JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol amacı nasıl Arabidopsisalt kısımlarında farklı sitelere CFDA yüklemek için göstermek için. Daha sonra çekim içinde CF ortaya çıkan dağıtım deseni sunuyoruz.

Özet

Symplastic Tracer 5 (6)-carboxyfluorcein diasetat (CFDA), hücresel bağlantı, floem taşımacılığı ve vasküler desenlerin ortaya koyduğu yaşam tesislerinde yaygın olarak uygulanmaktadır. Bu protokol, sırasıyla kök kesme ve ikiyüzlü pinching prosedürünü kullanarak Arabidopsis 'te Alta-to-top carboxyflorcein (CF) hareketini gösterir. Bu iki farklı prosedür, CF hareketinin farklı verimlilikleri ile sonuçlanır: yaklaşık% 91 ' i, iki yüzlü-pinching prosedürü ile çekimler içinde CF 'nin% 70 ' i, root-kesme prosedürü ile CF 'nin yaklaşık%% ' i. Bu simplastik boya mobil verimlilikte önemli değişiklikler sonuçlanan yükleme siteleri, basit değişiklik, CF hareketi en büyük olasılıkla kök-ikiyüzotil kavşak tarafından, symplastic yönetmeliğine tabi olabilir öneriyor.

Giriş

5 (6)-karboksflorcein (CF)1, 8-hidrokpliroidi-1, 3, 6-trisulphonik asit2, Lucifer sarı ch (lych)3, esculin ve cter4gibi spektral özellikleri bir dizi ile birçok floresan izleyiciler geliştirilmiştir ve symplastik hareketi ve floem aktivitesini izlemek için bitkiler uygulanır. Genellikle, bir symplastic boya hedef doku bir kesim içine yüklenir ve bitkinin diğer bölgelerine içine gazetecinin sıralı dağılım hücresel iletişim gösterecektir. Boya emilimi mekanizması tam olarak anlaşılmamış olsa da, canlı hücreler içinde temel CF hareketinin ilkesi yaygın olarak kabul edilmiştir. CF (CF diacetate, CFDA) ester formu floresan olmayan, ancak membran geçirgen. Bu özellik, boyanın hücrelere hızlı membran difüzyon sağlar. Canlı hücreler içinde bir kez, hücre içi esterleri 3 ' ve 6 ' CFDA pozisyonunda asetat grupları kaldırmak, floresan ve membran geçirmez CF serbest (Şekil 1, alternatif Wright ve al.2bakın); CF daha sonra plasmodesmata aracılığıyla bitkilerin diğer bölgelerine taşıyabilirsiniz.

CFDA ile iyi kurulan bir prosedür bu kaynak yaprakları içine yüklenebilir ve floem akışı ve birçok türün lavabo dokularında boşaltma floem izlemek için kullanılan olduğunu, örn, Arabidopsis root5CF boşaltma olarak, floem boşaltma patates tüberkülasyonu6sırasında, Nicotiana lavabo içinde floem boşaltma7yaprakları, ve benzeri. Benzer yükleme yaklaşımlarıyla, diğer çalışmalar bu boya ana bilgisayar ve parazit arasında symplastic bağlantı göstermek için benimsenen8,9, ya da simbiyotik ilişkiler ortaya çıkarmak için10,11.

