애기 장 대의 바닥 싱크대 조직에 로드 Cfda 추적자의 총격전 운동

요약

이 프로토콜의 목표는 애기장 대의 아래 부분의 다른 사이트에 cfda를 로드 하는 방법을 보여주기 위한 것입니다. 그런 다음 촬영에 CF의 결과 분포 패턴을 제시 합니다.

초록

Symplastic 트레이 서 5 (6)-carboxyfluorescein 디 아세테이트 (CFDA)는 세포 간 연결, 걸러 수송 및 혈관 패터 닝을 보여주기 위해 살아있는 식물에 널리 적용 되 고 있다. 이 프로토콜은 뿌리 절단 및 피하-핀치 과정을 각각 사용 하 여 애기 장 대의 CARBOXYFLUORESCEIN (CF) 이동을 보여준다. 이 두 가지 절차는 CF 이동의 다양 한 효율성을 초래 합니다: 약 91%는 반면에 하 부 틸 핀치 절차를 가진 촬영에서 CF의 외관, 루트 절단 절차와 CF의 약 70% 외관. 로딩 사이트의 간단한 변화는이 symplastic 염료의 이동 효율에 상당한 변화를 초래 하 고, CF 운동은 대부분 뿌리 hypocotyl 접합부에 의해 symplastic 규제 될 수 있음을 시사 한다.

서문

다양 한 스펙트럼 특성을 가진 많은 형광 추적자 (carboxyfluorescein)¹, 8 hydroxypyrene, 3, 6 트리 설파 닉 산², 루시퍼 옐로우 CH (lych)³,에 스 컬 린 및 cter⁴가 개발 되어 symplastic 운동 및 걸러 활동을 모니터링 하는 식물에 적용. 일반적으로, symplastic 염료는 표적 조직에서 절단으로 로딩 되 고, 리포터의 순차적 분산은 식물의 다른 부분으로 전달 되어 세포 간 통신을 보여줄 것 이다. 염료 흡수의 메커니즘은 완전히 이해 되지 않았지만, 살아있는 세포 내부의 CF 움직임을 기본으로 하는 원리는 널리 인정 받고 있습니다. CF (CF 디 아세테이트, CFDA)의 에스테 르 형태는 비 형광 이지만 막 투과성입니다. 이 속성은 세포에 염료의 급속 한 막 확산을 허용. 살아있는 세포 내부에서, 세포내 에스테 라 제는 CFDA의 3 ' 및 6 ' 위치에서 아세테이트 그룹을 제거 하 고, 형광 및 막 불 투과성 CF를 방출 한다 (도 1을 참조 하면 라이트 외²). CF는 plasmodesmata를 통해 식물의 다른 부분으로 이동할 수 있습니다.

CFDA와 잘 확립 된 절차는 소스 잎에 로드 하 고 많은 종의 싱크 조직에서 걸러 스트리밍 및 걸러 언로드를 모니터링 하는 데 사용 될 수 있다는 것입니다, 예를 들어, 애기 장 뿌리에서 CF 언로드로⁵, 걸러 언로드 감자 결 절 화⁶동안, 니코 티아 나 세 면 대에서 걸러 하 역, 등등⁷잎. 유사한 하 중 접근법에 의해, 다른 연구는 숙주와 기생충 사이에 symplastic 연결을 보여주기 위해이 염료를 채택^8,9, 또는 공생 관계를 공개 하는^10,11.

이 염료의 사용을 확인 하는 또 다른 방법은 그것의 분포 패턴을 결정 하기 위해 마이크로 주입에 의해 특정 세포 또는 단일 세포로 그것을 로드 하는 것 이다. 이러한 정교한 기술은 특히 symplastic 도메인¹²의 개념의 개발에서, plasmodesmata 매개 된 세포 간 통신에 대 한 우리의 깊은 이해를 크게 촉진 했다. 예를 들어, 애기 장 대의 자 엽 세포에 cfda의 미세 주입은 표 피 층에 염료 결합 패턴을 초래 하였으나 기저 세포에서 또는 뿌리 표 피에 비 결합 하 여, 따라서 배 축의 표 피를 형성 symplastic 도메인¹⁴. 구를 가드 셀 (¹⁵)과 같은 유사 도메인, 체 성분-동반자 세포 (¹⁶), 뿌리 모 세포 (¹⁴ ) 및 루트 캡 (¹⁷ )은 미세 주입 기술에 의해 확인 되었다. 놀랍게도 일부 도메인은 추적 자가 특정 방향으로 움직일 수 있도록 합니다. 난다 도메인을 예로 들면, 지지 표 피 세포에 형광 프로브의 미세 주입은 트라이 홈 도메인에 트레이 서의 흐름에 이르게, 그러나, 역방향 주입은 진정한¹⁹을 보유 하지 않습니다. 최근의 보고서는 또한 Sedum 배아 (²⁰)의 symplastic 도메인에서 유사한 상황을 발견 했다. 따라서 위의 모든 경우는 로딩 사이트의 스와핑이 symplastic 통신에 대 한 새로운 통찰력으로 이어질 수 있음을 의미 합니다. 우리의 이전 실험 루트-투-촬영 모바일 침묵의 경로를 해 부 하는 것을 목표로 하는 새로운 symplastic 도메인, 또는 HEJ (저 산소 접합) 영역, 루트 로딩을 통해 더 확인 되었다 (비 정식 싱크 로드) CFDA 실험²¹. 여기, 우리는 또한 간단한 방법을 사용 하 여 루트-촬영 CF 움직임을 정교 하 고 로딩 사이트를 이동 하 여 잠재적 인 symplastic 도메인을 복구. 또한,이 절차는 루트-촬영 장거리 전송을 변경 한 유전 배경을 차별화 하기 위해 적응 될 수 있다.

