JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

המטרה של פרוטוקול זה היא להראות כיצד לטעון את ה-CFDA לאתרים שונים של החלקים התחתונים של Arabidopsis. לאחר מכן אנו מציגים את דפוס ההתפלגות שהתקבל של CF ב נצרי.

Abstract

מעקב אחר באופן סימטרי 5 (6)-carboxyפלואורוסקופים diacetate (cfda) כבר הוחל באופן נרחב בצמחים חיים כדי להדגים את החיבור התרבות, התחבורה שיפה ובדיקה כלי הדם. פרוטוקול זה מציג את החלק התחתון למעלה carboxyfluorescein (CF) תנועה ב Arabidopsis באמצעות חיתוך השורש ואת הליך ההיפוקטיל-צובט בהתאמה. אלה שני הליכים שונים התוצאה יעילות שונה של התנועה CF: כ 91% המראה של CF ב נצרי עם הליך ההיפוטיל-צובט, ואילו רק כ 70% המראה של CF עם הליך גזירה השורש. שינוי פשוט של אתרי טעינה, וכתוצאה מכך שינויים משמעותיים ביעילות הניידת של צבע זה באופן סימטרי, מציע התנועה CF עשוי להיות כפוף לתקנה באופן סימטרי, כנראה על ידי צומת השורש-היפוטיל.

Introduction

מכוניות פלורסנט רבים עם מגוון רחב של תכונות ספקטרליות, כגון 5 (6)-carboxyfluorescein (CF)1, 8-הhydroxypyrene-1, 3, 6-חומצה טריגופרתית2, לוציפר צהוב CH (lych)3, esculin ו-cter4, פותחו ו מוחל בצמחים כדי לפקח על התנועה באופן סימטרי ופעילות שיפה. באופן כללי, צבע סימטרי מוטען לחתוך ברקמת היעד ואת הפיזור רציפים של הכתב לתוך חלקים אחרים של הצמח יהיה להדגים את התקשורת הבין-תאית. למרות המנגנון של ספיגת הצבע אינו מובן במלואו, העיקרון הבסיסי התנועה CF בתוך תאים חיים כבר הודה נרחב. הצורה אסתר של CF (CF diacetate, CFDA) הוא לא פלורסנט, אבל ממברנה חדיר. מאפיין זה מאפשר דיפוזיה הממברנה המהירה של הצבע לתאים. פעם בתוך תאים חיים, תאיים מוחק להסיר את הקבוצות אצטט ב 3 ' ו 6 ' מיקום של CFDA, שחרור פלורסנט ו-הממברנה ממברנה-CF (איור 1, לחילופין להפנות את רייט et al.2); CF לאחר מכן יכול לעבור דרך פלמודסמאטה לחלקים אחרים של צמחים.

הליך מבוסס היטב עם cfda הוא שזה יכול להיות טעון לתוך עלי מקור ומשמש כדי לפקח על הזרמת שיפה ו לפרוק שיפה ברקמות הכיור של מינים רבים, למשל, כמו הפריקה CF ב arabidopsis שורש5, לפרוק שיפה במהלך לקות תפוחי אדמה6, הפריקה שיפה ב טבק כיור עוזב7, וכן הלאה. לפי גישות העמסה דומות, אימצו מחקרים אחרים את הצבע כדי להדגים את הקשר הסימטרי בין הפונדקאי לטפיל8,9, או כדי לחשוף את יחסי הסימביוזה10,11.

