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  • Referências
  • Reimpressões e Permissões

Resumo

O objetivo deste protocolo é mostrar como carregar o CFDA em diferentes locais das partes inferiores de Arabidopsis. Apresentamos, então, o padrão de distribuição resultante da FC nas brotações.

Resumo

O Tracer symplastic 5 (6)-o diacetato do carboxyfluorescein (CFDA) foi aplicado extensamente em plantas vivas para demonstrar a conexão intercelular, o transporte do floema e o patterning vascular. Este protocolo mostra o movimento de carboxifluoresceína (CF) de baixo para cima na Arabidopsis usando o procedimento de corte radicular e o hipocótilo-pinching, respectivamente. Estes dois procedimentos diferentes resultam em eficiências diferentes do movimento do CF: aproximadamente 91% de aparência de CF nos tiros com o procedimento hypocotyl-beliscando, visto que somente aproximadamente 70% de aparência de CF com o procedimento da raiz-estaca. A simples mudança de locais de carregamento, resultando em mudanças significativas na eficiência móvel deste corante symplastic, sugere que o movimento CF pode estar sujeito à regulação symplastic, provavelmente pela junção raiz-hipocótilo.

Introdução

Muitos traçadores fluorescentes com uma escala de propriedades espectrais, tais como 5 (6)-carboxyfluorescein (CF)1, 8-hydroxypyrene-1, 3, 6-trisulphonic o ácido2, Lúcifer ch amarelo (lych)3, esculin e CTER4, foram desenvolvidos e aplicado em plantas para monitorar o movimento symplastic e a atividade do floema. Geralmente, uma tintura symplastic é carregada em um corte no tecido do alvo e a dispersão seqüencial do repórter em outras partes da planta demonstrará a comunicação intercelular. Embora o mecanismo da absorção da tintura não seja compreendido inteiramente, o movimento subjacente do CF do princípio dentro das pilhas vivas foi reconhecido extensamente. A forma de éster de CF (diacetato de CF, CFDA) é não-fluorescente, mas membrana-permeável. Esta propriedade permite a difusão rápida da membrana da tintura em pilhas. Uma vez dentro das células vivas, as esterases intracelulares removem os grupos de acetato na posição 3 ' e 6 ' do CFDA, liberando a FC fluorescente e membrana-impermeable (Figura 1, alternativamente, consulte Wright et al.2); O CF pode então mover-se através dos plasmodesmos a outras partes das plantas.

Um procedimento bem estabelecido com CFDA é que ele pode ser carregado em folhas de origem e usado para monitorar o fluxo de floema e descarga de floema nos tecidos de pia de muitas espécies, por exemplo, como a descarga de CF na raiz de Arabidopsis 5, descarregamento de floema durante a tuberização da batata6, o descarregamento de floema no dissipador de Nicotiana deixa7, e assim por diante. Por abordagens similares de carga, outros estudos adotaram esse corante para demonstrar a conexão symplastic entre hospedeiro e parasita8,9, ou para revelar as relações simbióticas10,11.

Outra maneira de fazer uso deste corante é carregá-lo em células específicas ou célula única por microinjeção para determinar o seu padrão de distribuição. Tais técnicas sofisticadas facilitaram muito nossa compreensão mais profunda da comunicação intercelular mediada por Plasmodesmata, particularmente no desenvolvimento do conceito de domínio symplastic12,13. Por exemplo, a microinjeção de CFDA em células cotiledôneas de Arabidopsis resultou no padrão de acoplamento de corante na epiderme do hipocótilo, mas não acoplamento nas células subjacentes ou na epiderme radicular, portanto, a epiderme do hipocótilo forma uma domínio symplastic14. Domínios semelhantes, como as células de guarda estomática15, células de companheiro de peneira16, células de cabelo raiz14 e tampão de raiz17,18 foram identificados por técnica de microinjeção. Mais surpreendentemente, alguns domínios permitem que as moléculas traçadoras se movam em uma determinada direção. Tome o domínio do tricomas por exemplo, microinjection de uma ponta de prova fluorescente na pilha epidérmica de apoio conduz ao fluxo do Tracer no domínio do tricomas, entretanto, a injeção reversa não segura19verdadeiro. Um relatório recente também encontrou situações semelhantes nos domínios symplastic do embrião de Sedum 20. Assim, todos os casos acima implicam que a troca de locais de carregamento pode levar a novas percepções sobre a comunicação symplastic. Nosso experimento anterior com o objetivo de dissecar a rota de silenciamento móvel root-to-shoot identificou um novo domínio symplastic, ou a zona de HEJ (Hipócotilo-epicotyl Junction), que foi ainda verificada através do CFDA de carregamento de raízes (coletor não canônico) experimento21. Aqui, Nós elaboramos ainda mais o movimento da raiz para disparar CF usando um método simples e recupero um domínio symplastic potencial deslocando os locais de carregamento. Além disso, este procedimento pode ser adaptado para diferenciar origens genéticas que alteraram o transporte de longa distância root-to-shoot.

Protocolo

1. crescimento vertical de Arabidopsis no meio do MS

  1. O interior do armário do fluxo laminar precisa de ser tratado com a luz UV de 30 minutos e o fluxo de ar de 15 minutos antes do uso. Certifique-se de fechar a porta de vidro quando a luz UV está ligado. Pulverize todas as ferramentas e placas com 70% de etanol antes de colocá-las no armário.
  2. Prepare o meio Murashige e Skoog (MS) em um prato de Petri padrão de 90 mm de diâmetro um gabinete de fluxo laminar.
    Nota: o meio MS contém os seguintes componentes: 20,6 mM NH4no3, 18,8 mm kno3, 1,25 mm KH2po4, 1,5 mM MgSO4· 7h2o, 3 mm CAcl2· 2h2o, 0,1 mm mnso4· H2o, 1, 3 μm na2Moo4· 2h2o, 0,1 mm H3Bo3, 30 μm Znso4· 7h2o, 0,1 μm CuSO4· 5h2o, 0,1 μm cocl2· 6h2o, 1,39 μm Ki, 97 μ M FeSO4 · 7h2O, ácido etilenodiaminotetracético de 114,5 μm (EDTA), ácido nicotínico de 4, 7 μm, HCL do piridoxina de 2,44 μm, HCL do tiamina de 0,15 μm, Glycine de 2,68 milímetros, 555 μm Myo-inositol, sacarose de 87,7 mm e Agar 10 g/L.
  3. Hidratar as pontas ou palitos esterilizados tocando a ponta ou palitos para o meio MS, em seguida, mergulhe as sementes esterilizadas um por um na posição fixa de cada placa de Petri indicada pelo cartão de semeadura.
  4. Selar o prato de Petri com película de parafina e fita adesiva e colocá-lo verticalmente em um stand claro em uma sala de crescimento (22 ° c, 70% de umidade) com um ciclo de dia de 16 h de luz e 8 h de escuridão (iluminação das 6 am às 10 horas). A planta de Arabidopsis está pronta para o carregamento de CFDA no dia 9-13 após a semeadura.
    Nota: o procedimento a seguir é realizado na parte da tarde de 2 PM a 5 PM.

2. carregamento de CFDA com o procedimento de corte da raiz

  1. Prepare a solução de trabalho CFDA fresca imediatamente antes de usar. Diluir a solução conservada em estoque de 1 milímetro CFDA armazenada no congelador de-20 ° c com água estéril do ultrapura a uma concentração de trabalho de 5 μm.
  2. Corte a película microporosa da membrana da parafina (veja a tabela de materiais) em partes pequenas de 3 milímetros x 3 milímetros de tamanho.
  3. Descubra as plantas crescentes no quarto em 22 ° c e limpe o excesso de umidade com uma toalha de papel. Coloc as partes pequenas da película abaixo de cada raiz.
    Nota: a partir deste para o passo 2,6, todo o processo deve ser concluída dentro de 15 min.
  4. Levante as plantas na tampa do prato de Petri. Corte as raízes em uma posição de cerca de 5-10 mm abaixo da junção raiz-hipocótilo. Coloque a parte do tiro de volta para o filme no meio.
  5. Aplique com cuidado 0,25 μL de CFDA na extremidade de corte de cada raiz um microscópio de dissecação. Evite espirrar para outras partes da planta.
  6. Cubra a placa e deixe as plantas a luz para 2-3 h (22 ° c) na sala de crescimento.
  7. Enxágüe as plantas manchadas três vezes sequencialmente em três copos separados enchidos com a água destilada, a seguir Observe as plantas um microscópio da estéreo-fluorescência com zumbido de 1.4 x a 3.3 x (veja a tabela de materiais). Para detecção de fluorescência, use um cubo de filtro de alta eficiência (470/20 nm de excitação, 495 nm Split e 525/50 nm de emissão) montado para transmitir o sinal de fluorescência.

3. carregamento de CFDA com procedimento do hypocotyl-beliscar

  1. Prepare a solução de trabalho CFDA fresca imediatamente antes de usar. Diluir a solução conservada em estoque de 1 milímetro CFDA armazenada no congelador de-20 ° c com água estéril do ultrapura (veja a tabela de materiais) a uma concentração de trabalho de 5 μm.
  2. Corte a película microporosa da membrana da parafina (veja a tabela de materiais) em partes pequenas de 3 milímetros x 3 milímetros de tamanho.
  3. Descubra as plantas crescentes no quarto em 22 ° c e limpe o excesso de umidade com uma toalha de papel.
    Nota: a partir deste para o passo 3,7, todo o processo deve ser concluída dentro de 15 min.
  4. Coloque um pequeno pedaço de filme a junção raiz-hipocótilo de cada planta.
  5. Use o fórceps para beliscar delicadamente o hipocótilo próximo à junção da raiz-hipocótilo um microscópio de dissecação.
  6. Aplique com cuidado 0,1 μL de CFDA no local da ferida um microscópio de dissecação. Evite espirrar para outras partes da planta.
  7. Cubra a placa, e deixe as plantas a luz (° c 22) para 2-3 h.
  8. Enxágüe as plantas manchadas três vezes sequencialmente em três copos separados enchidos com a água destilada, a seguir Observe as plantas um microscópio da estéreo-fluorescência com zumbido de 1.4 x a 3.3 x (veja a tabela de materiais). Para a detecção de fluorescência, montar um cubo de filtro de alta eficiência (470/20 nm de excitação, 495 nm Split e 525/50 nm de emissão) para transmitir o sinal de fluorescência.

Resultados

O movimento symplastic é frequentemente sujeito às flutuações ambientais. A perturbação do estado vegetante, e até mesmo o processo de preparo tecidual afetarão o limite de exclusão de tamanho de Plasmodesmata, afetando assim o transporte symplastic22. Para melhorar a eficiência de coloração, nós confinamos nossa operação na sala de crescimento, onde a temperatura ea umidade é firmemente controlada, e também executar todo o procedimento o mais rapi...

Discussão

Estudos emergentes demonstraram que as plantas podem responder rapidamente aos estímulos externos23, incluindo a manipulação introduzida nos procedimentos experimentais22. Em nosso experimento inicial, nossa supervisão desse conhecimento muitas vezes leva a uma falha de coloração. Com estas lições, nós sugerimos que as seguintes precauções devam ser mantidas na mente ao executar esta experiência: (1) as sementes após a colheita devem ser mantidas em um armário...

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado pela Fundação Nacional de ciência natural da China (31671257) e Hubei centro de inovação colaborativa para a indústria de grãos (LXT-16-18).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
KNO3  Sinopharm Chemical Reagent10017218
KH2PO4 Sinopharm Chemical Reagent10017608
MgSO4·7H2OSinopharm Chemical Reagent10013018
CaCl2·2H2OSinopharm Chemical Reagent20011160
MnSO4·H2O Sinopharm Chemical Reagent10013418
Na2MoO4·2H2OSinopharm Chemical Reagent10019818
Boric AcidSinopharm Chemical Reagent10004818
ZnSO4·7H2OSinopharm Chemical Reagent10024018
CuSO4·5H2OSinopharm Chemical Reagent10008218
CoCl2·6H2OSinopharm Chemical Reagent10007216
KISinopharm Chemical Reagent10017160
FeSO4·7H2OSinopharm Chemical Reagent10012118
EDTA Sinopharm Chemical Reagent10009717
NaOHSinopharm Chemical Reagent10019718
KOHSinopharm Chemical Reagent10017018
SucroseSinopharm Chemical Reagent10021418
Myo-inositol  MACKLINI811835
Nicotinic Acid MACKLINN814565
Pyridoxine HClMACKLINV820447
Thiamine HClMACKLINT818865
GlycineMACKLING800880
Agar powderNovonZZ14022
Fluorescence MicroscopeZeissAxio Zoom V16
Dissecting microscopeSDPTOPSRE-1030
200μl pipetteDragon Laboratory Instruments713111110000-20-200ul
2.5μl pipetteEppendorf3120000011
Fine forceps TWEEZERSST-15
ParafilmPARAFILMPM-996
Stainless steel double-sided bladeGillettePlatinum-Plus Double-Edge Blade

Referências

  1. Grignon, N., Touraine, B., Durand, M. 6(5)Carboxyfluorescein as a tracer of phloem sap translocation. American Journal of Botany. 76, 871-877 (1989).
  2. Wright, K. M., Oparka, K. J. The fluorescent probe HPTS as a phloem-mobile, symplastic tracer: an evaluation using confocal laser scanning microscopy. Journal of Experimental Botany. 47 (3), 439-445 (1996).
  3. Oparka, K. J., Prior, D. A. Movement of Lucifer Yellow CH in potato tuber storage tissues: A comparison of symplastic and apoplastic transport. Planta. 176 (4), 533-540 (1988).
  4. Knoblauch, M., et al. Multispectral Phloem-Mobile Probes: Properties and Applications. Plant Physiology. 167 (4), 1211-1220 (2015).
  5. Oparka, K. J., Duckett, C. M., Prior, D. A. M., Fisher, D. B. Real-time imaging of phloem unloading in the root tip of Arabidopsis. The Plant Journal. 6 (5), 759-766 (1994).
  6. Viola, R., et al. Tuberization in Potato Involves a Switch from Apoplastic to Symplastic Phloem Unloading. The Plant Cell. 13 (2), 385-398 (2001).
  7. Roberts, A. G., et al. Phloem Unloading in Sink Leaves of Nicotiana benthamiana: Comparison of a Fluorescent Solute with a Fluorescent Virus. The Plant Cell. 9 (8), 1381-1396 (1997).
  8. Péron, T., et al. New Insights into Phloem Unloading and Expression of Sucrose Transporters in Vegetative Sinks of the Parasitic Plant Phelipanche ramosa L (Pomel). Frontiers in Plant Science. 7 (2048), (2017).
  9. Spallek, T., et al. Interspecies hormonal control of host root morphology by parasitic plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 114 (20), 5283-5288 (2017).
  10. Complainville, A., et al. Nodule initiation involves the creation of a new symplasmic field in specific root cells of medicago species. The Plant Cell. 15 (12), 2778-2791 (2003).
  11. Bederska, M., Borucki, W., Znojek, E. Movement of fluorescent dyes Lucifer Yellow (LYCH) and carboxyfluorescein (CF) in Medicago truncatula Gaertn. roots and root nodules. Symbiosis. 58 (1-3), 183-190 (2012).
  12. Robards, A. W., Lucas, W. J. Plasmodesmata. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 41 (1), 369-419 (1990).
  13. Roberts, A. G., Oparka, K. J. Plasmodesmata and the control of symplastic transport. Plant, Cell & Environment. 26 (1), 103-124 (2003).
  14. Duckett, C. M., Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Dolan, L., Roberts, K. Dye-coupling in the root epidermis of Arabidopsis is progressively reduced during development. Development. 120 (11), 3247-3255 (1994).
  15. Palevitz, B. A., Hepler, P. K. Changes in dye coupling of stomatal cells of Allium and Commelina demonstrated by microinjection of Lucifer yellow. Planta. 164 (4), 473-479 (1985).
  16. van Bel, A. J. E., Kempers, R. Symplastic isolation of the sieve element-companion cell complex in the phloem of Ricinus communis and Salix alba stems. Planta. 183 (1), 69-76 (1991).
  17. Erwee, M. G., Goodwin, P. B. Symplast domains in extrastelar tissues of Egeria densa Planch. Planta. 163 (1), 9-19 (1985).
  18. Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Wright, K. M. Symplastic communication between primary and developing lateral roots of Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 46 (2), 187-197 (1995).
  19. Christensen, N. M., Faulkner, C., Oparka, K. Evidence for Unidirectional Flow through Plasmodesmata. Plant Physiology. 150 (1), 96-104 (2009).
  20. Wróbel-Marek, J., Kurczyńska, E., Płachno, B. J., Kozieradzka-Kiszkurno, M. Identification of symplasmic domains in the embryo and seed of Sedum acre L. (Crassulaceae). Planta. 245 (3), 491-505 (2017).
  21. Liang, D., White, R. G., Waterhouse, P. M. Gene silencing in Arabidopsis spreads from the root to the shoot, through a gating barrier, by template-dependent, non-vascular, cell to cell movement. Plant Physiology. 159 (3), 984-1000 (2012).
  22. Radford, J. E., White, R. G. Effects of tissue-preparation-induced callose synthesis on estimates of plasmodesma size exclusion limits. Protoplasma. 216 (1-2), 47-55 (2001).
  23. Kollist, H., et al. Rapid Responses to Abiotic Stress: Priming the Landscape for the Signal Transduction Network. Trends in Plant Science. 24 (1), 25-37 (2019).
  24. Haupt, S., Duncan, G. H., Holzberg, S., Oparka, K. J. Evidence for Symplastic Phloem Unloading in Sink Leaves of Barley. Plant Physiology. 125 (1), 209-218 (2001).
  25. Botha, C. E. J., et al. A xylem sap retrieval pathway in rice leaf blades: evidence of a role for endocytosis?. Journal of Experimental Botany. 59 (11), 2945-2954 (2008).

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