JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

الهدف من هذا البروتوكول هو إظهار كيفيه تحميل CFDA إلى مواقع مختلفه من الأجزاء السفلية من Arabidopsis. ثم نقدم نمط التوزيع الناتج من CF في البراعم.

Abstract

وقد تم تطبيق الراسم symplastic 5 (6)-كاربوكسيفلوريسسين دياسيتات (cfda) علي نطاق واسع في النباتات الحية لإثبات الاتصال بين الخلوية ، لحاء النقل والاوعيه الدموية زخرفه. يظهر هذا البروتوكول حركه كاربوكسيفلوريسسين (CF) من أسفل إلى اعلي في Arabidopsis باستخدام قطع الجذر والاجراء سويق-معسر علي التوالي. ينتج هذا اثنان إجراءات مختلفه في فعاليه مختلفه من [سف] حركه: حوالي 91% مظهر من [سف] في اليقذف مع ال [سويق-معسر] اجراء, حيث ان فقط حوالي 70% مظهر من [سف] مع ال [رو-بتر] اجراء. تغيير بسيط من مواقع التحميل ، مما ادي إلى تغييرات كبيره في كفاءه المحمول من هذه الصبغة symplastic ، يوحي حركه CF قد تكون خاضعه للتنظيم symplastic ، علي الأرجح من قبل تقاطع سويق الجذر.

Introduction

العديد من القصبات الفلورية مع مجموعه من الخصائص الطيفية ، مثل 5 (6)-كاربوكسيفلوريسسين (CF)1، 8-هيدروكسي برينيه-1 ، 3 ، 6-ثلاثي الفوسفات حمض2، إبليس الأصفر CH (lych)3، esculin و cter4، وقد وضعت و تطبيقها في النباتات لمراقبه حركه symplastic والنشاط لحاء. عموما ، يتم تحميل صبغه symplastic إلى قطع في الانسجه المستهدفة والتشتت متسلسلة من مراسل في أجزاء أخرى من النبات سوف تظهر الاتصالات بين الخلايا. علي الرغم من ان اليه امتصاص الصبغة غير مفهومه تماما ، فقد تم الاعتراف علي نطاق واسع بالمبدا الكامن وراء حركه CF داخل الخلايا الحية. شكل استر من CF (CF diacetate ، CFDA) غير فلوري ، ولكن غشاء نفاذيه. يسمح هذا خاصيه انتشار سريعة غشاء من الصبغ داخل خلايا. مره واحده داخل الخلايا الحية ، استراسيس في الخلايا أزاله مجموعات خلات في 3 ' و 6 ' موقف CFDA ، والإفراج عن CF وغشاء-غير نفاذه (الشكل 1، بدلا من ذلك الرجوع رايت وآخرون2) ؛ CF يمكن بعد ذلك التحرك من خلال الهيوليه إلى أجزاء أخرى من النباتات.

وهناك اجراء راسخ مع cfda هو انه يمكن تحميله في أوراق المصدر وتستخدم لمراقبه تدفق لحاء و لحاء تفريغ في الانسجه بالوعة من العديد من الأنواع ، علي سبيل المثال ، كما CF التفريغ في Arabidopsis الجذر5، لحاء تفريغ خلال البطاطا الدرني6، لحاء تفريغ في بالوعة نيكوتيانا يترك7، وهلم جرا. من خلال نهج التحميل مماثله ، اعتمدت دراسات أخرى هذه الصبغة لإثبات الاتصال symplastic بين المضيف والطفيلي8،9، أو للكشف عن العلاقات التكافلية10،11.

