부동 수경 시스템에서 애기장대 뿌리에 세균 식민지화 및 유지 보수 모니터링

요약

여기에서 우리는 종의 존재를 정량화하고 식물 뿌리의 초기 식민지 동안 다른 성장 환경으로의 전송 후 박테리아의 공간 분포를 시각화하는 수경 식물 성장 분석방법을 설명합니다.

초록

박테리아는 미생물, 더 큰 유기체 및 비생물적 환경을 상호 작용하여 형성된 복잡한 뿌리 구 미생물군유전체를 형성합니다. 실험실 조건 하에서, 식물 성장 촉진 박테리아에 의해 뿌리 구 식민지 (PGPB) 건강 또는 식민지화 되지 않은 식물에 비해 호스트 식물의 개발을 증가 시킬 수 있습니다. 그러나, 필드 설정에서, PGPB와 세균 성 치료 종종 작물에 상당한 혜택을 제공 하지 않습니다. 한 가지 설명은 이것이 식물의 수명 동안 내인성 토양 미생물과의 상호 작용 중에 PGPB의 손실때문일 수 있다는 것입니다. 대부분의 연구는 뿌리 구 지역 사회 내에서 PGPB의 유지 보수보다는 초기 식민지에 초점을 맞추고 있기 때문에이 가능성을 확인하기 가 어려웠습니다. 세균 공동체의 어셈블리, 공존 및 유지보수는 뿌리구 미세 환경의 결정적 특징에 의해 형성되며, 이러한 상호 작용이 네이티브 설정에서 PGPB 생존에 영향을 미칠 수 있다는 가설이 있습니다. 이러한 행동을 연구하기 위해, 수경 식물 성장 분석은 애기장대 탈리아나를 사용하여 식물 뿌리의 초기 식민지화 및 다른 성장으로 이동 한 후 박테리아의 공간 분포를 정량화하고 시각화하도록 최적화됩니다. 환경. 이 시스템의 재현성과 유틸리티는 잘 연구 된 PGPB 슈도모나스 시미아에로검증됩니다. 여러 세균 종의 존재가 식물 뿌리에 식민지 및 유지 보수 역학에 영향을 미칠 수있는 방법을 조사하기 위해, 세 가지 세균 균주에서 모델 커뮤니티 (관절염, Curtobacterium,및 Microbacterium 종) 원래 A. 탈리아나 뿌리 줄기에서 분리된다. 이 다양한 세균 종의 존재는 시퀀싱 기반 의 세균 공동체 연구에 대한 대안을 제공하는이 수경 식물 - maintanence 분석기를 사용하여 측정 할 수 있음을 보여준다. 이 시스템을 사용 하 여 미래 연구 시간이 지남에 따라 및 변화 하는 환경 조건에서 다종 식물 미생물군유전체에서 세균 행동의 이해를 향상 시킬 수 있습니다.

서문

세균 및 곰팡이 질병에 의한 작물 파괴는 식량 생산을저하시키고 심각하게 글로벌 안정성을 방해 할 수 있습니다 1. 억제 토양에 있는 미생물이 식물 건강을 증가시키는 책임있다는 발견에 근거하여 2, 과학자는 식물 microbiome가 특정의 존재 그리고 풍부를 수정해서 식물 성장을 지원하기 위하여 이용될 수 있는지 물었습니다 세균 종³. 식물 성장 또는 개발에 도움이 발견 하는 박테리아는 집합적으로 식물 성장 촉진 박테리아 라고 (PGPB). 최근에는 잠재적인 PGPB를 식별하는 것에서 부터 토양, 뿌리 주변 또는 뿌리줄기(뿌리 표면을 직접 둘러싸고 포함)에서 왕국 간 상호 작용이 PGPB에 영향을 미칠 수 있는 방법을 이해하는 것으로 연구가 전환되었습니다. 활동⁴.