דרך נוספת לעשות שימוש בצבע זה היא לטעון אותו לתוך תאים ספציפיים או תא בודד על-ידי הזרקה כדי לקבוע את דפוס ההפצה שלה. טכניקות מתוחכמות כאלה הקלו מאוד את ההבנה העמוקה יותר של התקשורת הבינתאית בתחום הפלסטימאטה, בעיקר בפיתוח הקונספט של הדומיין הסימטרי12,13. לדוגמה, המיקרו ההזרקה של CFDA לתוך תאים cotyledon של Arabidopsis הביא דפוס צימוד לצבוע באפידרמיס היפוקטיל אבל לא צימוד בתאים הבסיסיים או באפידרמיס השורש, ולכן ההיפוטיל היפוקתא צורות האפידרמיס בתחום הפלסטיק הסימטרי14. תחומים דומים, כגון התאים לשמירה על שיניים15, מסננת הגוף תאים16, שיער בתאי השורש14 וכיפה שורש17,18 זוהו על ידי טכניקה microinjection. באופן מפתיע, מספר תחומים מאפשרים למולקולות מעקב לנוע בכיוון מסוים. קח את התחום יונקת למשל, מיקרוהזרקה של בדיקה פלורסנט לתוך התא באפידרמיס התומך מוביל את זרימת מעקב לתוך התחום יונקת, עם זאת, הזרקת הפוכה אינה מחזיקה true19. הדו ח האחרון מצא גם מצבים דומים בתחומים סימטרי של העובר Sedum 20. כך, כל המקרים לעיל לרמוז כי החלפת אתרי טעינה עלול להוביל תובנות הרומן לתוך תקשורת סימטרית. הניסוי הקודם שלנו במטרה לנתח את המסלול של שורש לירות נייד להשתקה זיהה תחום הרומן סימטרי, או HEJ (היפוקטיל צומת אפיטיל) אזור, אשר נבדק עוד באמצעות טעינת השורש (לא קאנוני כיור הטעינה) CFDA . ניסוי21 כאן, אנו עוד להרחיב את התנועה שורש-to-לירות CF באמצעות שיטה פשוטה לשחזר את תחום הפוטנציאל סימטרי פלסטיק על ידי העברת אתרי הטעינה. יתר על כן, הליך זה עשוי להיות מותאם כדי להבדיל את הרקע הגנטי, כי יש שינוי בסיס לירות הובלה ארוכת טווח.

Protocol

1. ההתפתחות האנכית של הערידופזיס במדיום MS

  1. הפנים של ארון זרימה למינארי צריך להיות מטופלים עם 30 דקות UV אור ו 15 דקות זרימת אוויר לפני השימוש. הקפידו לסגור את דלת הזכוכית כאשר אור UV דולק. רסס את כל הכלים והצלחות עם 70% אתנול לפני הצבת אותם בארון.
  2. הכינו את המדיום המורראשיג ו Skoog (MS) בצלחת פטרי בקוטר 90 מ"מ מתחת לארון זרימה למינארי.
    הערה: מדיום MS מכיל את הרכיבים הבאים: 20.6 mM NH4לא3, 18.8 mm מושג3, 1.25 mm KH2הפו4, 1.5 mm mgso4· 7h2o, 3 מ"מ cacl2· 2h2o, 0.1 mm mgso4· H2O, 1.03 Μm Na2MoO4· 2H2O, 0.1 MM H3BO3, 30 μm הלקוסו4·7h 2 o, 0.1 μm cuso4·5H 2 o, 0.1 μm cocl2·6h שני או, 1.39 μk KI, 97 μ M FeSO4 · 7h2O, 114.5 μm החומצה הנילינאית (edta), 4.07 μm חומצה ניקטינית, 2.44 μm pyridoxine HCl, 0.15 μm תיאמין HCl, 2.68 מילימטר גליצין, 555 μm-inositol, 87.7 מילימטר סוכרוז ו -10 גרם/L אגר.
  3. לחות עצות מעוקר או קיסמים על ידי נגיעה עצה או קיסמים למדיום MS, ולאחר מכן לטבול את הזרעים מעוקר אחד על ידי אחד על המיקום קבוע של כל צלחת פטרי המצוין על ידי כרטיס הזריעה.
  4. חותם את צלחת פטרי עם סרט פרפין וסרט דביק ומניחים אותו באופן אנכי על דוכן ברור בחדר הצמיחה (22 ° צ', 70% לחות) עם מחזור יום של 16 h של אור ו 8 h של חושך (תאורה מ 06:00 עד 10 pm). הצמח Arabidopsis מוכן הטעינה cfda ביום 9-13 לאחר זריעה.
    הערה: הפרוצדורה הבאה מבוצעת בשעות אחר הצהריים משעה 14:00 עד 17:00.