Bu boyayı kullanımın başka bir yolu da, dağıtım düzenini belirlemek için belirli hücrelere veya tek hücreye mikroenjeksiyon yoluyla yüklenecektir. Bu tür sofistike teknikler, özellikle symplastic Domain12,13konseptinin geliştirilmesinde, plasmodesmata-aracılı hücresel iletişimin daha derin anlayışımızı büyük ölçüde kolaylaştırdı. Örneğin, Arabidopsis kotiledon hücrelerine CFDA Mikroenjeksiyonu, ikiyüzlülik epidermis ancak altta yatan hücrelerde veya kök epidermis içinde boya-bağlantı deseni sonuçlandı, bu nedenle iki yüzlü epidermis formları symplastic etki alanı14. Evcikli Guard hücreleri gibi benzer etki alanları15, elek element-Companion hücreleri16, kök saç hücreleri14 ve root Cap17,18 mikroenjeksiyon tekniği ile tespit edilmiştir. En şaşırtıcı şekilde, bazı etki alanları izleyici moleküllerinin belirli bir yönde hareket etmesine izin verir. Örneğin diken alan alın, destekleyici epidermal hücreye bir floresan prob mikroenjeksiyon diken etki içine izleyici akışına yol açar, ancak, ters enjeksiyon gerçek tutmaz19. Son raporda ayrıca Sedum embriyo20' nin symplastic alanlarında da benzer durumlar bulunmuştur. Bu nedenle, yukarıdaki tüm durumlarda yükleme sitelerinin takas symplastik iletişim içine yeni Öngörüler yol açabilir anlamına gelir. Önceki deney kök-to-Shoot mobil susturma rota incelemek amaçlayan bir roman symplastic etki alanı veya HEJ (ikiyüzsüz-epicotyl Junction) bölge, daha fazla kök yükleme (non-kurallı lavabo-yükleme) CFDA üzerinden doğrulanmıştır tespit Deneme21. Burada, biz daha basit bir yöntem kullanarak root-to-Shoot CF hareketi ayrıntılı ve yükleme sitelerini değiştirerek potansiyel bir symplastic etki alanı kurtarmak. Ayrıca bu prosedür, kökten ateş eden uzun mesafe taşımacılığını değiştiren genetik kökenleri ayırt etmek için uyarlanabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

1. MS orta Arabidopsis dikey büyüme

  1. Laminar akış kabininin iç kısmı, kullanımdan önce 30 dk UV ışık ve 15 dk hava akımı ile tedavi edilmelidir. UV ışığı açık olduğunda cam kapıyı kapattığınızdan emin olun. % 70 etanol ile tüm araçları ve plakaları dolap yerleştirmeden önce sprey.
  2. Murashige ve Skoog (MS) ortamını, bir laminar akış kabininin altında Standart 90 mm çap Petri tabağı ile hazırlayın.
    Not: MS orta aşağıdaki bileşenleri içerir: 20,6 mM NH4No3, 18,8 mm kno3, 1,25 mM KH2Po4, 1,5 mm MgSO4· 7h2o, 3 mm CAcl2· 2H2o, 0,1 mm mnso4· H2o, 1,03 μm na2MoO4· 2H2o, 0,1 mm H3Bo,3, 30 ΜM Znso4· 7h2o, 0,1 μM Cuso4· 5h2o, 0,1 μm COCL2· 6h2o, 1,39 μm kı, 97 μ M FeSO4 · 7h2O, 114,5 μm etylenediaminetetraasetic asit (EDTA), 4,07 μm nikoinik asit, 2,44 μM piridoksin HCL, 0,15 μm tiamin HCL, 2,68 mm Glycine, 555 μm Myo-İnositol, 87,7 mm sakaroz ve 10 g/L agar.
  3. Sterilizasyon ipuçları veya diş, MS medyası için uç veya kürdan dokunarak nemlendirici, daha sonra her Petri çanak bir sabit pozisyon üzerine tek bir sterilize tohumları daldırma tohumlama kartı ile gösterilir.
  4. Parafin film ve yapışkan bant ile Petri tabak mühür ve dikey bir büyüme odasında açık bir stand üzerine yerleştirin (22 °C, 70% nem) bir gün döngüsü ile 16 saat ışık ve 8 karanlık h (aydınlatma 6 to 10 PM). Arabidopsis tesisi, ekim sonrası 9-13 gün boyunca CFDA yükleme için hazırdır.
    Not: Aşağıdaki prosedür öğleden sonra 2 PM 5 pm gerçekleştirilir.