PGPB에 의한 뿌리줄기 식민지화는 식민지화되지 않은 식물에 비해 다양한 스트레스에 반응하여 숙주 식물의 건강 또는 발달을 증가시킬 수^있다5. 그러나, 결과는 종종 밀접하게 제어 온실 및 실험실 설정에서 관찰 된것과 비교하여 네이티브 토양 조건에서 더 많은 변수 6. 이러한 차이에 대한 하나의 가설은 PGPB의 성장 또는 행동이 필드^7,8에서토착 토양 박테리아 또는 곰팡이에 의해 억제될 수 있다는 것이다. 근위대권 박테리아에 의한 유익한 효과는 일반적으로 1) 박테리아의 능력에 따라 달라집니다 1) 뿌리를 찾아 이동, 2) 생물막 형성을 통해 뿌리를 식민지화, 3) 소분자의 생산을 통해 숙주 식물 이나 병원체와 상호 작용 대사 산물^7,9. 이러한 식민지화 동작 중 어느 것이든 인접 미생물^10의존재 및 활성에 의해 영향을 받을 수 있다.

우리는 뿌리 골격의 이러한 뚜렷한 세균 식민지화 단계를 정량화하고시각화하는 시스템을 설계했습니다(그림 1). 이 접근법은 사전 접종 된 묘목을 심는 동안과 같은 새로운 환경으로 식물을 옮긴 후 장기 PGPB 유지 보수가 때때로 관찰되지 않는 이유를 조사하는 연구를 용이하게합니다. 애기장대는 실험실 연구에서의 광범위한 사용뿐만 아니라 미생물 상호작용에 대해 이용 가능한 충분한 데이터로 인해 식물 모델로 선택되었다^11. 시스템에는 3단계가 있습니다: 1) A. 탈리아나 성장, 2) 세균 식민지화 및 3) 세균 유지(도 1참조). A. 탈리아나는 육상 식물이기 때문에 수경 시스템에서 과도한 물 스트레스를 받지 않도록 하는 것이 중요했습니다^12. Haney et al.^13에서사용하는 방법에서 영감을 얻은 모종은 플라스틱 메쉬상에서 재배되어 액체 성장 배지로부터 촬영을 분리합니다. 이 시스템은 식물 숙주들의 건강과 발달을 손상시키는 것으로 보이지 않으며, 액체^11에서 A. 탈리아나 성장을 향상시킨다. 식물 촬영 표면 위에 떠, 뿌리는 완전히 액체 세균 성장 매체에 접종 박테리아에 의해 식민지에 노출. 이 성장에 가장 도움이 되는 영양소에 식민지에 대 한 검사 관심의 박테리아를 허용, 다음 식물의 성장을 지원 하도록 설계 된 영양소 매체에서 성장을 계속 할 수 있도록 조건을 이동 하는 동안. 두 단계 모두 루트^13의무산소증을 방지하기 위해 꾸준한 흔들림을 포함합니다. 박테리아는 식민지 배지 또는 유지 매체로부터의 전달 에 따른 식물 뿌리로부터 가시화 또는 정량화될 수 있다. 이 수경 시스템은 매우 유연하여 실험 조건과 적용 된 응력을 연구자의 관심사에 따라 쉽게 변경할 수 있습니다.

이 설명 된 방법은 식물-미생물 상호 작용에 대 한 문학의 큰 몸의 맥락에서 중요 한 또한 성장 환경 설정에 사용자 지정 되 고 있는 동안 루트 표면에서 이러한 상호 작용을 공부 하기 위한 강력한 시스템을 제공 하기 때문에 다른 박테리아. 식물 생물학 실험실은 종종 고체 한천에 식물 미생물 식민지 화 실험을 수행, 또한 후속 전송 하는 동안 식물의 잠재적으로 파괴적인 조작을 요구 하는 동안 박테리아의 평면 운동 (그 경우)에 대 한 허용. 대조적으로, 미생물학 실험실은 수시로 식물14,^15의해로, 그들의 실험 내의 박테리아의 건강을 우선순위를 정했습니다. 식물-미생물학 중심의 실험실의 이러한 상이한 우선순위는 역사적으로 이들 그룹 들 간의 결과를 비교하는 것을 어렵게 만들었는데, 이는 각 그룹이 전형적으로 관심 있는 유기체를 최적화하기 위해 실험 조건을 최적화하기 때문이다^15. 여기에 설명된 플로팅-메쉬-식물-성장 시스템은 이전 미생물학 지향 연구에서 주목할 만한 이점인 전체 식물 침수를 방지하는 동시에 일시적으로 박테리아의 성장과 생존을 최적화하여 식민지화를 용이하게 합니다. 따라서, 우리가 여기에 제시하는 분석은 미생물학자의 기준을 만족시키면서 (식물의 과잉 수화 및 촉각 조작에 대한) 두 식물 생물학자의 우려를 해결할 수 있습니다 (다른 세균 성장 조건 및 다중 허용) 종 '상호 작용)⁷. 이 프로토콜은 다양한 박테리아, 식물 및 환경 조건에 맞게 조정할 수 있도록 설계되었습니다.