طريقه أخرى للاستفادة من هذه الصبغة هي لتحميلها في خلايا معينه أو خليه واحده عن طريق الحقن المجهري لتحديد نمط التوزيع الخاص به. وقد سهلت هذه التقنيات المتطورة إلى حد كبير فهمنا أعمق من الاتصالات الخلوية بوساطة plasmodesmata, لا سيما في تطوير مفهوم المجال symplastic12,13. علي سبيل المثال, الحقن المجهري لل cfda في الخلايا كوتيليدون من Arabidopsis أسفرت عن نمط اقتران صبغ في البشرة السويقه ولكن غير اقتران في الخلايا الاساسيه أو في البشرة الجذر, التالي فان البشرة السويقه تشكل symplastic المجال14. المجالات المماثلة ، مثل الخلايا الحرس المعدة15، غربال عنصر-رفيق الخلايا16، وخلايا الشعر الجذر14 والجذر كاب17، وقدتم تحديد18 من قبل تقنيه الحقن المجهري. والأكثر دهشة ان بعض المجالات تسمح لجزيئات التتبع بالتحرك في اتجاه معين. اتخاذ المجال [تريشم] علي سبيل المثال ، الحقن المجهري لمسبار الفلورسنت في خليه دعم البشرة يؤدي إلى تدفق المقتفي في مجال [تريشم] ، ومع ذلك ، لا يحمل الحقن العكسي صحيح19. وقد وجد تقرير صدر مؤخرا أيضا حالات مماثله في المجالات symplastic من الجنين Sedum 20. التالي ، فان جميع الحالات المذكورة أعلاه تعني ان مبادله مواقع التحميل قد تؤدي إلى رؤى جديده في الاتصالات البلاستيكية. تجربتنا السابقة تهدف إلى تشريح الطريق من الجذر إلى تبادل لإطلاق النار المحمول إسكات التعرف علي المجال الجديد symplastic ، أو HEJ (تقاطع سويق-ابيتوسيل) ، والتي تم التحقق كذلك من خلال تحميل الجذر (غير المتعارف عليها بالوعة التحميل) CFDA تجربه21. هنا ، ونحن أيضا وضع الجذر إلى تبادل لإطلاق النار CF الحركة باستخدام طريقه بسيطه واستعاده مجال symplastic المحتملة عن طريق تحويل مواقع التحميل. وعلاوة علي ذلك ، يمكن تكييف هذا الاجراء للتمييز بين الخلفيات الوراثية التي غيرت النقل البري البري إلى التصوير لمسافات طويلة.

Protocol

1. Arabidopsis النمو الراسي في MS المتوسطة

  1. الداخلية من خزانه تدفق الرقائقي يحتاج إلى ان تعامل مع 30 دقيقه ضوء الاشعه فوق البنفسجية و 15 دقيقه تدفق الهواء قبل الاستخدام. تاكد من إغلاق الباب الزجاجي عندما يكون ضوء الاشعه فوق البنفسجية علي. رش جميع الاداات واللوحات مع 70 ٪ الايثانول قبل وضعها في مجلس الوزراء.
  2. اعداد Murashige و Skoog (MS) المتوسطة في القياسية 90 mm-قطرها طبق بيتري تحت مجلس الوزراء تدفق الرقائقي.
    ملاحظه: تحتوي MS متوسطه علي المكونات التالية: 20.6 mM NH4NO3, 18.8 mm KNO3, 1.25 mm KH2PO4, 1.5 mM Mgso4· 7h2, 3 مم cacl2· 2h2o, 0.1 mm mnso4· ح2س ، 1.03 μm Na2MoO4· 2H2س ، 0.1 MM ح3بو3، 30 ΜM Znso4· 7h2س ، 0.1 μM cuso4· 5H2س ، 0.1 μM cocl2· 6h2o ، 1.39 μm كي ، 97 μ م FeSO4 · 7H2س ، 114.5 μm ايثيل الصوديوم حمض (أدتا) ، 4.07 μm حمض نيكوتينيتش ، 2.44 Μm بيريدوكسين hcl ، 0.15 Μm الثيامين hcl ، 2.68 mm الجليسين ، 555 μm ميو-اينوزيتول ، 87.7 mm السكروز و 10 غرام/لتر أجار.
  3. ترطيب النصائح المعقمة أو المسواك عن طريق لمس غيض أو المسواك إلى متوسط MS ، ثم تراجع البذور المعقمة واحدا تلو الآخر علي الموقف الثابت لكل طبق بيتري المشار اليها من قبل بطاقة البذر.
  4. ختم طبق بيتري مع فيلم البارافين وشريط لاصق ووضعه عموديا علي موقف واضح في غرفه النمو (22 درجه مئوية ، 70 ٪ رطوبة) مع دوره اليوم من 16 ساعة من الضوء و 8 ساعة من الظلام (الاضاءه من 6 صباحا إلى 10 مساءا). مصنع Arabidopsis جاهزه للتحميل cfda في اليوم 9-13 بعد البذر.
    ملاحظه: يتم تنفيذ الاجراء التالي في فتره ما بعد الظهر من الساعة 2 ظهرا حتى الساعة 5 مساء.

2. CFDA التحميل مع اجراء قطع الجذر

  1. اعداد جديد CFDA حل العمل علي الفور قبل الاستخدام. تمييع محلول الأسهم cfda 1 مم المخزنة في-20 درجه مئوية الفريزر مع المياه نقاء معقمه لتركيز العمل من 5 μM.
  2. قطع غشاء البارافين الصغيرة المساميه فيلم (انظر جدول المواد) إلى قطع صغيره من 3 مم × 3 مم الحجم.
  3. كشف النباتات المتزايدة في الغرفة في 22 درجه مئوية ومسح الرطوبة الزائدة مع منشفه ورقيه. ضع قطع الفيلم الصغيرة تحت كل جذر.
    ملاحظه: من هذا إلى الخطوة 2.6 ، يجب ان تكتمل العملية بأكملها في غضون 15 دقيقه.
  4. رفع النباتات علي غطاء طبق بيتري. قطع الجذور في موقف حوالي 5-10 مم تحت تقاطع الجذر-سويق. وضع الجزء تبادل لإطلاق النار مره أخرى إلى الفيلم علي المتوسطة.
  5. تطبيق بعناية 0.25 μL من CFDA علي نهاية القطع من كل جذر تحت المجهر تشريح. تجنب الرش إلى أجزاء أخرى من النبات.
  6. تغطيه لوحه وترك النباتات تحت الضوء ل 2-3 h (22 درجه مئوية) في غرفه النمو.
  7. شطف النباتات الملونة ثلاث مرات بالتتابع في ثلاثه أكواب منفصلة مليئه بالماء المقطر ، ثم مراقبه النباتات تحت المجهر الفلورية ستيريو مع التكبير من 1.4 x إلى 3.3 x (انظر جدول المواد). للكشف عن الفلورية ، واستخدام عاليه الكفاءة مرشح مكعب (470/20 nm الاثاره ، 495 nm الانقسام والانبعاثات 525/50 nm) شنت لنقل اشاره مضان.

3. CFDA التحميل مع سويق-معسر الاجراء

  1. اعداد جديد CFDA حل العمل علي الفور قبل الاستخدام. تمييع محلول الأسهم cfda 1 مم المخزنة في-20 درجه مئوية الفريزر مع المياه نقاء معقمه (انظر جدول المواد) إلى تركيز العمل من 5 μM.
  2. قطع غشاء البارافين الصغيرة المساميه فيلم (انظر جدول المواد) إلى قطع صغيره من 3 مم × 3 مم الحجم.
  3. كشف النباتات المتزايدة في الغرفة في 22 درجه مئوية ومسح الرطوبة الزائدة مع منشفه ورقيه.
    ملاحظه: من هذا إلى الخطوة 3.7 ، يجب ان تكتمل العملية بأكملها في غضون 15 دقيقه.
  4. وضع قطعه صغيره من الفيلم تحت تقاطع سويق الجذر لكل مصنع.
  5. استخدام ملقط لقرصه بلطف سويق بالقرب من تقاطع الجذر سويق تحت المجهر تشريح.
  6. تطبيق بعناية 0.1 μL من CFDA علي موقع الجرح تحت المجهر تشريح. تجنب الرش إلى أجزاء أخرى من النبات.
  7. تغطيه لوحه ، وترك النباتات تحت ضوء (22 درجه مئوية) ل 2-3 h.
  8. شطف النباتات الملونة ثلاث مرات بالتتابع في ثلاثه أكواب منفصلة مليئه بالماء المقطر ، ثم مراقبه النباتات تحت المجهر الفلورية ستيريو مع التكبير من 1.4 x إلى 3.3 x (انظر جدول المواد). للكشف عن الفلورية ، وجبل عاليه الكفاءة مرشح مكعب (470/20 nm الاثاره ، 495 nm الانقسام والانبعاثات 525/50 nm) لنقل اشاره مضان.