2. root kesme prosedürü ile CFDA yükleme

  1. Hemen kullanmadan önce yeni CFDA çalışma çözümünü hazırlayın. 1 mm CFDA stok çözeltisi, 5 μM çalışma konsantrasyonuna steril Ultra Saf suyla-20 °c ' lik dondurucu içinde saklanır.
  2. Mikro-gözenekli parafin membran filmi (bkz. malzeme tablosu) 3 mm x 3 mm büyüklüğünde küçük parçalara keser.
  3. 22 °C ' de odada büyüyen bitkileri ortaya çıkarın ve kağıt havlusu ile aşırı nemi temizleyin. Küçük film parçalarını her kökün altına yerleştirin.
    Not: Bu adım 2,6, tüm işlem 15 dakika içinde tamamlanması gerekir.
  4. Bitkiler Petri çanak kapağı üzerine kaldırın. Root-ikiyüzotil kavşak altında 5-10 mm hakkında bir pozisyonda kökleri kes. Orta üzerinde filme geri çekim parçası yerleştirin.
  5. CFDA 0,25 μL 'leri, her bir kökün kesme ucunu Diseksiyon mikroskobu altında dikkatle uygulayın. Bitkinin diğer bölgelerine sıçramadan kaçının.
  6. Plaka kapağı ve büyüme odasında 2-3 h (22 °C) için ışık altında bitkiler bırakın.
  7. Lekeli bitkileri üç kez sıralı olarak damıtılmış su ile dolu üç ayrı bezelerde durulayın, ardından 1.4 x 'den 3.3 x 'e yakınlaştırma ile stereo-floresans mikroskop altında bitkiler gözlemlemek ( malzeme tablosunabakın). Floresan algılama için, floresan sinyalini iletmek üzere monte edilen yüksek verimlilik filtre küpü (470/20 Nm uyarma, 495 nm bölünmüş ve 525/50 nm emisyonu) kullanın.

3. cıkotil-pinching prosedürü ile CFDA yükleme

  1. Hemen kullanmadan önce yeni CFDA çalışma çözümünü hazırlayın. 1 mm CFDA stok solüsyonu-20 °c ' de steril Ultra Saf suyla ( malzeme tablosunabakın) 5 μM ' lik bir çalışma konsantrasyonuna saklanan seyreltilebilir.
  2. Mikro-gözenekli parafin membran filmi (bkz. malzeme tablosu) 3 mm x 3 mm büyüklüğünde küçük parçalara keser.
  3. 22 °C ' de odada büyüyen bitkileri ortaya çıkarın ve kağıt havlusu ile aşırı nemi temizleyin.
    Not: Bu adım 3,7, tüm işlem 15 dakika içinde tamamlanması gerekir.
  4. Her bitkinin kök-ikiyüzli kavşak altında film küçük bir parça Lay.
  5. Bir Diseksiyon mikroskobu altında kök-ikiyüzleril kavşak yakın ikiyüzüne hafifçe çimdik için forseps kullanın.
  6. CFDA 0,1 μL 'leri, Diseksiyon mikroskobu altında yara sitesine dikkatle uygulayın. Bitkinin diğer bölgelerine sıçramadan kaçının.
  7. Plaka kapağı ve 2-3 h için ışık (22 °C) altında bitkiler bırakın.
  8. Lekeli bitkileri üç kez sıralı olarak damıtılmış su ile dolu üç ayrı bezelerde durulayın, ardından 1.4 x 'den 3.3 x 'e yakınlaştırma ile stereo-floresans mikroskop altında bitkiler gözlemlemek ( malzeme tablosunabakın). Floresan algılama için, floresan sinyalini iletmek için yüksek verimli bir filtre küpü (470/20 Nm uyarma, 495 nm bölünmüş ve 525/50 nm emisyonu) monte edin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Symplastic hareketi genellikle çevresel dalgalanmalara tabidir. Bitki büyüyen devlet Perturbation, ve hatta doku hazırlama süreci plasmodesmata boyutu dışlama sınırını etkileyecektir, böylece symplastic taşıma etkileyen22. Boyama verimliliğini artırmak için, biz sıcaklık ve nem sıkıca kontrol edilir büyüme odasında, bizim operasyon Confine, ve aynı zamanda mümkün olduğunca hızlı bir şekilde tüm prosedürü gerçekleştirmek (ideal i?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Gelişmekte olan çalışmalar bitkiler hızla dış uyaranlara yanıt verebilir göstermiştir23, manipülasyon da dahil olmak üzere deneysel prosedürler tanıtıldı22. İlk deneyimizde, bu bilginin gözetimi genellikle boyama başarısızlığa yol açar. Bu derslerle, bu deneyi yaparken aşağıdaki önlemlerin akılda tutulması gerektiğini öneriyoruz: (1) hasat sonrası tohumlar düşük sıcaklık ve düşük nemi ayarlamak için bir depolama kabininde tutulmalı...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarların ifşa etmesi gereken hiçbir şey yok.