프로토콜

참고: 실험 설정은 명확성을 위해 설명되며 이 보고서에 포함된 대표적인 결과를 생성하는 데 사용되지만 조건은 원하는 대로 수정할 수 있습니다. 모든 단계는 PPE를 사용 하 여 수행 해야 하 고 안전에 대 한 기관 및 연방 reccomations 다음, 사용 하는 박테리아의 BSL 상태에 따라.

1. 박테리아의 특성화

1. 성장 매체 한천 판에 박테리아의 형태를 결정합니다. 대략적인 OD₆₀₀ = 0.5에서 세포를 재중단하고 1 μL 부피를 한천 배지상에 플레이트하여 선택의 폭을 다한다. 한천 접시에 X-gal을 추가하여 20 mg/mL의 최종 농도로 특정 세균 커뮤니티의 개별 구성원을 더 잘 구별하십시오. 식민지가 형성 될 때까지 24 °C 또는 30 °C에서 성장한 다음 식민지 형태에 대한 사진과 메모를 찍습니다.
2. 각 박테리아 균주의 광학 밀도와 mL^16당CFU(콜로니 형성 단위) 수 간의 상관 관계를 정의합니다. 대략적인 OD₆₀₀ = 5에 24 웰 플레이트에 1 mL의 물에 박테리아를 다시 중단하고, 2 중일 직렬 희석을 수행하고, 모든 희석물의 OD_600을 모니터링하고, 각 플레이트를 플레이트하여 다중 광학 밀도에서 각 샘플에서 실행 가능한 CFU/mL을 결정합니다.
3. 각 세균 균주에 대한 최대 초음파 처리 허용 오차를 결정합니다. 이렇게 하려면, 액체 배지를 포함하는 24웰 플레이트에 세포 세포를, 일부 세포를 소음되지 않은 대조군 샘플로 예약하였다. 24 팁 혼 부착이있는 초음파 를 사용하여 2 s 펄스로 40 암페어에서 12 초의 초음파 처리 3 라운드를 적용하십시오.
   참고 : 24 웰 초음파 의 사용은 처리 공장 샘플의 다운 스트림 멀티 플렉싱을 용이하게하는 것이 좋습니다,하지만 하나를 사용할 수없는 경우, 마이크로 팁장착 초음파를 사용하고 독립적으로 각 샘플 초음파처리를 수행한다. 항상 25 NRR 보호 등급의 귀덮개를 착용하십시오.
4. 초음파 처리 및 소음 되지 않은 샘플의 10 배 직렬 희석을 수행하고 한천 플레이트에 자리. 초음파 처리 후 생존 가능한 세포의 감소가 있는지 여부를 결정합니다. 그렇다면, 치료가 최종 CFU/mL^17에영향을 미치지 않는 때까지 감소된 총 초음파 처리 시간 또는 진폭을 사용하여 신선한 샘플을 사용하고 초음파 처리 단계를 반복한다.

