在浮动水培系统中监测阿拉伯菌的殖民化与维护

摘要

在这里,我们描述了一种水培植物生长测定,用于量化物种存在,并可视化细菌在植物根系初始殖民化期间和转移到不同生长环境后的空间分布。

摘要

细菌形成复杂的根系层微生物群落,由相互作用的微生物、较大的生物体和非生物环境形成。在实验室条件下,植物生长促进细菌(PGPB)的根圈殖民化可以相对于非殖民化植物增加宿主植物的健康或发育。然而,在田间环境中,使用PGPB进行细菌处理通常不会给作物带来实质性的好处。一种解释是,这可能是由于在植物寿命期间与内源性土壤微生物相互作用时PGPB的丧失。这种可能性一直难以证实,因为大多数研究侧重于最初的殖民化,而不是根圈社区内PGPB的维持。这里假设细菌群落的组装、共存和维护是由根生圈微环境的确定性特征决定的,这些相互作用可能会影响PGPB在原生环境中的生存。为了研究这些行为,使用阿拉伯植物生长测定对水培植物生长测定进行了优化,以量化和可视化植物根系初始殖民化和转移到不同生长后的细菌空间分布环境。该系统的可重复性和实用性,然后验证与精心研究的PGPB伪多尼纳斯模拟。研究多种细菌物种的存在如何影响植物根系的殖民化和维护动力学,三种细菌菌株(一种阿尔氏杆菌、柯氏杆菌和微细菌)的模型群落物种)最初与A.thaliana根生球分离的构造。研究表明,这些不同的细菌物种的存在可以通过这种水培植物主量测定来测量,这为基于测序的细菌群落研究提供了替代方案。将来使用该系统的研究可以增进对多物种植物微生物群落中细菌行为的了解,以及随时间变化的环境条件。

引言

细菌和真菌疾病造成的作物破坏会导致粮食产量下降,并可能严重破坏全球稳定1。基于抑制土壤中的微生物对植物健康增加的发现2,科学家们询问植物微生物群落是否可以通过改变植物的存在和丰度来支持植物的生长。细菌种类3。发现有助于植物生长或发育的细菌统称为植物生长促进细菌 (PGPB)。最近,研究已从简单地识别潜在的PGPB转向了解土壤、根部周围或根圈(直接围绕和包括根表面的区域)的王国间相互作用如何影响PGPB活动⁴.

PGPB的根圈殖民化可以增加宿主植物的健康或发育,以应对相对于非殖民化植物的不同压力5。然而,结果在原生土壤条件下往往比在严格控制的温室和实验室环境中观察到的结果多^变。这种差异的一个假设是,PGPB的生长或行为可能被原生土壤细菌或真菌在田地7,8抑制。根圈细菌的有益作用通常取决于细菌1)定位和向根部移动的能力,2)通过生物膜形成殖民根部,3)通过生产小分子与宿主植物或病原体相互作用代谢物^7,9。任何这些殖民行为都可能受到邻近^微生物10的存在和活动的影响。

我们设计了一个系统来量化和可视化根生球的这些独特的细菌殖民化阶段(图1)。这种方法将有助于研究为什么在植物转移到新环境(如接种前幼苗种植期间)后,有时无法观察到长期的PGPB维持。阿拉伯植物被选作植物模型,因为它在实验室研究中的广泛应用,以及关于其微生物相互作用的充分^数据11。系统中有三个阶段:1) A. thaliana生长,2) 细菌殖民化,和 3) 细菌维护(参见图 1)。由于A.thaliana是陆地植物,因此必须确保它在水培^系统12中不会遭受不必要的水压。受Haney^等人13年使用的方法的启发,幼苗在塑料网中生长,将芽与液体生长介质分离。该系统似乎不会损害植物宿主的健康和发展,它提高了^液体11的A.thaliana生长。当植物芽漂浮在表面之上时,根部完全暴露在细菌的殖民化中,这些细菌被接种到液体细菌生长培养基中。这允许对感兴趣的细菌进行殖民化,以在最有利于生长的营养物质中殖民化,然后改变条件,使植物在营养介质中继续生长,以支持其生长。两个阶段包括稳定摇动,以防止^根13的缺氧。细菌可以从从殖民化介质或维护介质转移后从植物根进行可视化或量化。这种水培系统非常灵活,允许实验条件和应用应力根据研究人员的兴趣轻松改变。