Teşekkürler

Bu çalışma Çin 'in Ulusal Doğal Bilim Vakfı (31671257) ve Hubei ortak yenilik Merkezi tahıl endüstrisi (LXT-16-18) tarafından finanse edilmiştir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
KNO3  Sinopharm Chemical Reagent10017218
KH2PO4 Sinopharm Chemical Reagent10017608
MgSO4·7H2OSinopharm Chemical Reagent10013018
CaCl2·2H2OSinopharm Chemical Reagent20011160
MnSO4·H2O Sinopharm Chemical Reagent10013418
Na2MoO4·2H2OSinopharm Chemical Reagent10019818
Boric AcidSinopharm Chemical Reagent10004818
ZnSO4·7H2OSinopharm Chemical Reagent10024018
CuSO4·5H2OSinopharm Chemical Reagent10008218
CoCl2·6H2OSinopharm Chemical Reagent10007216
KISinopharm Chemical Reagent10017160
FeSO4·7H2OSinopharm Chemical Reagent10012118
EDTA Sinopharm Chemical Reagent10009717
NaOHSinopharm Chemical Reagent10019718
KOHSinopharm Chemical Reagent10017018
SucroseSinopharm Chemical Reagent10021418
Myo-inositol  MACKLINI811835
Nicotinic Acid MACKLINN814565
Pyridoxine HClMACKLINV820447
Thiamine HClMACKLINT818865
GlycineMACKLING800880
Agar powderNovonZZ14022
Fluorescence MicroscopeZeissAxio Zoom V16
Dissecting microscopeSDPTOPSRE-1030
200μl pipetteDragon Laboratory Instruments713111110000-20-200ul
2.5μl pipetteEppendorf3120000011
Fine forceps TWEEZERSST-15
ParafilmPARAFILMPM-996
Stainless steel double-sided bladeGillettePlatinum-Plus Double-Edge Blade