النتائج

وغالبا ما تخضع حركه symplastic للتقلبات البيئية. اضطراب الحالة التي تنمو في النبات ، وحتى عمليه اعداد الانسجه سوف تؤثر علي الحد من حجم الاستبعاد من plasmodesmata ، التالي تؤثر علي النقل symplastic22. لتحسين كفاءه تلطيخ ، ونحن حصر عملياتنا في غرفه النمو ، حيث يتم التحكم في درجه...

Discussion

وقد أظهرت الدراسات الناشئة ان النباتات يمكن ان تستجيب بسرعة للمؤثرات الخارجية23، بما في ذلك التلاعب التي أدخلت علي الإجراءات التجريبية22. في تجربتنا الاوليه ، غالبا ما تؤدي مراقبتنا لهذه المعرفة إلى تلطيخ الفشل. مع هذه الدروس ، ونحن نقترح ان توضع في الاعتبار الاحت...

Disclosures

وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.

Acknowledgements

تم تمويل هذا العمل من قبل المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (31671257) ومركز هوبي للابتكار التعاوني لصناعه الحبوب (LXT-16-18).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
KNO3  Sinopharm Chemical Reagent10017218
KH2PO4 Sinopharm Chemical Reagent10017608
MgSO4·7H2OSinopharm Chemical Reagent10013018
CaCl2·2H2OSinopharm Chemical Reagent20011160
MnSO4·H2O Sinopharm Chemical Reagent10013418
Na2MoO4·2H2OSinopharm Chemical Reagent10019818
Boric AcidSinopharm Chemical Reagent10004818
ZnSO4·7H2OSinopharm Chemical Reagent10024018
CuSO4·5H2OSinopharm Chemical Reagent10008218
CoCl2·6H2OSinopharm Chemical Reagent10007216
KISinopharm Chemical Reagent10017160
FeSO4·7H2OSinopharm Chemical Reagent10012118
EDTA Sinopharm Chemical Reagent10009717
NaOHSinopharm Chemical Reagent10019718
KOHSinopharm Chemical Reagent10017018
SucroseSinopharm Chemical Reagent10021418
Myo-inositol  MACKLINI811835
Nicotinic Acid MACKLINN814565
Pyridoxine HClMACKLINV820447
Thiamine HClMACKLINT818865
GlycineMACKLING800880
Agar powderNovonZZ14022
Fluorescence MicroscopeZeissAxio Zoom V16
Dissecting microscopeSDPTOPSRE-1030
200μl pipetteDragon Laboratory Instruments713111110000-20-200ul
2.5μl pipetteEppendorf3120000011
Fine forceps TWEEZERSST-15
ParafilmPARAFILMPM-996
Stainless steel double-sided bladeGillettePlatinum-Plus Double-Edge Blade