2. CFDA לטעון עם הליך חיתוך השורש

  1. הכינו פתרון חדש לעבודה CFDA באופן מיידי לפני השימוש. לדלל את 1 מ"מ CFDA מניות פתרון מאוחסן ב-20 ° c מקפיא עם מים באולטרטהורים סטרילי לריכוז עובד של 5 μM.
  2. חותכים את קרום מיקרו נקבובי פרפין הסרט (ראה טבלת חומרים) לחתיכות קטנות של 3 מ"מ x 3 מ"מ גודל.
  3. לחשוף את הצמחים גדל בחדר ב 22 ° c ולנקות את הלחות עודף עם מגבת נייר. מניחים את חתיכות הסרט הקטנות מתחת לכל שורש.
    הערה: מכאן ועד שלב 2.6, יש להשלים את התהליך כולו תוך 15 דקות.
  4. להרים את הצמחים על מכסה צלחת פטרי. חותכים את השורשים בעמדה על 5-10 מ"מ מתחת השורש-היפוקטיל שורש. מניחים את החלק לירות בחזרה על הסרט על המדיום.
  5. בקפידה להחיל 0.25 μL של CFDA אל קצה החיתוך של כל שורש תחת מיקרוסקופ מבתר. להימנע מתיז לחלקים אחרים של הצמח.
  6. לכסות את הצלחת ולהשאיר את הצמחים תחת אור עבור 2-3 h (22 ° c) בחדר הצמיחה.
  7. שטפו את הצמחים המוכתמת שלוש פעמים ברציפות בשלושה ספלים נפרדים מלאים במים מזוקקים, ולאחר מכן שימו לב לצמחים שמתחת למיקרוסקופ עם מערכת הסטריאו עם מרחק של 1.4 x עד 3.3 x (ראו טבלת חומרים). לאיתור הקרינה הפלואורסצנטית, להשתמש בקוביית מסנן יעילות גבוהה (470/20 ננומטר, 495 nm פיצול ו 525/50 ננומטר פליטה) רכוב לשדר את האות הפלואורסצנטית.

3. CFDA טעינה עם היפוקטיל-צובט הליך

  1. הכינו פתרון חדש לעבודה CFDA באופן מיידי לפני השימוש. לדלל את 1 mM CFDA מניות פתרון מאוחסן-20 ° c מקפיא עם מים באולטרסאונד סטרילי (לראות את הטבלה של חומרים) לריכוז עובד של 5 μm.
  2. חותכים את קרום מיקרו נקבובי פרפין הסרט (ראה טבלת חומרים) לחתיכות קטנות של 3 מ"מ x 3 מ"מ גודל.
  3. לחשוף את הצמחים גדל בחדר ב 22 ° c ולנקות את הלחות עודף עם מגבת נייר.
    הערה: מכאן ועד שלב 3.7, יש להשלים את התהליך כולו תוך 15 דקות.
  4. הניחו פיסת סרט קטנה מתחת לצומת השורשים הבסיסי של כל צמח.
  5. מלקחיים להשתמש כדי לצבוט בעדינות את ההיפוטיל ליד השורש-היפוטיל במיקרוסקופ תחת מיקרוסקופ מבתר.
  6. בזהירות להחיל 0.1 μL של CFDA אל אתר הפצע תחת מיקרוסקופ מבתר. להימנע מתיז לחלקים אחרים של הצמח.
  7. לכסות את הצלחת, ולהשאיר את הצמחים תחת אור (22 ° c) עבור 2-3 h.
  8. שטפו את הצמחים המוכתמת שלוש פעמים ברציפות בשלושה ספלים נפרדים מלאים במים מזוקקים, ולאחר מכן שימו לב לצמחים שמתחת למיקרוסקופ עם מערכת הסטריאו עם מרחק של 1.4 x עד 3.3 x (ראו טבלת חומרים). לאיתור הקרינה הפלואורסצנטית, הר קוביית מסנן יעילות גבוהה (470/20 ננומטר, 495 nm לפצל ו 525/50 הפליטה nm) כדי לשדר את האות זריחה.

תוצאות

התנועה הסימטרית כפופה לעיתים קרובות לתנודות סביבתיות. הפרטורציה של המדינה גדל הצמח, ואפילו את התהליך של הכנת רקמות ישפיע על הגבלת גודל הדרה של פלמודמאטה, ובכך להשפיע על התחבורה הסימטרית22. כדי לשפר את היעילות מכתים, אנו להגביל את הפעולה שלנו בחדר הגידול, שבו ה...

Discussion

מחקרים מתעוררים הראו כי הצמחים יכולים להגיב במהירות לגירויים חיצוניים23, כולל מניפולציה הציג את ההליכים הניסיוניים22. בניסוי הראשוני שלנו, הפיקוח שלנו על ידע זה מוביל לעיתים קרובות להצביעת הכישלון. עם שיעורים אלה, אנו מציעים כי אמצעי הזהירות הבאים יש לזכור בעת ביצ...

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

עבודה זו ממומנת על ידי הקרן הלאומית למדע הטבע של סין (31671257) ו חוביי המרכז חדשנות שיתופית לתעשיית הדגן (LXT-16-18).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
KNO3  Sinopharm Chemical Reagent10017218
KH2PO4 Sinopharm Chemical Reagent10017608
MgSO4·7H2OSinopharm Chemical Reagent10013018
CaCl2·2H2OSinopharm Chemical Reagent20011160
MnSO4·H2O Sinopharm Chemical Reagent10013418
Na2MoO4·2H2OSinopharm Chemical Reagent10019818
Boric AcidSinopharm Chemical Reagent10004818
ZnSO4·7H2OSinopharm Chemical Reagent10024018
CuSO4·5H2OSinopharm Chemical Reagent10008218
CoCl2·6H2OSinopharm Chemical Reagent10007216
KISinopharm Chemical Reagent10017160
FeSO4·7H2OSinopharm Chemical Reagent10012118
EDTA Sinopharm Chemical Reagent10009717
NaOHSinopharm Chemical Reagent10019718
KOHSinopharm Chemical Reagent10017018
SucroseSinopharm Chemical Reagent10021418
Myo-inositol  MACKLINI811835
Nicotinic Acid MACKLINN814565
Pyridoxine HClMACKLINV820447
Thiamine HClMACKLINT818865
GlycineMACKLING800880
Agar powderNovonZZ14022
Fluorescence MicroscopeZeissAxio Zoom V16
Dissecting microscopeSDPTOPSRE-1030
200μl pipetteDragon Laboratory Instruments713111110000-20-200ul
2.5μl pipetteEppendorf3120000011
Fine forceps TWEEZERSST-15
ParafilmPARAFILMPM-996
Stainless steel double-sided bladeGillettePlatinum-Plus Double-Edge Blade

References

  1. Grignon, N., Touraine, B., Durand, M. 6(5)Carboxyfluorescein as a tracer of phloem sap translocation. American Journal of Botany. 76, 871-877 (1989).
  2. Wright, K. M., Oparka, K. J. The fluorescent probe HPTS as a phloem-mobile, symplastic tracer: an evaluation using confocal laser scanning microscopy. Journal of Experimental Botany. 47 (3), 439-445 (1996).
  3. Oparka, K. J., Prior, D. A. Movement of Lucifer Yellow CH in potato tuber storage tissues: A comparison of symplastic and apoplastic transport. Planta. 176 (4), 533-540 (1988).
  4. Knoblauch, M., et al. Multispectral Phloem-Mobile Probes: Properties and Applications. Plant Physiology. 167 (4), 1211-1220 (2015).
  5. Oparka, K. J., Duckett, C. M., Prior, D. A. M., Fisher, D. B. Real-time imaging of phloem unloading in the root tip of Arabidopsis. The Plant Journal. 6 (5), 759-766 (1994).
  6. Viola, R., et al. Tuberization in Potato Involves a Switch from Apoplastic to Symplastic Phloem Unloading. The Plant Cell. 13 (2), 385-398 (2001).
  7. Roberts, A. G., et al. Phloem Unloading in Sink Leaves of Nicotiana benthamiana: Comparison of a Fluorescent Solute with a Fluorescent Virus. The Plant Cell. 9 (8), 1381-1396 (1997).
  8. Péron, T., et al. New Insights into Phloem Unloading and Expression of Sucrose Transporters in Vegetative Sinks of the Parasitic Plant Phelipanche ramosa L (Pomel). Frontiers in Plant Science. 7 (2048), (2017).
  9. Spallek, T., et al. Interspecies hormonal control of host root morphology by parasitic plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 114 (20), 5283-5288 (2017).
  10. Complainville, A., et al. Nodule initiation involves the creation of a new symplasmic field in specific root cells of medicago species. The Plant Cell. 15 (12), 2778-2791 (2003).
  11. Bederska, M., Borucki, W., Znojek, E. Movement of fluorescent dyes Lucifer Yellow (LYCH) and carboxyfluorescein (CF) in Medicago truncatula Gaertn. roots and root nodules. Symbiosis. 58 (1-3), 183-190 (2012).
  12. Robards, A. W., Lucas, W. J. Plasmodesmata. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 41 (1), 369-419 (1990).
  13. Roberts, A. G., Oparka, K. J. Plasmodesmata and the control of symplastic transport. Plant, Cell & Environment. 26 (1), 103-124 (2003).
  14. Duckett, C. M., Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Dolan, L., Roberts, K. Dye-coupling in the root epidermis of Arabidopsis is progressively reduced during development. Development. 120 (11), 3247-3255 (1994).
  15. Palevitz, B. A., Hepler, P. K. Changes in dye coupling of stomatal cells of Allium and Commelina demonstrated by microinjection of Lucifer yellow. Planta. 164 (4), 473-479 (1985).
  16. van Bel, A. J. E., Kempers, R. Symplastic isolation of the sieve element-companion cell complex in the phloem of Ricinus communis and Salix alba stems. Planta. 183 (1), 69-76 (1991).
  17. Erwee, M. G., Goodwin, P. B. Symplast domains in extrastelar tissues of Egeria densa Planch. Planta. 163 (1), 9-19 (1985).
  18. Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Wright, K. M. Symplastic communication between primary and developing lateral roots of Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 46 (2), 187-197 (1995).
  19. Christensen, N. M., Faulkner, C., Oparka, K. Evidence for Unidirectional Flow through Plasmodesmata. Plant Physiology. 150 (1), 96-104 (2009).
  20. Wróbel-Marek, J., Kurczyńska, E., Płachno, B. J., Kozieradzka-Kiszkurno, M. Identification of symplasmic domains in the embryo and seed of Sedum acre L. (Crassulaceae). Planta. 245 (3), 491-505 (2017).
  21. Liang, D., White, R. G., Waterhouse, P. M. Gene silencing in Arabidopsis spreads from the root to the shoot, through a gating barrier, by template-dependent, non-vascular, cell to cell movement. Plant Physiology. 159 (3), 984-1000 (2012).
  22. Radford, J. E., White, R. G. Effects of tissue-preparation-induced callose synthesis on estimates of plasmodesma size exclusion limits. Protoplasma. 216 (1-2), 47-55 (2001).
  23. Kollist, H., et al. Rapid Responses to Abiotic Stress: Priming the Landscape for the Signal Transduction Network. Trends in Plant Science. 24 (1), 25-37 (2019).
  24. Haupt, S., Duncan, G. H., Holzberg, S., Oparka, K. J. Evidence for Symplastic Phloem Unloading in Sink Leaves of Barley. Plant Physiology. 125 (1), 209-218 (2001).
  25. Botha, C. E. J., et al. A xylem sap retrieval pathway in rice leaf blades: evidence of a role for endocytosis?. Journal of Experimental Botany. 59 (11), 2945-2954 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

147CFDAphloem

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved