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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

L'obiettivo di questo protocollo è quello di mostrare come caricare il CFDA in diversi siti delle parti inferiori di Arabidopsis. Presentiamo quindi il modello di distribuzione risultante di CF nei germogli.

Abstract

Il simplastico Tracer 5 (6)-carbossimetilfluoreina diacetato (CFDA) è stato ampiamente applicato in piante viventi per dimostrare la connessione intercellulare, il trasporto floema e il patterning vascolare. Questo protocollo Mostra il movimento da basso a superiore della carbossimetilfluoreina (CF) nell' Arabidopsis utilizzando rispettivamente la procedura di taglio radicale e di ipocotilizzazione. Queste due diverse procedure si traducono in diverse efficienze del movimento CF: circa il 91% dell'aspetto di CF nei germogli con la procedura di ipocotilio-pizzicamento, mentre solo circa 70% aspetto di CF con la procedura di root-Cutting. Il semplice cambiamento dei siti di carico, con conseguenti cambiamenti significativi nell'efficienza mobile di questo colorante simplastico, suggerisce che il movimento CF potrebbe essere soggetto alla regolazione simplastico, molto probabilmente dalla giunzione radice-ipocotyl.

Introduzione

Molti traccianti fluorescenti con una gamma di proprietà spettrali, come 5 (6)-carbossilfluoreina (CF) 1,8-idrossipirene-1, 3, 6-acido trisolfonico2, Lucifero giallo ch (Lych)3, esculin e CTER4, sono stati sviluppati e applicato nelle piante per monitorare il movimento simplastico e l'attività floema. Generalmente, un colorante simplastico viene caricato in un taglio nel tessuto bersaglio e la dispersione sequenziale del reporter in altre parti dell'impianto dimostrerà la comunicazione intercellulare. Anche se il meccanismo di assorbimento del colorante non è pienamente compreso, il principio sottostante movimento CF all'interno di cellule vive è stato ampiamente riconosciuto. La forma di estere di CF (diacetato CF, CFDA) è non fluorescente, ma permeabile alla membrana. Questa proprietà consente una rapida diffusione della membrana del colorante nelle cellule. Una volta all'interno delle cellule vive, le esterasi intracellulari rimuovono i gruppi di acetato alla posizione 3' e 6' di CFDA, rilasciando la CF fluorescente e impermeabile alla membrana (Figura 1, in alternativa, fare riferimento a Wright et al.2); CF può quindi muoversi attraverso il plasmodesmi ad altre parti di piante.

Una procedura consolidata con CFDA è che può essere caricata in foglie di origine e utilizzata per monitorare lo streaming floema e lo scarico floema nei tessuti lavello di molte specie, ad esempio, come scarico CF nella radice di Arabidopsis 5, scarico floema durante la tuberizzazione di patate6, scarico floema nel lavello Nicotiana lascia7, e così via. Con approcci di carico simili, altri studi hanno adottato questo colorante per dimostrare la connessione simplastico tra host e parassita8,9, o per rivelare le relazioni simbiotiche10,11.

Un altro modo per fare uso di questo colorante è quello di caricarlo in cellule specifiche o singola cellula mediante microiniezione per determinare il suo modello di distribuzione. Tali tecniche sofisticate hanno notevolmente facilitato la nostra più profonda comprensione della comunicazione intercellulare mediata da plasmodesmato, in particolare nello sviluppo del concetto di dominio simplastico12,13. Ad esempio, la microiniezione di CFDA in cellule di cotilina di Arabidopsis ha provocato il modello di accoppiamento colorante nell'epidermide ipocotilica ma non accoppiamento nelle cellule sottostanti o nell'epidermide radice, pertanto l'epidermide ipocotilica forma un dominio simplastico14. Domini simili, come le cellule di guardia stomatale15, elemento setaccio-cellule compagno16, cellule dei capelli di radice14 e tappo di radice17,18 sono stati identificati con la tecnica di microiniezione. Sorprendentemente, alcuni domini consentono alle molecole traccianti di muoversi in una certa direzione. Prendete il dominio Tricomi, ad esempio, la microiniezione di una sonda fluorescente nella cellula epidermica di supporto conduce al flusso di tracciante nel dominio Tricomi, tuttavia, l'iniezione inversa non tiene vero19. Un recente rapporto ha anche trovato situazioni simili nei domini simplastico dell'embrione Sedum 20. Così, tutti i casi di cui sopra implicano che lo scambio di siti di carico può portare a nuove intuizioni sulla comunicazione simplastico. Il nostro esperimento precedente con l'obiettivo di sezionare il percorso di silenziamento mobile root-to-Shoot ha identificato un nuovo dominio simplastico, o la zona di Hej (igenici-epicotil), che è stata ulteriormente verificata attraverso la CFDA carico di radice (non canonica) esperimento21. Qui, abbiamo ulteriormente elaborato il movimento CF Root-to-Shoot utilizzando un metodo semplice e recuperare un potenziale dominio simplastico spostando i siti di carico. Inoltre, questa procedura può essere adattata per differenziare gli sfondi genetici che hanno alterato il trasporto a lunga distanza da root a sparare.

Protocollo

1. Arabidopsis crescita verticale in MS medio

  1. L'interno dell'armadio a flusso laminare deve essere trattato con 30 minuti di luce UV e 15 minuti di flusso d'aria prima dell'uso. Assicurarsi di chiudere la porta di vetro quando la luce UV è acceso. Spruzzare tutti gli utensili e le piastre con 70% di etanolo prima di metterli nel cabinet.
  2. Preparare il mezzo Murashige e Skoog (MS) in una piastra di Petri standard di 90 mm di diametro sotto un armadio a flusso laminare.
    Nota: il supporto MS contiene i seguenti componenti: 20,6 mM NH4No3, 18,8 mm kno3, 1,25 mm KH2po4, 1,5 mM MgSO4· 7h2o, 3 mm CAcl2· 2h2o, 0,1 mm MnSO4· H2o, 1,03 μm na2Moo4· 2h2o, 0,1 mm H3Bo3, 30 μm ZnSO4· 7h2o, 0,1 μm CuSO4· 5h2o, 0,1 μm COCL2· 6h2o, 1,39 μm Ki, 97 μ M FeSO4 · 7H2O, 114,5 μm acido etilendiamaminetetraacetico (EDTA), 4,07 μm acido nicotinico, 2,44 μm piridossina hcl, 0,15 μm tiamina hcl, 2,68 mm glicina, 555 μm myo-inositolo, 87,7 mm saccarosio e 10 g/L agar.
  3. Idratare le punte sterilizzate o stuzzicadenti toccando la punta o stuzzicadenti al mezzo MS, quindi immergere i semi sterilizzati uno per uno sulla posizione fissa di ogni piatto di Petri indicato dalla carta di semina.
  4. Sigillare la capsula di Petri con pellicola di paraffina e nastro adesivo e posizionarla verticalmente su un supporto trasparente in una sala di crescita (22 ° c, 70% di umidità) con un ciclo giornaliero di 16 ore di luce e 8 h di oscurità (illuminazione da 6 am a 10 PM). Lo stabilimento di Arabidopsis è pronto per il caricamento CFDA il giorno 9-13 dopo la semina.
    Nota: la seguente procedura viene eseguita nel pomeriggio da 2 pm a 5 PM.

2. CFDA carico con la procedura di taglio della radice

  1. Preparare la soluzione di lavoro CFDA fresca immediatamente prima dell'uso. Diluire la soluzione di magazzino CFDA da 1 mM immagazzinata in congelatore da-20 ° c con acqua ultrapura sterile ad una concentrazione di lavoro di 5 μM.
  2. Tagliare la pellicola di membrana di paraffina microporosa (vedere la tabella dei materiali) in piccoli pezzi di dimensioni 3 x 3 mm.
  3. Scopri le piante in crescita nella stanza a 22 ° c e cancella l'umidità in eccesso con un tovagliolo di carta. Posizionare i piccoli pezzi di pellicola sotto ogni radice.
    Nota: da questo al passo 2,6, l'intero processo deve essere completato entro 15 minuti.
  4. Sollevare le piante sul coperchio della capsula di Petri. Tagliare le radici in una posizione di circa 5-10 mm sotto la giunzione radice-ipocotilile. Riposiziona la parte di ripresa sul film sul supporto.
  5. Applicare con cautela 0,25 μL di CFDA sull'estremità di taglio di ogni radice sotto un microscopio dissezione. Evitare schizzi in altre parti dell'impianto.
  6. Coprire la piastra e lasciare le piante sotto la luce per 2-3 h (22 ° c) nella sala di crescita.
  7. Sciacquare le piante colorate tre volte sequenzialmente in tre bicchieri separati riempiti con acqua distillata, quindi osservare le piante sotto un microscopio a fluorescenza stereo con zoom da 1.4 x a 3.3 x (vedere la tabella dei materiali). Per il rilevamento della fluorescenza, utilizzare un cubo filtrante ad alta efficienza (470/20 Nm di eccitazione, 495 Nm di divisione e 525/50 Nm di emissione) montato per trasmettere il segnale di fluorescenza.

3. CFDA carico con procedura di ipocotilio-pizzicare

  1. Preparare la soluzione di lavoro CFDA fresca immediatamente prima dell'uso. Diluire la soluzione di magazzino CFDA da 1 mM immagazzinata in congelatore da-20 ° c con acqua ultrapura sterile (vedere la tabella dei materiali) ad una concentrazione di lavoro di 5 μm.
  2. Tagliare la pellicola di membrana di paraffina microporosa (vedere la tabella dei materiali) in piccoli pezzi di dimensioni 3 x 3 mm.
  3. Scopri le piante in crescita nella stanza a 22 ° c e cancella l'umidità in eccesso con un tovagliolo di carta.
    Nota: da questo al passo 3,7, l'intero processo deve essere completato entro 15 minuti.
  4. Posare un piccolo pezzo di pellicola sotto il nodo radice-ipocotilio di ogni pianta.
  5. Usare pinze per pizzicare delicatamente l'ipocotilio vicino alla giunzione radice-ipocotilile sotto un microscopio dissezione.
  6. Applicare con cautela 0,1 μL di CFDA sul sito della ferita sotto un microscopio dissezione. Evitare schizzi in altre parti dell'impianto.
  7. Coprire la piastra e lasciare le piante sotto la luce (22 ° c) per 2-3 h.
  8. Sciacquare le piante colorate tre volte sequenzialmente in tre bicchieri separati riempiti con acqua distillata, quindi osservare le piante sotto un microscopio a fluorescenza stereo con zoom da 1.4 x a 3.3 x (vedere la tabella dei materiali). Per il rilevamento della fluorescenza, montare un cubo filtrante ad alta efficienza (470/20 Nm di eccitazione, 495 Nm di divisione e 525/50 Nm di emissione) per trasmettere il segnale di fluorescenza.

Risultati

Il movimento symplastic è spesso soggetto a fluttuazioni ambientali. Perturbazione dello stato vegetativo in crescita, e anche il processo di preparazione dei tessuti influenzerà il limite di esclusione di dimensioni di Plasmodesmata, influenzando così il trasporto simplastico22. Per migliorare l'efficienza di colorazione, confiniamo il nostro funzionamento nella sala di crescita, dove la temperatura e l'umidità è strettamente controllata, e anche eseguire l'i...

Discussione

Studi emergenti hanno dimostrato che le piante possono reagire rapidamente agli stimoli esterni23, compresa la manipolazione introdotta nelle procedure sperimentali22. Nel nostro esperimento iniziale, la nostra supervisione di questa conoscenza spesso porta a un fallimento di colorazione. Con queste lezioni, suggeriamo di tenere a mente le seguenti precauzioni quando si esegue questo esperimento: (1) i semi dopo la raccolta devono essere conservati in un armadio di stoccagg...

Divulgazioni

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Riconoscimenti

Questo lavoro è stato finanziato dalla Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (31671257) e dal centro di innovazione collaborativa di Hubei per l'industria del grano (LXT-16-18).

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
KNO3  Sinopharm Chemical Reagent10017218
KH2PO4 Sinopharm Chemical Reagent10017608
MgSO4·7H2OSinopharm Chemical Reagent10013018
CaCl2·2H2OSinopharm Chemical Reagent20011160
MnSO4·H2O Sinopharm Chemical Reagent10013418
Na2MoO4·2H2OSinopharm Chemical Reagent10019818
Boric AcidSinopharm Chemical Reagent10004818
ZnSO4·7H2OSinopharm Chemical Reagent10024018
CuSO4·5H2OSinopharm Chemical Reagent10008218
CoCl2·6H2OSinopharm Chemical Reagent10007216
KISinopharm Chemical Reagent10017160
FeSO4·7H2OSinopharm Chemical Reagent10012118
EDTA Sinopharm Chemical Reagent10009717
NaOHSinopharm Chemical Reagent10019718
KOHSinopharm Chemical Reagent10017018
SucroseSinopharm Chemical Reagent10021418
Myo-inositol  MACKLINI811835
Nicotinic Acid MACKLINN814565
Pyridoxine HClMACKLINV820447
Thiamine HClMACKLINT818865
GlycineMACKLING800880
Agar powderNovonZZ14022
Fluorescence MicroscopeZeissAxio Zoom V16
Dissecting microscopeSDPTOPSRE-1030
200μl pipetteDragon Laboratory Instruments713111110000-20-200ul
2.5μl pipetteEppendorf3120000011
Fine forceps TWEEZERSST-15
ParafilmPARAFILMPM-996
Stainless steel double-sided bladeGillettePlatinum-Plus Double-Edge Blade

Riferimenti

  1. Grignon, N., Touraine, B., Durand, M. 6(5)Carboxyfluorescein as a tracer of phloem sap translocation. American Journal of Botany. 76, 871-877 (1989).
  2. Wright, K. M., Oparka, K. J. The fluorescent probe HPTS as a phloem-mobile, symplastic tracer: an evaluation using confocal laser scanning microscopy. Journal of Experimental Botany. 47 (3), 439-445 (1996).
  3. Oparka, K. J., Prior, D. A. Movement of Lucifer Yellow CH in potato tuber storage tissues: A comparison of symplastic and apoplastic transport. Planta. 176 (4), 533-540 (1988).
  4. Knoblauch, M., et al. Multispectral Phloem-Mobile Probes: Properties and Applications. Plant Physiology. 167 (4), 1211-1220 (2015).
  5. Oparka, K. J., Duckett, C. M., Prior, D. A. M., Fisher, D. B. Real-time imaging of phloem unloading in the root tip of Arabidopsis. The Plant Journal. 6 (5), 759-766 (1994).
  6. Viola, R., et al. Tuberization in Potato Involves a Switch from Apoplastic to Symplastic Phloem Unloading. The Plant Cell. 13 (2), 385-398 (2001).
  7. Roberts, A. G., et al. Phloem Unloading in Sink Leaves of Nicotiana benthamiana: Comparison of a Fluorescent Solute with a Fluorescent Virus. The Plant Cell. 9 (8), 1381-1396 (1997).
  8. Péron, T., et al. New Insights into Phloem Unloading and Expression of Sucrose Transporters in Vegetative Sinks of the Parasitic Plant Phelipanche ramosa L (Pomel). Frontiers in Plant Science. 7 (2048), (2017).
  9. Spallek, T., et al. Interspecies hormonal control of host root morphology by parasitic plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 114 (20), 5283-5288 (2017).
  10. Complainville, A., et al. Nodule initiation involves the creation of a new symplasmic field in specific root cells of medicago species. The Plant Cell. 15 (12), 2778-2791 (2003).
  11. Bederska, M., Borucki, W., Znojek, E. Movement of fluorescent dyes Lucifer Yellow (LYCH) and carboxyfluorescein (CF) in Medicago truncatula Gaertn. roots and root nodules. Symbiosis. 58 (1-3), 183-190 (2012).
  12. Robards, A. W., Lucas, W. J. Plasmodesmata. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 41 (1), 369-419 (1990).
  13. Roberts, A. G., Oparka, K. J. Plasmodesmata and the control of symplastic transport. Plant, Cell & Environment. 26 (1), 103-124 (2003).
  14. Duckett, C. M., Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Dolan, L., Roberts, K. Dye-coupling in the root epidermis of Arabidopsis is progressively reduced during development. Development. 120 (11), 3247-3255 (1994).
  15. Palevitz, B. A., Hepler, P. K. Changes in dye coupling of stomatal cells of Allium and Commelina demonstrated by microinjection of Lucifer yellow. Planta. 164 (4), 473-479 (1985).
  16. van Bel, A. J. E., Kempers, R. Symplastic isolation of the sieve element-companion cell complex in the phloem of Ricinus communis and Salix alba stems. Planta. 183 (1), 69-76 (1991).
  17. Erwee, M. G., Goodwin, P. B. Symplast domains in extrastelar tissues of Egeria densa Planch. Planta. 163 (1), 9-19 (1985).
  18. Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Wright, K. M. Symplastic communication between primary and developing lateral roots of Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 46 (2), 187-197 (1995).
  19. Christensen, N. M., Faulkner, C., Oparka, K. Evidence for Unidirectional Flow through Plasmodesmata. Plant Physiology. 150 (1), 96-104 (2009).
  20. Wróbel-Marek, J., Kurczyńska, E., Płachno, B. J., Kozieradzka-Kiszkurno, M. Identification of symplasmic domains in the embryo and seed of Sedum acre L. (Crassulaceae). Planta. 245 (3), 491-505 (2017).
  21. Liang, D., White, R. G., Waterhouse, P. M. Gene silencing in Arabidopsis spreads from the root to the shoot, through a gating barrier, by template-dependent, non-vascular, cell to cell movement. Plant Physiology. 159 (3), 984-1000 (2012).
  22. Radford, J. E., White, R. G. Effects of tissue-preparation-induced callose synthesis on estimates of plasmodesma size exclusion limits. Protoplasma. 216 (1-2), 47-55 (2001).
  23. Kollist, H., et al. Rapid Responses to Abiotic Stress: Priming the Landscape for the Signal Transduction Network. Trends in Plant Science. 24 (1), 25-37 (2019).
  24. Haupt, S., Duncan, G. H., Holzberg, S., Oparka, K. J. Evidence for Symplastic Phloem Unloading in Sink Leaves of Barley. Plant Physiology. 125 (1), 209-218 (2001).
  25. Botha, C. E. J., et al. A xylem sap retrieval pathway in rice leaf blades: evidence of a role for endocytosis?. Journal of Experimental Botany. 59 (11), 2945-2954 (2008).

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