프로토콜

1. 애기 장 대 MS 배지에서 수직 성장

1. 층 류 캐비닛의 내부는 사용 전에 30 분의 자외선과 15 분의 공기 흐름으로 처리 해야 합니다. UV 표시등이 켜져 있을 때 유리 도어를 닫아야 합니다. 모든 공구와 플레이트를 캐비닛에 배치 하기 전에 70% 에탄올로 분무 하십시오.
2. 층 류 캐비닛 아래 표준 90 mm 직경의 페 트리 디쉬에서 무라 시 게와 스 쿤 크 (MS) 배지를 준비 한다.
   참고: MS 미디어에는 다음과 같은 구성 요소가 포함 되어 있습니다. 20.6 mM NH₄아니오₃, 18.8 mm kno₃, 1.25 mm 2 PO₄,1.5 mm 2· 2 시간₂분, 0.1· H2o, 1.03 µ m 나₂무₄·₂시간 3 분 0.1 mM, 30 µm 즈 소 4 · 7 월₃일(일), 0.1 µ m.₅시간 2 분, 0.1µ, 1.39, 97 µ FeSO4 · 114.5 µm ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 4.07 µ m 니코틴산, 2.44 µ m 피리 독신 hcl, 0.15 µ m 티 아민 Hcl 2.68 mm 글리신, 555 µ m 묘-이노 시 톨, 87.7 mm 자당 및 10G/L 한 천.
3. 팁 또는 이쑤시개를 MS 배지에 터치 하 여 멸 균 된 팁 또는 이쑤시개를 보습 한 다음, 시드 카드에 의해 표시 된 각 페 트리 디쉬의 고정 된 위치에 하나씩 멸 균 된 종자를 찍어 냅니다.
4. 파라핀 필름과 점착 테이프를 사용 하 여 페 트리 디쉬를 밀폐 하 여 생 육 실 (22 ° c, 70%)의 맑은 스탠드에 수직으로 배치 하 고 16 시간 동안의 빛과 어둠의 8 시간 (조명으로 오전 6 시 ~ 오후 10 분)의 하루 주기로 놓습니다. 애기 장 대 식물은 파 종 후 9-13 일에 cfda 적재를 위한 준비가 되어 있습니다.
   참고: 다음 절차는 오후 2 시 ~ 오후 5에서 오후에 수행 됩니다.

2. CFDA 루트 절단 절차 로드

1. 사용 직전에 신선한 CFDA 작업 솔루션을 준비 하십시오. 5 µ M의 작업 농도로-20°c 냉동 고에 저장 된 1mm CFDA 원 액을 멸 균 초순 수로 희석 하십시오.
2. 미세 다공성 파라핀 막 필름 ( 재료 표참조)을 3mm x 3mm 크기의 작은 조각으로 자릅니다.
3. 22 ° c에서 방에서 성장 하는 식물을 발견 하 고 종이 타월과 여분의 습기를 취소 합니다. 각 루트 아래에 작은 필름 조각을 놓습니다.
   참고: 이것에서 2.6 단계까지 전체 프로세스는 15 분 이내에 완료 되어야 합니다.
4. 식물을 배양 접시 뚜껑에 올립니다. 루트-hypocotyl 접합부 아래 약 5-10 mm의 위치에 뿌리를 자릅니다. 촬영 부분을 매체의 필름에 다시 놓습니다.
5. 신중 하 게 해 부 현미경의 각 루트의 절단 끝에 CFDA의 0.25 µ L을 적용 합니다. 식물의 다른 부분에 튀는 것을 피하십시오.
6. 플레이트를 덮고 성장 실에서 2-3 h (22°c)를 위해 식물을 빛 아래에 두십시오.
7. 3 회 염색 한 식물을 증류수로 채워진 세 개의 분리 된 비 커에서 순차적으로 헹 구 고, 그 다음 식물을 1.4 x에서 3.3 x로 확대 한 입체 형광 현미경으로 관찰 한다 ( 재료 표참조). 형광 검출을 위해, 고효율 필터 큐브 (470/20 nm 여기, 495 nm 분할 및 525/50 nm 방출)를 사용 하 여 형광 신호를 전송 합니다.

3. hypocotyl 핀치 절차를 사용 하 여 CFDA 로드

1. 사용 직전에 신선한 CFDA 작업 솔루션을 준비 하십시오. 5 µ M의 작업 농도로-20°c 냉동 고에 저장 된 1mm의 CFDA 원 액을 멸 균 초순 수 ( 재료 표참조)로 희석 하십시오.
2. 미세 다공성 파라핀 막 필름 ( 재료 표참조)을 3mm x 3mm 크기의 작은 조각으로 자릅니다.
3. 22 ° c에서 방에서 성장 하는 식물을 발견 하 고 종이 타월과 여분의 습기를 취소 합니다.
   참고: 이것에서 3.7 단계까지 전체 프로세스는 15 분 이내에 완료 되어야 합니다.
4. 각 공장의 루트-저 축의 교차점 아래에 필름의 작은 조각을 놓는다.
5. 집게를 사용 하 여 해 부 현미경 아래에 있는 근-저 부 틸 접합부 근처의 피하 부를 부드럽게 핀치 합니다.
6. 신중 하 게 해 부 현미경 아래 상처 사이트에 CFDA의 0.1 µ L을 적용 합니다. 식물의 다른 부분에 튀는 것을 피하십시오.
7. 플레이트를 덮고 2-3 h의 식물을 빛 (22°c)에서 남겨 둡니다.
8. 3 회 염색 한 식물을 증류수로 채워진 세 개의 분리 된 비 커에서 순차적으로 헹 구 고, 그 다음 식물을 1.4 x에서 3.3 x로 확대 한 입체 형광 현미경으로 관찰 한다 ( 재료 표참조). 형광 검출을 위해 고효율 필터 큐브 (470/20 nm 여기, 495 nm 분할 및 525/50 nm 방출)를 탑재 하 여 형광 신호를 전송 합니다.

결과

Symplastic 운동은 종종 환경 변동에 따라 달라질 수 있습니다. 식물 성장 상태의 섭 동, 및 심지어 조직 준비의 과정은 plasmodesmata의 크기 배제 한계에 영향을 미칠 것 이다, 따라서 symplastic 수송에 영향을 미치는²². 염색 효율을 개선 하기 위해, 우리는 온도와 습기가 단단히 제어 되는 성장 실에서 우리의 작업을 제한 하 고 또한 가능한 한 빨리 전체 절차를 ?...

토론

신생 연구는 식물이 실험 절차 (²²)에 도입 된 조작을 포함 하는 외부 자극 (²³)에 신속히 반응할 수 있다는 것을 보여주었다. 우리의 초기 실험에서,이 지식에 대 한 우리의 감독은 종종 염색 실패로 이어집니다. 이 단원에서는이 실험을 수행할 때 다음 예방 조치를 염두에 두어야 합니다. (1) 수확 후 씨앗은 저온과 낮은 수 분으로 설정 된 저장 캐비닛에 보관 해?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
KNO3	Sinopharm Chemical Reagent	10017218
KH2PO4	Sinopharm Chemical Reagent	10017608
MgSO4·7H2O	Sinopharm Chemical Reagent	10013018
CaCl2·2H2O	Sinopharm Chemical Reagent	20011160
MnSO4·H2O	Sinopharm Chemical Reagent	10013418
Na2MoO4·2H2O	Sinopharm Chemical Reagent	10019818
Boric Acid	Sinopharm Chemical Reagent	10004818
ZnSO4·7H2O	Sinopharm Chemical Reagent	10024018
CuSO4·5H2O	Sinopharm Chemical Reagent	10008218
CoCl2·6H2O	Sinopharm Chemical Reagent	10007216
KI	Sinopharm Chemical Reagent	10017160
FeSO4·7H2O	Sinopharm Chemical Reagent	10012118
EDTA	Sinopharm Chemical Reagent	10009717
NaOH	Sinopharm Chemical Reagent	10019718
KOH	Sinopharm Chemical Reagent	10017018
Sucrose	Sinopharm Chemical Reagent	10021418
Myo-inositol	MACKLIN	I811835
Nicotinic Acid	MACKLIN	N814565
Pyridoxine HCl	MACKLIN	V820447
Thiamine HCl	MACKLIN	T818865
Glycine	MACKLIN	G800880
Agar powder	Novon	ZZ14022
Fluorescence Microscope	Zeiss	Axio Zoom V16
Dissecting microscope	SDPTOP	SRE-1030
200μl pipette	Dragon Laboratory Instruments	713111110000-20-200ul
2.5μl pipette	Eppendorf	3120000011
Fine forceps	TWEEZERS	ST-15
Parafilm	PARAFILM	PM-996
Stainless steel double-sided blade	Gillette	Platinum-Plus Double-Edge Blade