2. 플라스틱 메쉬에 애기장대 모종의 준비

1. 표준 구멍 펀처를 사용하여 플라스틱 메시의 디스크를 작성합니다.
   1. 알루미늄 호일의 느슨한 커버가 있는 유리 용기에 디스크를 수집하고, 20분 건조 사이클^13로설정된 오토클레이브를 사용하여 살균한다.
   2. 화염 멸균 핀셋을 사용하여 식물 성장-중간 한천 플레이트의 표면을 가로질러 약 40개의 멸균 된 메쉬 디스크를 단일 레이어에 배포합니다. 0.5x 무라시게와 스쿠그 (MS) 소금을 사용, 포함 500 MES 버퍼의 mg/L [2-(N-morpholino)에탄술포산] 및 1.5% 바토 한천, 식물 성장 매체로, 와 함께 50 μg / mL 베노밀모의 제한 곰팡이 오염에 추가.
2. 앞에서 설명한 대로 A. 탈리아나의 축씨앗을 준비한다^17.
   1. 각각 약 100-300개의 씨앗을 랙에 개별 원심분리기 튜브에 넣고 재밀봉 가능한 유리 또는 무거운 플라스틱 용기("항아리")에 연기 후드에 넣습니다.
   2. 주의를 기울여 100 mL의 표백제를 항아리에 넣고 표백제에 농축 된 HCl 3 mL을 넣고 즉시 항아리를 밀봉하고 연기가 적어도 4 시간 동안 씨앗을 살균 할 수 있도록하십시오.
   3. 조심스럽게 항아리 아래에서 살균 된 씨앗의 튜브를 제거하고 밀봉하십시오.
3. 각 메시의 중앙에 두 개의 시드를 배치합니다. 수술 용 테이프로 접시를 밀봉하고 4 °C에서 2-6 일 동안 배양하여 씨앗을 버너리화합니다.
4. 모종을 발아시키고 성장시키기 위해, 짧은 일 설정하에서 8-10 일 동안 식물 성장 챔버에 플레이트 한천 면을 내려 놓습니다 : 21 °C에서 9 h의 빛과 18 °C에서 15 h의 어두운 (그림1, 단계 2).

3. 액체 세균 성장 매체에 있는 식물의 식민지

1. 배지 전용 대조군 웰을 제외한 멸균 된 24 웰 플레이트의 각 웰에 1 mL의 세균 성장 배지를 추가하십시오. 레녹스 루리아 국물 (트립톤 10g, 효모 추출물 5 g, NaCl 5 g)을 박테리아 성장 배지로 사용하십시오.
2. 한천 판에서 메쉬에 내장된 발아 모종을 액체로 옮니다(그림1, 단계 3a).
   1. 발아된 두 개의 모종을 함유한 메쉬를 화염 살균 집게를 사용하여 한천 판위아래로 부드럽게 벗깁니다. 크기가 동일하고 손상되지 않은 모종으로 메시를 선택합니다.
   2. 한천에서 제거가 매끄럽지 않으면 메쉬와 식물을 버리십시오. 세균 성장 액의 각 우물에 하나의 플로트, 루트 측면을 아래로 이동 합니다.
3. 부동 묘목을 포함하는 우물에 박테리아를 접종.
   1. 한천 접시에 하룻밤 재배된 박테리아를 세균 성장 배지 액체에서 10⁸ CFU/mL에 해당하는 OD_600으로 재중단합니다. 10 μL의 세균 현탁액을 각 우물에 추가하여 웰 당 10⁶ CFU 박테리아의 최종 농도를 위해.
   2. 박테리아의 혼합을 준비하는 경우, 10⁸ CFU /mL에 해당하는 OD_600에 각각 다시 중단하고, 동일한 비율로 혼합하고, 액체의 웰 당 최종 혼합물의 10 μL을 추가합니다.
4. 멸균 성장을 위해 플레이트를 밀봉합니다. 끈적끈적한 면을 건드리지 않고 플레이트를 가로질러 가스 투과성 필름을 조심스럽게 누릅니다. 각 우물은 우물에 의해 만들어진 각 고리 주위에 압력을 가하여 개별적으로 밀봉되었는지 확인하십시오. 플레이트의 플라스틱 뚜껑을 플레이트와 가스 투과필름 위에 꼭 두르고 교체합니다(그림1, 단계 3b).
5. 식물 성장 챔버에서 18 시간 동안 플레이트를 배양하고, 모종과 동일한 조건하에서 원래 발아되었지만, 220 rpm으로 설정된 궤도 플레이트 셰이커를 제외하고.

4. 세균 식민지의 유지 보수

1. 모든 수레(메쉬에 있는 식물)를 헹구려면 새로운 24웰 플레이트의 우물에 멸균 수 1mL를 추가합니다. 가스 투과필름을 제거합니다. 멸균 집게를 사용하여 물과 함께 우물로 수레를 옮니다 (그림1, 단계 4a). 교반없이 실온 (RT)에서 10 분 동안 쉬면서 헹구십시오.
   참고: 시간이 지남에 따라 식민지를 유지하는 능력보다는 뿌리의 세균 식민지 화 효율을 결정하기 위해 식물은 5.1 단계로 직접 복용하여이 단계에서 희생 될 수 있습니다.
2. 식물 성장 매체의 1 mL로 새로운 24 웰 플레이트의 우물을 채웁니다. 하나의 메시를 각 웰로 전송합니다. 가스 투과성 씰로 덮고 식물 성장 챔버에서 220 rpm에서 궤도 플레이트 셰이커상에 72 시간 동안 배양합니다 (그림1, 단계 4b).
3. 72 시간 잠복기 후 수레와 단계 4.1에서 수행된 바와 같이 헹포를 반복한다.

5. 가능한 세포 수에 대 한 박테리아의 컬렉션

참고 : 모종 뿌리 당 박테리아의 수는 모든 인큐베이션 시점에서 결정 될 수있다. 식민지는 0 시간에서 18 시간 사이에서 감시될 수 있고, 유지 보수는 18 시간 에서 부터 감시될 수 있습니다. 이미징을 위해 향하는 식물은 섹션 6으로 직접 진행할 수 있습니다.

1. 메시에서 모종을 제거합니다(그림1, 단계 5). 잎 아래에 화염 멸균 포셉을 부드럽게 놓고 (그러나 메쉬의 잎 쪽에), 가볍게 줄기를 꼬집습니다. 모종을 메쉬에서 위아래로 흔들어 서 뿌리가 깨지지 않고 빼내립니다. 루트가 끊어지면 메쉬 바닥을 부드럽게 긁어 전체 길이를 수집합니다.
2. 식물 뿌리에서 박테리아를 제거합니다. 박테리아를 ddH₂0의 1 mL을 포함하는 24 웰 플레이트의 우물로 옮김을 옮김. 1.3단계에서 설명한 바와 같이 샘플을 초음파 처리한다.
   참고 : 현미경을 사용하여 초음파 처리 된 샘플의 뿌리 표면에 남아있는 박테리아를 찾습니다. 박테리아가 남아있는 경우, 박테리아가 결합 되지 않을 때까지 총 초음파 처리 시간 또는 강도를 증가, 섹션 1에서 결정 으로 실행 가능한 세포 수에 영향을 주지 않는 초음파의 가장 높은 수준까지.
3. 뿌리에 박테리아를 정량화.
   1. 세균 성장 배지에서 초음파 처리된 샘플의 직렬 10배 희석을 최대 10-6 희석을 수행합니다. 개별 한천 접시에 각 희석50 μL을 넣고 멸균 유리 구슬(또는 세균 성 스프레더)으로 펴서 발라주면 됩니다. 개별 식민지가 계산 될 때까지 박테리아에 대한 최적의 온도에서 접시를 배양.
   2. 일단 구별되면, 각 식민지 형태 (섹션 1에서 결정됨)의 수를 계산하고 모종 당 각 박테리아 종의 CFU를 계산합니다. 식민지 또는 유지 보수 중 오염이 세균의 존재에 영향을 미칠 수 있기 때문에 오염을 보여주는 모든 샘플을 폐기하십시오.

6. 현미경 검사법에 대한 그대로 식물 뿌리의 수집

1. 집게를 사용하여 섹션 5에서와 같이 메시에서 모종을 제거합니다.
2. 현미경 슬라이드에 각 식물을 전송합니다.
   1. 슬라이드에 루트의 끝을 놓고 끝에서 멀리 드래그하여 슬라이드로 플러시된 촬영을 설정하여 최상의 이미징을 위해 곧게 펴진 루트를 확인합니다. 샘플에 물 또는 멸균 식물 성장 배지를 떨어뜨려 커버슬립과 슬라이드 사이의 인터페이스에 수분을 공급합니다.
   2. 루트 크라운 바로 위에 유리 커버 슬립을 놓습니다 (그림 1의 맨 위 박스 영역) 및 촬영 잎 아래에 커버 슬립의 기울어짐을 피하기 위해 (루트 크라운 이미징을 허용) 부드럽게^17을누릅니다.
3. 형광성 박테리아를 사용하는 경우, 적절한 여기/방출 필터를 사용하여 박테리아를 서로 분화하고 식물 뿌리^18을구별하는 이미지.

결과

잘 특징지어진 PGPB P. simiae WCS417r는 수경 재배 배양에서 A. 탈리아나의 뿌리를 식민지화하는 것으로 알려져 있다. 이 자연적으로 형광 박테리아는 쉽게 식민지 다음 모종의 뿌리에 현미경 검사를 사용하여시각화 할 수 있습니다 (그림 2). 이 A. 탈리아나 모종의 전체 길이를 이미지 할 수 있지만 (4-6 mm 길이) 뿌리, 많은 식물에 대해 ?...

토론

모든 환경에서 식물은 다른 박테리아와 곰팡이의수백만에 수천 상호 작용 5,⁷. 이러한 상호 작용 은 작물 수확량 과 식품 생산에 잠재적 인 영향과 함께, 식물 건강에 부정적인 긍정적 인 영향을 미칠 수 있습니다. 최근 연구는 또한 PGPBs에 의한 작물의 가변 식민지화가 현장 실험^22에서예측할 수없는 식물 크기와 작물 수확량을 설명 할 ...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Required Materials
1.5 mL eppendorf tubes	any	N/A
24-well plates	BD Falcon	1801343
Aeraseal	Excel Scientific	BE255A2
Autoclave	any	N/A
Bacteria of Interest	any	N/A	Stored at -80?C in 40% glycerol preferred
BactoAgar	BD	2306428; REF 214010
bleach	any	N/A
Conviron	any	N/A	Short Day Light-Dark Cycles: 460-600 µmoles/m²/s set at 9/15 hours light/dark at 18/21?C, with inner power outlet
Dessicator Jar: glass or heavy plastic	any	N/A
Ethanol	any	N/A
Flame	any	N/A
Forceps	any	N/A
Incubator	any	N/A	At optimal temperature for growth of specified bacteria
Hydrochloric Acid	any	N/A
Lennox LB Broth	RPI	L24066-1000.0
Microcentrifuge	any	N/A
Micropipetters	any	N/A	Volumes 5 µL to 1000 µL
Microscope (preferably fluorescence)	any	N/A	Could be light if best definition not important
MS Salts + MES	RPI	M70300-50.0
Orbital Plate Shaker	any	N/A	Capable of running at 220 rpm for at least 96 hours
Petri Dishes	any	N/A	50 mL total volume
Reservoirs	any	N/A
Spectrophotometer	any	N/A
Standard Hole Punch	any	N/A	Approximately 7mm punch diameter
Sterile water	any	N/A
Surgical Tape	3M	MMM1538-1
Teflon Mesh	McMaster-Carr	1100t41
Ultrasonicator	any	N/A
Vortex Mixer	any	N/A
X-gal	GoldBio	x4281c	other vendors available
Suggested Materials
24 Prong Ultrasonicator attachment	any	N/A	For sonicating multiple samples at once. Can be done individually
Alumaseal II	Excel Scientific	FE124F
Glass beads	any	N/A
Multipetter/Repetter	any	N/A
Sterile 96-well plates	any	N/A	For serial dilutions. Can be replaced by eppendorf tubes
Biological Materials Used
Arabidopsis thaliana seeds	any	N/A	We recommend Arabidopsis Biological Resource Center for seed stocks
Arthrobacter nicotinovorans			Levy, et al. 2018
Curtobacterium oceanosedimentum			Levy, et al. 2018
Microbacterium oleivorans			Levy, et al. 2018
Pseudomonas simiae WCS417r			Published in a similar system in Haney, et al. 2015. Strain used developed in Cole, et al. 2017