在关于植物-微生物相互作用的文献中,这种描述的方法非常重要,因为它提供了一个强大的系统,用于研究根表面的这些相互作用,同时还可以根据植物-微生物的生长偏好进行定制。不同的细菌。植物生物学实验室经常在固体琼脂上进行植物微生物殖民化实验,只允许细菌的平面运动(如果是的话),同时要求在随后转移过程中对植物进行潜在的破坏性操作。相比之下,微生物实验室经常在实验中优先考虑细菌的健康,这不利于植物14、15。以植物和微生物为重点的实验室的这些不同优先级历来使得很难比较这些组之间的结果,因为每个组通常优化实验条件以优化其感兴趣的生物^体。此处描述的浮网-植物生长系统可防止植物完全浸没,这是以往以微生物学为导向的研究的显著优势,同时还暂时优化了细菌的生长和存活,以促进殖民化。因此,我们在这里的测定可以解决植物生物学家的担忧(关于植物的过度水分和触觉操纵),同时满足微生物学家的标准(允许不同的细菌生长条件和多重物种的相互作用)⁷.该协议旨在适应各种细菌、植物和环境条件。

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研究方案

注: 为了清楚起见,实验设置被描述,并用于生成本报告中包含的代表性结果,但条件可以根据需要修改。所有步骤都应使用 PPE 执行,并遵循机构及联邦安全建议,根据所用细菌的 BSL 状态。

1. 细菌特征

1. 确定生长培养基琼脂板上细菌的形态。在近似 OD₆₀₀ = 0.5 处重新悬浮细胞,并将 1 μL 体积板到选择的琼脂培养基上。将X-gal添加到琼脂板中,最终浓度为20mg/mL,以更好地区分特定细菌群落的个体成员。在24°C或30°C生长,直到菌落形成,然后拍摄殖民地形态的照片和笔记。
2. 定义每个细菌菌株的光密度与每mL¹⁶的CFU(菌群形成单位)数之间的相关性。将细菌在 24 孔板中的 1 mL 水中重新悬浮到大约 OD₆₀₀ = 5,执行双倍串行稀释,监控所有稀释的 OD_600,并各板确定每个样品中具有多种光学密度的可行 CFU/mL。
3. 确定每种细菌菌株的最大声波耐受性。为此,将等分细胞放入含有液体介质的24孔板中,将一些细胞保留为无音速控制样本。使用带有 24 尖喇叭附件的超声波器,在 40 安培下应用三轮 12 秒的声波,并带有 2 秒脉冲。
   注:建议使用24井超声波器,以方便加工厂样品的下游多路复用,但如果没有,请使用装有微尖的超声波器,并独立执行每个样品的声波。始终佩戴额定值至少为 25 NRR 保护的耳罩。
4. 对声波和非音速样品进行10倍连续稀释,并点在琼脂板上。确定声波后活细胞是否减少。如果是这样,使用新鲜的样品和重复的声波步骤,使用减少的总声波时间或振幅,直到处理对最终的CFU/mL¹⁷没有影响。

2. 在塑料网上制备阿拉伯树苗

1. 使用标准打孔机创建塑料网的磁盘。
   1. 收集玻璃容器中的磁盘,铝箔的松散盖,并使用高压灭菌器设置为20分钟干^周期13消毒。
   2. 使用火焰消毒钳子,在植物生长培养基琼脂板表面的单个层中分配大约 40 个灭菌网盘。使用0.5x Murashige和Skoog(MS)盐,含有500毫克/升的MES缓冲液[2-(N-变形)酸]和1.5%的巴托琼脂,作为植物生长介质,在苗木的限量真菌污染中加入50微克/mL的诺美尔。
2. 准备阿塔利亚纳的斧头种子,如前所述17。
   1. 将大约 100-300 个种子放入机架中的单个离心管中,放入可重新密封的玻璃或重型塑料容器("jar")中的烟机罩中。
   2. 小心,将100 mL的漂白剂放入罐中,在漂白剂中加入3 mL浓缩HCl,并立即密封罐子,让烟雾对种子进行至少4小时的消毒。
   3. 小心地从罐子下面取出消毒种子管并密封。
3. 将两个种子放在每个网格的中心。用胶带密封板,在黑暗中4°C孵育2~6天,使种子幼虫化。
4. 为了发芽和生长幼苗,在短日设置下,将板琼脂侧放在植物生长室中8~10天:在21°C下9小时,在18°C下变暗15小时(图1,步骤2)。