References

  1. Grignon, N., Touraine, B., Durand, M. 6(5)Carboxyfluorescein as a tracer of phloem sap translocation. American Journal of Botany. 76, 871-877 (1989).
  2. Wright, K. M., Oparka, K. J. The fluorescent probe HPTS as a phloem-mobile, symplastic tracer: an evaluation using confocal laser scanning microscopy. Journal of Experimental Botany. 47 (3), 439-445 (1996).
  3. Oparka, K. J., Prior, D. A. Movement of Lucifer Yellow CH in potato tuber storage tissues: A comparison of symplastic and apoplastic transport. Planta. 176 (4), 533-540 (1988).
  4. Knoblauch, M., et al. Multispectral Phloem-Mobile Probes: Properties and Applications. Plant Physiology. 167 (4), 1211-1220 (2015).
  5. Oparka, K. J., Duckett, C. M., Prior, D. A. M., Fisher, D. B. Real-time imaging of phloem unloading in the root tip of Arabidopsis. The Plant Journal. 6 (5), 759-766 (1994).
  6. Viola, R., et al. Tuberization in Potato Involves a Switch from Apoplastic to Symplastic Phloem Unloading. The Plant Cell. 13 (2), 385-398 (2001).
  7. Roberts, A. G., et al. Phloem Unloading in Sink Leaves of Nicotiana benthamiana: Comparison of a Fluorescent Solute with a Fluorescent Virus. The Plant Cell. 9 (8), 1381-1396 (1997).
  8. Péron, T., et al. New Insights into Phloem Unloading and Expression of Sucrose Transporters in Vegetative Sinks of the Parasitic Plant Phelipanche ramosa L (Pomel). Frontiers in Plant Science. 7 (2048), (2017).
  9. Spallek, T., et al. Interspecies hormonal control of host root morphology by parasitic plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 114 (20), 5283-5288 (2017).
  10. Complainville, A., et al. Nodule initiation involves the creation of a new symplasmic field in specific root cells of medicago species. The Plant Cell. 15 (12), 2778-2791 (2003).
  11. Bederska, M., Borucki, W., Znojek, E. Movement of fluorescent dyes Lucifer Yellow (LYCH) and carboxyfluorescein (CF) in Medicago truncatula Gaertn. roots and root nodules. Symbiosis. 58 (1-3), 183-190 (2012).
  12. Robards, A. W., Lucas, W. J. Plasmodesmata. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 41 (1), 369-419 (1990).
  13. Roberts, A. G., Oparka, K. J. Plasmodesmata and the control of symplastic transport. Plant, Cell & Environment. 26 (1), 103-124 (2003).
  14. Duckett, C. M., Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Dolan, L., Roberts, K. Dye-coupling in the root epidermis of Arabidopsis is progressively reduced during development. Development. 120 (11), 3247-3255 (1994).
  15. Palevitz, B. A., Hepler, P. K. Changes in dye coupling of stomatal cells of Allium and Commelina demonstrated by microinjection of Lucifer yellow. Planta. 164 (4), 473-479 (1985).
  16. van Bel, A. J. E., Kempers, R. Symplastic isolation of the sieve element-companion cell complex in the phloem of Ricinus communis and Salix alba stems. Planta. 183 (1), 69-76 (1991).
  17. Erwee, M. G., Goodwin, P. B. Symplast domains in extrastelar tissues of Egeria densa Planch. Planta. 163 (1), 9-19 (1985).
  18. Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Wright, K. M. Symplastic communication between primary and developing lateral roots of Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 46 (2), 187-197 (1995).
  19. Christensen, N. M., Faulkner, C., Oparka, K. Evidence for Unidirectional Flow through Plasmodesmata. Plant Physiology. 150 (1), 96-104 (2009).
  20. Wróbel-Marek, J., Kurczyńska, E., Płachno, B. J., Kozieradzka-Kiszkurno, M. Identification of symplasmic domains in the embryo and seed of Sedum acre L. (Crassulaceae). Planta. 245 (3), 491-505 (2017).
  21. Liang, D., White, R. G., Waterhouse, P. M. Gene silencing in Arabidopsis spreads from the root to the shoot, through a gating barrier, by template-dependent, non-vascular, cell to cell movement. Plant Physiology. 159 (3), 984-1000 (2012).
  22. Radford, J. E., White, R. G. Effects of tissue-preparation-induced callose synthesis on estimates of plasmodesma size exclusion limits. Protoplasma. 216 (1-2), 47-55 (2001).
  23. Kollist, H., et al. Rapid Responses to Abiotic Stress: Priming the Landscape for the Signal Transduction Network. Trends in Plant Science. 24 (1), 25-37 (2019).
  24. Haupt, S., Duncan, G. H., Holzberg, S., Oparka, K. J. Evidence for Symplastic Phloem Unloading in Sink Leaves of Barley. Plant Physiology. 125 (1), 209-218 (2001).
  25. Botha, C. E. J., et al. A xylem sap retrieval pathway in rice leaf blades: evidence of a role for endocytosis?. Journal of Experimental Botany. 59 (11), 2945-2954 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

147CFDAplasmodesmataphloem

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved