浮遊水耕システムにおけるアラビドプシス・タリアナ根の細菌の植民地化と維持のモニタリング

要約

ここでは、種の存在を定量化し、植物の根の初期植民地化時および異なる成長環境への移動後の細菌の空間分布を可視化するための水耕植物成長アッセイについて説明する。

要約

細菌は、微生物、より大きな生物、および生物学的環境との相互作用によって形成された複雑な根茎圏微生物叢を形成する。実験室条件下では、植物成長促進細菌(PGPB)による根圏コロニー化は、未植民地化された植物に対する宿主植物の健康または発達を増加させることができる。しかし、フィールド設定では、PGPBによる細菌治療は、多くの場合、作物に実質的な利益を提供しません。1つの説明は、これは植物の寿命にわたって内因性土壌微生物との相互作用中にPGPBの損失に起因する可能性があることです。ほとんどの研究は、根茎群科内のPGPBの維持よりも初期の植民地化に焦点を当てているので、この可能性を確認することは困難でした。ここでは、細菌群集の組み立て、共存、維持は根圏微小環境の決定的特徴によって形成され、これらの相互作用がネイティブ環境におけるPGPB生存に影響を与える可能性があると仮定されている。これらの行動を研究するために、水耕植物成長アッセイは、植物の根の初期植民地化中および異なる成長への転移後の細菌の空間分布を定量化し、視覚化するためにアラビドプシスタリアナを使用して最適化されています。環境。このシステムの再現性と有用性は、よく研究されたPGPBシュードモナス・シミアで検証されます。複数の細菌種の存在が植物根の植民地化と維持のダイナミクスにどのように影響するかを調べるために、3つの細菌株(Arthrobacter、Curtobacterium、およびマイクロバクテリウム)からのモデルコミュニティ種)はもともとA.タリアナ根圏から単離され構築される。これらの多様な細菌種の存在は、シーケンシングベースの細菌コミュニティ研究に代わるものとなるこの水耕植物主化アッセイを用いて測定できることが示されている。このシステムを用いた今後の研究は、多種植物微生物叢の細菌行動の理解を時間の経過と共に、環境条件の変化に改善する可能性がある。

概要

細菌や真菌性疾患による作物の破壊は、食糧生産の低下を引き起こし、世界的な安定性を著しく破壊する可能性^{があります1.}抑制土壌中の微生物が植物の健康を増大させる原因であるという発見に基づいて、科学者は、植物の微生物叢が特定の存在と豊富さを修正することによって植物の成長をサポートするために利用することができるかどうか尋ねました。細菌種³.植物の成長または発達を助けるために見出された細菌は、総称して植物成長促進細菌(PGPB)と呼ばれています。最近では、潜在的なPGPBを特定するだけの研究から、土壌、根の周り、根間(根表面を含む直接周囲および根表面を含む領域)における王国間相互作用がPGPBにどのように影響しているかを理解することにシフトしています。アクティビティ⁴.

PGPBによる根圏の植民地化は、未植民地化された植物^に対する多様なストレスに応じて宿主植物の健康または発達を増加させることができる5.しかし、結果は、多くの場合、密接に制御された温室および実験室の設定6で観察されるものと比較して、ネイティブ土壌条件でより可変である。この違いの1つの仮説は、PGPBの増殖または挙動が、フィールド7、8における天然土壌細菌または真菌によって阻害されうるということです。根間細菌による有益な効果は、一般に、1)根に向かって移動する細菌の能力に依存し、2)バイオフィルム形成を通じて根を植民地化し、3)小分子の産生を介して宿主植物または病原体と相互作用する。代謝産物^7,9.これらの植民地化行動のいずれも、隣接する^微生物10の存在および活性の影響を受ける可能性がある。

我々は、根圏のこれらの異なる細菌の植民地化段階を定量化し、視覚化するシステムを設計した(図1)。このアプローチは、接種前の苗の植え付け中など、植物を新しい環境に移した後に、長期的なPGPB維持が観察されない理由を調査する研究を容易にする。アラビドプシスタリアナは、実験室研究における広範な使用だけでなく、その微生物相互作用^に関する利用可能な十分なデータ11のために植物モデルとして選ばれました。システムには3つの段階があります:1)A.タリアナ増殖、2)細菌の植民地化、および3)細菌の維持(図1参照)。A.タリアナは陸上植物であるため、水耕^系12において過度の水ストレスに苦しんでいないことを確認することが重要であった。Haney et al.¹³によって使用される方法に触発され、苗は液体成長媒体から芽を分離するためにプラスチックメッシュ上で成長する。このシステムは、植物宿主の健康と発達を損なっているようには見えず、^液体11におけるA.タリアナの成長を改善する。植物の芽が表面の上に浮かぶと、根は液体細菌増殖培地に接種された細菌によって植民地化に完全にさらされる。これにより、成長に最も役立つ栄養素の植民地化を調べ、その後、植物がその成長をサポートするように設計された栄養培地で成長し続けられるように条件をシフトすることができます。両方の段階は、^根13の無酸素症を防ぐために安定した揺れを含む。細菌は、コロニー化媒体または維持培地のいずれかからの転移後に植物根から可視化または定量することができる。この水耕栽培システムは非常に柔軟であり、研究者の興味に応じて実験条件や適用応力を容易に変更することができます。

この説明された方法は、植物微生物の相互作用に関するより大きな文献の文脈において重要である。異なる細菌。植物生物学研究室は、多くの場合、固体寒天に植物微生物の植民地化実験を行い、細菌の平面移動(もしそうなら)のみを可能にする一方で、その後の移植中に植物の潜在的に破壊的な操作を必要とします。対照的に、微生物学研究室は、頻繁に彼らの実験内の細菌の健康を優先し、植物14、15の不利益に。植物および微生物に焦点を当てたラボのこれらの異なる優先順位は、これらのグループ間の結果を比較することが歴史的に困難になってきた, それぞれが通常、関心のある彼らの生物を最適化するために実験条件を最適化するので15.ここで説明するフローティングメッシュ植物成長システムは、これまでの微生物学指向の研究に顕著な利点である完全な植物の浸漬を防ぎ、同時に、コロニー化を容易にするために細菌の成長と生存を一時的に最適化する。したがって、ここで提示するアッセイは、微生物学者の基準を満たしながら、植物生物学者(植物の過剰水和と触覚操作に関する)の両方の懸念に対処する可能性があります(異なる細菌の増殖条件と複数を可能にする)。種の相互作用)⁷.このプロトコルは、様々な細菌、植物、および環境条件での使用に適応できるように設計されています。

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プロトコル

注: 実験セットアップはわかりやすく説明されており、このレポートに含まれる代表的な結果を生成するために使用されますが、条件は必要に応じて変更できます。使用される細菌のBSLステータスに従って、すべてのステップはPPEを使用し、安全のための機関および連邦の再調整に従って行われるべきである。

1. 細菌の特性

1. 成長培地寒天プレート上の細菌の形態を決定します。およそOD₆₀₀ = 0.5で細胞を再中断し、1 μLの体積を選択した寒天媒体にプレートする。特定の細菌群集の個々のメンバーをより良く区別するために、20 mg/mLの最終濃度に寒天プレートにX-galを追加します。コロニーが形成されるまで24 °Cまたは30 °Cで成長し、その後、コロニーの形態の写真やメモを撮ります。
2. 各細菌株の光学密度とmL¹⁶あたりのCFU(コロニー形成単位)数との相関関係を定義する。24ウェルプレートの1mLの水中の細菌を約OD₆₀₀ =5に再定置し、2倍の連続希釈を行い、すべての希釈のOD₆₀₀を監視し、各サンプルで複数の光学密度で生存可能なCFU/mLを決定するプレートを行います。
3. 各細菌株の最大超音波処理許容度を決定します。これを行うには、アリコート細胞を液体培地を含む24ウェルプレートに入れ、一部の細胞を無言制御試料として予約する。24先端のホーンアタッチメントを備えた超音波装置を使用して、2つのパルスで40アンペアで超音波処理の12の3ラウンドを適用します。
   注:24ウェル超音波装置の使用は、処理プラントサンプルの下流多重化を容易にすることをお勧めしますが、利用できない場合は、マイクロチップを装着した超音波装置を使用し、各サンプル超音波処理を独立して実行します。常に少なくとも25 NRR保護に定格のイヤーマフを着用してください。
4. 超音波および非超音波サンプルの10倍の連続希釈を実行し、寒天プレートにスポット。超音波処理後に生存細胞の減少があるかどうかを確認します。もしそうなら、治療が最終的なCFU/mL¹⁷に影響を与えなくなるまで、減らされた総超音波処理時間または振幅を使用して、新鮮なサンプルを使用し、超音波処理ステップを繰り返します。

2. プラスチックメッシュ上のアラビドプシスタリアナ苗の準備

1. 標準の穴パンチャーを使用して、プラスチック メッシュのディスクを作成します。
   1. アルミ箔の緩いカバーを持つガラス容器にディスクを収集し、20分の乾燥^{サイクル13}に設定されたオートクレーブを使用して殺菌する。
   2. 炎殺菌ピンセットを使用して、植物成長培地寒天板の表面に約40枚の殺菌メッシュディスクを単層に分配します。0.5xムラシゲおよびスクーグ(MS)塩を使用し、500mg/LのMESバッファー[2-(N-モルフォリーノ)エタンサルホン酸]と1.5%のバクトー寒天を植物成長培地として含み、50μg/mLベノミルを苗の限界真菌汚染に添加する。
2. 前述の17.としてA.タリアナのアックスシーズ^を調べます。
   1. 約100~300個の種子をラック内の個々の遠心管に入れ、再密封可能なガラスまたは重いプラスチック容器(「瓶」)にヒュームフードに入れます。
   2. 注意して、100mLのブリーチのビーカーを瓶に入れ、濃縮HClの3mLを漂白剤に加え、すぐに瓶を密封し、煙が少なくとも4時間の種子を殺菌できるようにします。
   3. 瓶の下から殺菌した種子のチューブを慎重に取り除き、シールします。
3. 各メッシュの中心に 2 つのシードを配置します。外科テープでプレートをシールし、種子をバーナライズするために暗闇の中で4°Cで2〜6日間インキュベートします。
4. 苗を発芽させ、成長させるには、短い日の設定の下で8〜10日間植物成長室にプレート寒天側を置きます:21°Cで光の9時間と18°Cで暗いの15 h(図1、ステップ2)。

3. 液体細菌増殖培地における植物の植民地化

1. 無菌24ウェルプレートの各ウェルに1mLの細菌増殖培地を加えます( メディアのみの制御ウェルを除く)。細菌増殖培地としてレノックスルリアブロス(トリプトン10g、酵母エキス5g、NaCl5g)を使用してください。
2. メッシュに埋め込まれた発芽した苗を寒天板から液体に移します(図1、ステップ3a)。
   1. 2本の発芽した苗を含むメッシュを、火殺菌鉗子を使用して寒天プレートの上下にゆっくりと剥がします。等しいサイズと損傷のない苗を持つメッシュを選択します。
   2. 寒天からの除去が滑らかでない場合は、そのメッシュと植物を廃棄します。細菌増殖液の各ウェルに1つのフロートを転送し、根側を下にします。
3. 浮遊苗を含む井戸に細菌を接種する。
   1. 寒天プレート上で一晩増殖した細菌を、細菌増殖培地中液中の10⁸ CFU/mLに相当するOD₆₀₀に再停止する。各ウェルに10 μLの細菌懸濁液を加え、ウェル当たり10⁶ CFU細菌の最終濃度を確認します。
   2. 細菌の混合物を調製する場合は、それぞれ10⁸ CFU/mLに相当するOD₆₀₀に再中断し、等しい割合で混合し、液体のウェルあたりの最終ミックスの10 μLを追加する。
4. 無菌成長のためにプレートを密封してください。粘着性の側に触れることなく、慎重にプレート全体にガス透過性フィルムを押します。各井戸がウェルによって作られたリングの周りに圧力をかけることによって、各井戸が個別に密封されていることを確認してください。プレートとガス透過性フィルムの上にプレートのプラスチック蓋をぴったりと交換してください(図1、ステップ3b)。
5. 植物成長室で18時間プレートをインキュベートし、苗が最初に発芽したのと同じ条件下で、220rpmに設定された軌道プレートシェーカーを除く。

4. 細菌の植民地化の維持

1. すべてのフロート(メッシュ上の植物)をすすいで、新しい24ウェルプレートの井戸に滅菌水の1 mLを追加します。ガス透過性フィルムを取り除く。滅菌鉗子を使用して、水で井戸に浮遊物を移す(図1、ステップ4a)。撹拌することなく室温(RT)で10分間休息して洗い出す。
   注:時間の経過とともに植民地化を維持する能力ではなく、根の細菌の植民地化効率を決定するために、植物はステップ5.1に直接それらを取ることによって、このステップで犠牲にすることができます。
2. 植物成長培地の1 mLで新しい24ウェルプレートの井戸を埋めます。各ウェルに 1 つのメッシュを転送します。ガス透過性シールで覆い、植物成長室の220rpmで軌道プレートシェーカー上で72時間インキュベートします(図1、ステップ4b)。
3. 72時間のインキュベーション期間の後に浮動小数点でステップ4.1で行われたようにすすを繰り返します。

5. 生存細胞数のための細菌の採取

注:苗根あたりの細菌数は、任意のインキュベーションタイムポイントで決定することができる。植民地化は0時間から18時間の間に監視することができ、維持は18時間以降に監視することができる。イメージングのために運命づけられた植物は、セクション6に直接進むことができる。

1. メッシュから苗を取り除きます(図1、ステップ5)。葉の下に火炎殺菌鉗子をそっと置き(しかし、メッシュの葉側に)、茎を軽くつまみます。苗を上下に動かして、根を壊さずに根を外します。ルートが壊れた場合は、メッシュの底部をそっとこすり、全長を収集します。
2. 植物の根から細菌を取り除きます。dh2 0の1 mLを含む24ウェルプレートのウェルに細菌を移す。ステップ1.3で説明されているようにサンプルを超音波処理します。
   注:顕微鏡を使用して、超音波処理されたサンプルの根表面に残っている細菌を探します。細菌が残っている場合は、細菌が結合しないまで総超音波処理時間または強度を増加し、セクション1で決定される生存細胞数に影響を与えない最高レベルの超音波処理まで。
3. 根の細菌を定量化します。
   1. 細菌増殖培地で10-6希釈まで超音波処理サンプルの連続10倍希釈を行う。個々の寒天プレートに各希釈の50 μLを追加し、滅菌ガラスビーズ(または細菌拡散機)で広げます。個々のコロニーがカウント可能になるまで、細菌に最適な温度でプレートをインキュベートします。
   2. 一旦区別可能な場合は、各コロニー形態の数(セクション1で決定)をカウントし、苗ごとに各細菌種のCFUを計算する。植民地化またはメンテナンス中の汚染が細菌の存在に影響を与える可能性があるため、汚染を示すサンプルを廃棄してください。

6. 顕微鏡検査のための無傷の植物根のコレクション

1. 鉗子を使用して、セクション 5 のようにメッシュから苗を取り除きます。
2. 各プラントを顕微鏡スライドに転送します。
   1. スライド上に根の先端を置き、先端から離れてドラッグして、スライドで撮影をフラッシュし、最適なイメージングのためのまっすぐなルートを確保します。サンプルに一滴の水または無菌植物成長培地を加え、カバースリップとスライドの間のインターフェースを水和します。
   2. 根のリューズのすぐ上(図1の最上部のボックス領域)の上にガラスカバースリップを配置し、カバースリップの傾斜を避けるために撮影葉の下に(ルートクラウンイメージングを可能にするために)、穏^やかに17を押します。
3. 蛍光細菌を用いる場合、適切な励起/発光フィルターを用いて細菌を互いに区別する画像と植物根18。

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結果

よく特徴付けられたPGPB P.シミアエWCS417rは、水耕栽培におけるA.タリアナの根を植民地化することが知られている。この自然蛍光菌は、植民地化後の苗根の顕微鏡検査を用いて容易に可視化できる(図2)。これらのA.タリアナ苗の全長(4-6ミリメートルの長さ)の根を画像化することは可能ですが、多くの植物のためにそうするこ?...

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ディスカッション

すべての環境の植物は、異なる細菌や真菌の数百万に数千人と相互作用^5,7.これらの相互作用は、作物の収量と食糧生産に潜在的な影響を及ぼす植物の健康にマイナスと肯定的な影響を与えることができます。最近の研究はまた、PGPUによる作物の可変植民地化が、フィールド^{トライアル22}における予測不可能な植物サイズと作物収?...

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資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Required Materials
1.5 mL eppendorf tubes	any	N/A
24-well plates	BD Falcon	1801343
Aeraseal	Excel Scientific	BE255A2
Autoclave	any	N/A
Bacteria of Interest	any	N/A	Stored at -80?C in 40% glycerol preferred
BactoAgar	BD	2306428; REF 214010
bleach	any	N/A
Conviron	any	N/A	Short Day Light-Dark Cycles: 460-600 µmoles/m²/s set at 9/15 hours light/dark at 18/21?C, with inner power outlet
Dessicator Jar: glass or heavy plastic	any	N/A
Ethanol	any	N/A
Flame	any	N/A
Forceps	any	N/A
Incubator	any	N/A	At optimal temperature for growth of specified bacteria
Hydrochloric Acid	any	N/A
Lennox LB Broth	RPI	L24066-1000.0
Microcentrifuge	any	N/A
Micropipetters	any	N/A	Volumes 5 µL to 1000 µL
Microscope (preferably fluorescence)	any	N/A	Could be light if best definition not important
MS Salts + MES	RPI	M70300-50.0
Orbital Plate Shaker	any	N/A	Capable of running at 220 rpm for at least 96 hours
Petri Dishes	any	N/A	50 mL total volume
Reservoirs	any	N/A
Spectrophotometer	any	N/A
Standard Hole Punch	any	N/A	Approximately 7mm punch diameter
Sterile water	any	N/A
Surgical Tape	3M	MMM1538-1
Teflon Mesh	McMaster-Carr	1100t41
Ultrasonicator	any	N/A
Vortex Mixer	any	N/A
X-gal	GoldBio	x4281c	other vendors available
Suggested Materials
24 Prong Ultrasonicator attachment	any	N/A	For sonicating multiple samples at once. Can be done individually
Alumaseal II	Excel Scientific	FE124F
Glass beads	any	N/A
Multipetter/Repetter	any	N/A
Sterile 96-well plates	any	N/A	For serial dilutions. Can be replaced by eppendorf tubes
Biological Materials Used
Arabidopsis thaliana seeds	any	N/A	We recommend Arabidopsis Biological Resource Center for seed stocks
Arthrobacter nicotinovorans			Levy, et al. 2018
Curtobacterium oceanosedimentum			Levy, et al. 2018
Microbacterium oleivorans			Levy, et al. 2018
Pseudomonas simiae WCS417r			Published in a similar system in Haney, et al. 2015. Strain used developed in Cole, et al. 2017