Referanslar

  1. Grignon, N., Touraine, B., Durand, M. 6(5)Carboxyfluorescein as a tracer of phloem sap translocation. American Journal of Botany. 76, 871-877 (1989).
  2. Wright, K. M., Oparka, K. J. The fluorescent probe HPTS as a phloem-mobile, symplastic tracer: an evaluation using confocal laser scanning microscopy. Journal of Experimental Botany. 47 (3), 439-445 (1996).
  3. Oparka, K. J., Prior, D. A. Movement of Lucifer Yellow CH in potato tuber storage tissues: A comparison of symplastic and apoplastic transport. Planta. 176 (4), 533-540 (1988).
  4. Knoblauch, M., et al. Multispectral Phloem-Mobile Probes: Properties and Applications. Plant Physiology. 167 (4), 1211-1220 (2015).
  5. Oparka, K. J., Duckett, C. M., Prior, D. A. M., Fisher, D. B. Real-time imaging of phloem unloading in the root tip of Arabidopsis. The Plant Journal. 6 (5), 759-766 (1994).
  6. Viola, R., et al. Tuberization in Potato Involves a Switch from Apoplastic to Symplastic Phloem Unloading. The Plant Cell. 13 (2), 385-398 (2001).
  7. Roberts, A. G., et al. Phloem Unloading in Sink Leaves of Nicotiana benthamiana: Comparison of a Fluorescent Solute with a Fluorescent Virus. The Plant Cell. 9 (8), 1381-1396 (1997).
  8. Péron, T., et al. New Insights into Phloem Unloading and Expression of Sucrose Transporters in Vegetative Sinks of the Parasitic Plant Phelipanche ramosa L (Pomel). Frontiers in Plant Science. 7 (2048), (2017).
  9. Spallek, T., et al. Interspecies hormonal control of host root morphology by parasitic plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 114 (20), 5283-5288 (2017).
  10. Complainville, A., et al. Nodule initiation involves the creation of a new symplasmic field in specific root cells of medicago species. The Plant Cell. 15 (12), 2778-2791 (2003).
  11. Bederska, M., Borucki, W., Znojek, E. Movement of fluorescent dyes Lucifer Yellow (LYCH) and carboxyfluorescein (CF) in Medicago truncatula Gaertn. roots and root nodules. Symbiosis. 58 (1-3), 183-190 (2012).
  12. Robards, A. W., Lucas, W. J. Plasmodesmata. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 41 (1), 369-419 (1990).
  13. Roberts, A. G., Oparka, K. J. Plasmodesmata and the control of symplastic transport. Plant, Cell & Environment. 26 (1), 103-124 (2003).
  14. Duckett, C. M., Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Dolan, L., Roberts, K. Dye-coupling in the root epidermis of Arabidopsis is progressively reduced during development. Development. 120 (11), 3247-3255 (1994).
  15. Palevitz, B. A., Hepler, P. K. Changes in dye coupling of stomatal cells of Allium and Commelina demonstrated by microinjection of Lucifer yellow. Planta. 164 (4), 473-479 (1985).
  16. van Bel, A. J. E., Kempers, R. Symplastic isolation of the sieve element-companion cell complex in the phloem of Ricinus communis and Salix alba stems. Planta. 183 (1), 69-76 (1991).
  17. Erwee, M. G., Goodwin, P. B. Symplast domains in extrastelar tissues of Egeria densa Planch. Planta. 163 (1), 9-19 (1985).
  18. Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Wright, K. M. Symplastic communication between primary and developing lateral roots of Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 46 (2), 187-197 (1995).
  19. Christensen, N. M., Faulkner, C., Oparka, K. Evidence for Unidirectional Flow through Plasmodesmata. Plant Physiology. 150 (1), 96-104 (2009).
  20. Wróbel-Marek, J., Kurczyńska, E., Płachno, B. J., Kozieradzka-Kiszkurno, M. Identification of symplasmic domains in the embryo and seed of Sedum acre L. (Crassulaceae). Planta. 245 (3), 491-505 (2017).
  21. Liang, D., White, R. G., Waterhouse, P. M. Gene silencing in Arabidopsis spreads from the root to the shoot, through a gating barrier, by template-dependent, non-vascular, cell to cell movement. Plant Physiology. 159 (3), 984-1000 (2012).
  22. Radford, J. E., White, R. G. Effects of tissue-preparation-induced callose synthesis on estimates of plasmodesma size exclusion limits. Protoplasma. 216 (1-2), 47-55 (2001).
  23. Kollist, H., et al. Rapid Responses to Abiotic Stress: Priming the Landscape for the Signal Transduction Network. Trends in Plant Science. 24 (1), 25-37 (2019).
  24. Haupt, S., Duncan, G. H., Holzberg, S., Oparka, K. J. Evidence for Symplastic Phloem Unloading in Sink Leaves of Barley. Plant Physiology. 125 (1), 209-218 (2001).
  25. Botha, C. E. J., et al. A xylem sap retrieval pathway in rice leaf blades: evidence of a role for endocytosis? Journal of Experimental Botany. 59 (11), 2945-2954 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

evre Bilimlerisay 147CFDAroot to ShootTracerhareketplasmodesmataphloemroot ikiy zotil kav ak

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır