sind.
   2. Zählen Sie einmal die Anzahl jeder Koloniemorphologie (wie in Abschnitt 1 bestimmt) und berechnen Sie die KBE jeder Bakterienart pro Sämling. Entsorgen Sie alle Proben, die eine Kontamination aufweisen, da eine Kontamination während der Besiedlung oder Wartung das Vorhandensein von Bakterien beeinträchtigen kann.

6. Sammlung intakter Pflanzenwurzeln für die Mikroskopie

1. Entfernen Sie die Sämlinge mit Zangen aus dem Netz wie in Abschnitt 5.
2. Übertragen Sie jede Pflanze auf Mikroskopschlitten.
   1. Legen Sie die Spitze der Wurzel auf die Folie und ziehen Sie von der Spitze weg, um den Shoot bündig mit der Folie zu setzen, um eine begradigte Wurzel für beste Bildgebung zu gewährleisten. Fügen Sie den Proben einen Tropfen Wasser oder ein steriles Pflanzenwachstumsmedium hinzu, um die Schnittstellen zwischen den Abdeckungen und Dias zu hydratisieren.
   2. Legen Sie einen Glasdeckel knapp über der Wurzelkrone (oberste Boxregion in Abbildung 1) und unter die Triebblätter, um eine Schräglage des Coverslips zu vermeiden (um eine Wurzelkronenbildgebung zu ermöglichen), und drücken Sie vorsichtig¹⁷nach unten.
3. Bei Verwendung von fluoreszierenden Bakterien, Bild mit geeigneten Anregung / Emissionsfilter, um Bakterien voneinander und die Pflanzenwurzel¹⁸zu unterscheiden.

Ergebnisse

Die gut charakterisierte PGPB P. simiae WCS417r ist dafür bekannt, die Wurzeln von A. thaliana in der hydroponischen Kultur zu besiedeln. Dieses natürlich fluoreszierende Bakterium kann leicht mit Hilfe der Mikroskopie an den Wurzeln von Sämlingen nach der Besiedlung visualisiert werden (Abbildung 2). Obwohl es möglich ist, die volle Länge der Wurzeln dieser A. thaliana Sämlinge (4-6 mm Länge) abzubilden, würde dies für vie...

Diskussion

Pflanzen in allen Umgebungen interagieren mit Tausenden bis Millionen von verschiedenen Bakterien und Pilzen^5,7. Diese Wechselwirkungen können sich entweder negativ und positiv auf die Pflanzengesundheit auswirken, mit möglichen Auswirkungen auf den Ernteertrag und die Nahrungsmittelproduktion. Jüngste Arbeiten deuten auch darauf hin, dass eine variable Besiedlung von Kulturen durch PGPBs für unvorhersehbare Pflanzengröße und Ernteerträge in Feldversuchen ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Required Materials
1.5 mL eppendorf tubes	any	N/A
24-well plates	BD Falcon	1801343
Aeraseal	Excel Scientific	BE255A2
Autoclave	any	N/A
Bacteria of Interest	any	N/A	Stored at -80?C in 40% glycerol preferred
BactoAgar	BD	2306428; REF 214010
bleach	any	N/A
Conviron	any	N/A	Short Day Light-Dark Cycles: 460-600 µmoles/m²/s set at 9/15 hours light/dark at 18/21?C, with inner power outlet
Dessicator Jar: glass or heavy plastic	any	N/A
Ethanol	any	N/A
Flame	any	N/A
Forceps	any	N/A
Incubator	any	N/A	At optimal temperature for growth of specified bacteria
Hydrochloric Acid	any	N/A
Lennox LB Broth	RPI	L24066-1000.0
Microcentrifuge	any	N/A
Micropipetters	any	N/A	Volumes 5 µL to 1000 µL
Microscope (preferably fluorescence)	any	N/A	Could be light if best definition not important
MS Salts + MES	RPI	M70300-50.0
Orbital Plate Shaker	any	N/A	Capable of running at 220 rpm for at least 96 hours
Petri Dishes	any	N/A	50 mL total volume
Reservoirs	any	N/A
Spectrophotometer	any	N/A
Standard Hole Punch	any	N/A	Approximately 7mm punch diameter
Sterile water	any	N/A
Surgical Tape	3M	MMM1538-1
Teflon Mesh	McMaster-Carr	1100t41
Ultrasonicator	any	N/A
Vortex Mixer	any	N/A
X-gal	GoldBio	x4281c	other vendors available
Suggested Materials
24 Prong Ultrasonicator attachment	any	N/A	For sonicating multiple samples at once. Can be done individually
Alumaseal II	Excel Scientific	FE124F
Glass beads	any	N/A
Multipetter/Repetter	any	N/A
Sterile 96-well plates	any	N/A	For serial dilutions. Can be replaced by eppendorf tubes
Biological Materials Used
Arabidopsis thaliana seeds	any	N/A	We recommend Arabidopsis Biological Resource Center for seed stocks
Arthrobacter nicotinovorans			Levy, et al. 2018
Curtobacterium oceanosedimentum			Levy, et al. 2018
Microbacterium oleivorans			Levy, et al. 2018
Pseudomonas simiae WCS417r			Published in a similar system in Haney, et al. 2015. Strain used developed in Cole, et al. 2017