3. 液体细菌生长培养基中植物的殖民化

1. 在无菌24孔板的每口孔中加入1mL的细菌生长培养基,但仅培养基控制孔除外。使用Lennox Luria Broth(10克胰腺酮,5克酵母提取物,5克NaCl)作为细菌生长培养基。
2. 将嵌入在网中的发芽幼苗从琼脂板转移到液体(图1,步骤3a)。
   1. 使用火焰消毒钳子轻轻剥去含有两个发芽幼苗的网眼。选择具有大小相等且未损坏的幼苗的网格。
   2. 如果从琼脂上去除不光滑,丢弃该网格和植物。将一个浮子转移到每个细菌生长液的井,根侧向下。
3. 将细菌接种到含有漂浮幼苗的井中。
   1. 将一夜之间生长在琼脂板上的细菌重新悬浮到OD_600,相当于细菌生长介质液体中的10⁸ CFU/mL。在每个井中加入10μL的细菌悬浮液,每口井的最终浓度为10⁶ CFU细菌。
   2. 如果制备混合细菌,将每个细菌重新悬浮到相当于 10⁸ CFU/mL 的 OD_600,以相等的比例混合,并为每个液体井添加 10 μL 的最终混合物。
4. 密封板进行无菌生长。在不接触粘性一侧的情况下,小心地将透气膜压过板。通过在井上制作的每个环周围施加压力,确保每口井都单独密封。将板的塑料盖紧贴在板和透气膜上(图 1,步骤 3b)。
5. 在植物生长室中孵育板18小时,其条件与幼苗最初发芽的相同,但设定为220rpm的轨道板摇床除外。

4. 维持细菌殖民化

1. 要冲洗所有浮子(网状植物),在新的 24 孔板的井中加入 1 mL 的无菌水。去除透气膜。使用无菌钳子,将浮子转移到带水的井中(图1,步骤4a)。在室温 (RT) 下静息 10 分钟,无搅拌冲洗。
   注:为了确定根系的细菌殖民化效率,而不是它们随时间保持殖民化的能力,在此步骤中,可以通过直接将植物带到步骤5.1来牺牲它们。
2. 用1mL的植物生长介质填充新的24孔板的井。将一个网格转移到每个井。盖上透气密封,在植物生长室中以 220 rpm 的转速在轨道板摇床上孵育 72 小时(图 1,步骤 4b)。
3. 在 72 h 潜伏期后,对浮子重复步骤 4.1 中执行的漂泊。

5. 收集细菌以进行可行的细胞计数

注:可在任何孵育时间点确定每个幼苗根的细菌数量。殖民化可在 0 小时到 18 小时之间进行监控,而维护可以从 18 小时起进行监控。用于成像的植物可以直接进行到第6节。

1. 从网格中取出幼苗(图1,步骤5)。轻轻地将火焰消毒的钳子放在叶子下方(但在网眼的叶子侧),轻轻捏紧茎。将幼苗向上摆动并远离网格,使其在不折断根部的情况下脱落。如果根部断裂,轻轻刮掉网格底部以收集全长。
2. 从植物根部清除细菌。将细菌转移到含有 1 mL ddH₂0 的 24 孔板的孔中。如步骤 1.3 所述,对样品进行声波测试。
   注:使用显微镜,在声波样品的根表面上寻找任何残留的细菌。如果细菌仍然存在,增加总声波时间或强度,直到没有细菌保持结合,达到不影响第1节确定的活细胞计数的最高水平。
3. 量化根上的细菌。
   1. 在细菌生长培养基中连续对声波样品进行10倍稀释,达到10-6倍稀释。将每个稀释剂的50μL添加到单个琼脂板中,然后用无菌玻璃珠(或细菌扩散剂)传播。在细菌的最佳温度下孵育板,直到单个菌落可计数。
   2. 一旦可区分,计算每个菌落形态的数量(如第1节确定),并计算每个幼苗的每个细菌物种的CFU。丢弃任何显示污染的样品,因为殖民化或维护期间的污染可能会影响细菌的存在。

6. 收集完整的植物根,用于显微镜

1. 使用钳子,如第 5 节所述,从网格中取出幼苗。
2. 将每个工厂转移到显微镜幻灯片上。
   1. 将根尖放在幻灯片上,然后从尖端拖动,使拍摄与幻灯片齐平,确保根部拉直,以便进行最佳成像。在样品中加入一滴水或无菌植物生长培养基,以水合盖唇和滑片之间的界面。
   2. 将玻璃盖玻片放在根冠正上方(图1中最上面的盒装区域)和芽叶下方,以避免盖玻片倾斜(允许根冠成像),然后轻轻按^压17。
3. 如果使用荧光细菌,图像使用适当的激发/发射过滤器来区分细菌彼此和植物^根18。

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结果

著名的PGPB P. simiae WCS417r已知在水培文化中殖民A.thaliana的根。 这种天然荧光细菌在殖民化后可以很容易地使用显微镜在幼苗的根上进行可视化(图2)。虽然可以成像这些A.thaliana幼苗的全长(4⁄6毫米长度)根,这样做的许多植物将需要一段令人望而生畏的时间。由于不同时点和细菌物种的大多数变异可以通过成像^根14?...

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讨论

所有环境中的植物与数千到数百万种不同的细菌和真菌^{相互作用5,7。}这些相互作用可能对植物健康产生消极和积极的影响,对作物产量和粮食生产有潜在影响。最近的工作还表明,在田间试验中,PGPB对作物的可变殖民化可能是不可预测的植物规模和作物产量^的原因。了解这些相互作用背后的机制可能使我们能够直接操纵植物相关的微生物?...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Required Materials
1.5 mL eppendorf tubes	any	N/A
24-well plates	BD Falcon	1801343
Aeraseal	Excel Scientific	BE255A2
Autoclave	any	N/A
Bacteria of Interest	any	N/A	Stored at -80?C in 40% glycerol preferred
BactoAgar	BD	2306428; REF 214010
bleach	any	N/A
Conviron	any	N/A	Short Day Light-Dark Cycles: 460-600 µmoles/m²/s set at 9/15 hours light/dark at 18/21?C, with inner power outlet
Dessicator Jar: glass or heavy plastic	any	N/A
Ethanol	any	N/A
Flame	any	N/A
Forceps	any	N/A
Incubator	any	N/A	At optimal temperature for growth of specified bacteria
Hydrochloric Acid	any	N/A
Lennox LB Broth	RPI	L24066-1000.0
Microcentrifuge	any	N/A
Micropipetters	any	N/A	Volumes 5 µL to 1000 µL
Microscope (preferably fluorescence)	any	N/A	Could be light if best definition not important
MS Salts + MES	RPI	M70300-50.0
Orbital Plate Shaker	any	N/A	Capable of running at 220 rpm for at least 96 hours
Petri Dishes	any	N/A	50 mL total volume
Reservoirs	any	N/A
Spectrophotometer	any	N/A
Standard Hole Punch	any	N/A	Approximately 7mm punch diameter
Sterile water	any	N/A
Surgical Tape	3M	MMM1538-1
Teflon Mesh	McMaster-Carr	1100t41
Ultrasonicator	any	N/A
Vortex Mixer	any	N/A
X-gal	GoldBio	x4281c	other vendors available
Suggested Materials
24 Prong Ultrasonicator attachment	any	N/A	For sonicating multiple samples at once. Can be done individually
Alumaseal II	Excel Scientific	FE124F
Glass beads	any	N/A
Multipetter/Repetter	any	N/A
Sterile 96-well plates	any	N/A	For serial dilutions. Can be replaced by eppendorf tubes
Biological Materials Used
Arabidopsis thaliana seeds	any	N/A	We recommend Arabidopsis Biological Resource Center for seed stocks
Arthrobacter nicotinovorans			Levy, et al. 2018
Curtobacterium oceanosedimentum			Levy, et al. 2018
Microbacterium oleivorans			Levy, et al. 2018
Pseudomonas simiae WCS417r			Published in a similar system in Haney, et al. 2015. Strain used developed in Cole, et al. 2017