Shootward Movement of CFDA Tracer Loaded in the Bottom Sink Tissues of Arabidopsis

Zusammenfassung

Das Ziel dieses Protokolls ist es, zu zeigen, wie man den CFDA in verschiedene Standorte der unteren Teile von Arabidopsis zuladen. Wir stellen dann das resultierende Verteilungsmuster von CF in den Triebe vor.

Zusammenfassung

Der Symplastik-Tracer 5 (6)-carboxyfluorescein Diacetat (CFDA) wurde in lebenden Pflanzen weit verbreitet eingesetzt, um die interzelluläre Verbindung, den Phloemtransport und das Gefäßmuster zu demonstrieren. Dieses Protokoll zeigt die Bewegung von unten nach oben (CF) in der Arabidopsis , indem das Wurzelschneiden bzw. das Hypokotyl-Kipingverfahren verwendet wird. Diese beiden verschiedenen Verfahren führen zu unterschiedlichen Wirkungsgraden der CF-Bewegung: Etwa 91% des Erscheinungsbildes von CF in den Triebe mit dem Hypokotyl-Knicken, während nur etwa 70% des Erscheinungsbildes von CF mit dem Wurzelschneideverfahren. Die einfache Änderung der Ladestationen, die zu erheblichen Veränderungen in der mobilen Effizienz dieses Symplastikfarbstoffs führt, deutet darauf hin, dass CF-Bewegung der Symplastik-Regelung unterliegen könnte, wahrscheinlich durch die Knotenhypokotyl-Kreuzung.

Einleitung

Viele fluoreszierende Tracer mit einer Reihe von spektralen Eigenschaften, wie 5 (6)-carboxyfluorescein (CF)^1,8Hydroxypyren-1,3,3,6-Trisulphonsäure², Luzifer gelb CH (LYCH)³, Esculin und CTER⁴, wurden entwickelt und In Pflanzen zur Überwachung der Bewegung und der Phloem-Aktivität. In der Regel wird ein Symplastikfarbstoff in einen Schnitt im Zielgewebe geladen und die sequenzielle Zerstreuung des Reporters in andere Teile der Anlage wird die interzelluläre Kommunikation demonstrieren. Obwohl der Mechanismus der Farbstoffaufnahme nicht vollständig verstanden ist, ist das Prinzip, das der CF-Bewegung in lebenden Zellen zugrunde liegt, weithin anerkannt. Die Ester-Form von CF (CF Diacetat, CFDA) ist nicht fluoreszierend, aber membrandurchlässig. Diese Eigenschaft ermöglicht eine schnelle Membrandiffusion des Farbstoffs in Zellen. Einmal in lebenden Zellen, intrazelluläre Estoren entfernen die Acetatgruppen an der 3 ' und 6 ' Position der CFDA und lösen die fluoreszierende und membranundurchlässige CF (Abbildung1, alternativ Wright et al.²); CF kann sich dann durch die Plasmodesmata zu anderen Pflanzenteilen bewegen.

Ein etabliertes Verfahren mit CFDA ist, dass es in Quellblätter geladen werden kann und verwendet werden kann, um das Phloem-Streaming und die Phloem-Entladung im Spülgewebe vieler Arten zu überwachen, z.B. wie CF Entladen in der Arabidopsis-Wurzel ⁵, Phloem-Entladung Während der Kartoffeltuberisation⁶, Phloem-Entladung in der Nicotiana-Spüle Blätterblätter⁷, und so weiter. Durch ähnliche Ladeansätze haben andere Studien diesen Farbstoff übernommen, um die symplastische Verbindung zwischen Wirt und Parasit^8,9zudemonstrieren oder die symbiotischen Beziehungen¹⁰, 11 aufzudecken.

Eine andere Möglichkeit, diesen Farbstoff zu verwenden, besteht darin, ihn mittels Mikroinjektion in bestimmte Zellen oder einzelne Zellen zu laden, um sein Verteilungsmuster zu bestimmen. Solche ausgeklügelten Techniken haben unser tieferes Verständnis von plasmodesmata-vermittelter interzellulärer Kommunikation erheblich erleichtert, insbesondere bei der Entwicklung des Konzepts dersymplastischen Domäne 12^,13. Zum Beispiel führte die Mikroinjektion von CFDA in Cotyyledon-Zellen von Arabidopsis zu dem Farbkupplungsmuster in der Hypokotyl-Epidermis, aber ohne Kopplung in den darunterliegenden Zellen oder in der Wurzelepidermis, daher bildet die Hypocotyl-Epidermis eine Symplastik-Domain¹⁴. Ähnliche Domänen, wie die Stomatalwachszellen 15, Siebelement-Begleitzellen 16, Wurzelhaarzellen¹⁴ und Wurzeldeckel 17,18^wurden durch Mikroinjektionstechnik^{identifiziert}. Am erstaunlichsten ist, dass sich einige Domains in eine bestimmte Richtung bewegen können. Nehmen wir zum Beispiel die Trichom-Domäne: Die Mikroinjektion einer Leuchtstoffarzene in die tragende Epidermzellzelle führt zum Tracer-Fluss in die Trichome-Domäne,die Reverse Injektion hält jedoch nicht bei 19. Ein kürzlich veröffentlichter Bericht hat auch ähnliche Situationen in den symplastischen Domänen des Sedum ^Embryo20 gefunden. So implizieren alle oben genannten Fälle, dass der Austausch von Ladestationen zu neuartigen Erkenntnissen in die Symplastik-Kommunikation führen kann. Unser vorheriges Experiment, den Weg des robo-to-shoot mobilen Schweigens zu zerlegen, identifizierte eine neuartige Symplastik-Domäne oder die HEJ-Zone (Hypocotyl-Epicotyl-Knotenpunkt), die durch die Wurzelbelastung (nicht-kanonische Sink-Belastung) CFDA weiter verifiziert wurde. Experiment²¹. Hier erarbeiten wir die Wurzel-zu-Shof-CF-Bewegung mit einer einfachen Methode weiter und erhalten durch die Verschiebung der Ladestationen eine mögliche Symplastik-Domäne. Darüber hinaus kann dieses Verfahren an die Differenzierung genetischer Hintergründe angepasst werden, die den Fernverkehr verändert haben.

Protokoll

1. Arabidopsis vertikales Wachstum im MS-Medium

1. Das Innere des Laminarstromschrankes muss vor dem Gebrauch mit 30 min UV-Licht und 15 Minuten Luftstrom behandelt werden. Achten Sie darauf, die Glastür zu schließen, wenn UV-Licht eingeschaltet ist. Sprühen Sie alle Werkzeuge und Platten mit 70% Ethanol, bevor Sie sie in den Schrank legen.
2. Bereiten Sie das Murashige und Skoog (MS) Medium in einer Standard-Petrischale mit 90 mm Durchmesser unter einem laminaren Fließschrank vor.
   NOTE: Das MS-Medium enthält folgende Komponenten: 20,6 mM NH4 NO₃, 18,8 mM KNO 3, 1.25 mM KH₂PO₄, 1.5 mM MgSO4 · 7H 2 O, 3 mM CaCl₂· 2H2 O, 0,1 mM MnSO₄· H_{2 O,}1.03 μM_Na2MoO₄· 2H_{2 O,}0,1 mM_H3 BO3, 30 μM ZnSO 4 · 7H 2 O, 0,1 μM CuSO4 · 5H 2 O, 0,1 μM CoCl2 · 6H 2 O, 1.39 μM KI, 97, M FeSO4·7H₂O, 114.5 μM Ethylenediaminetetraacetikinsäure (EDTA), 4.07 μM Nikotinic Acid, 2.44 μM Pyridoxin HCl, 0,15 μM Thiamin HCl, 2,68 mM Glycin, 555 μM myo-inositol, 87,7 mM Saccharose und 10 g/L Agar.
3. Die sterilisierten Spitzen oder Zahnstocher anfeuchten, indem Sie die Spitze oder Zahnstocher auf das MS-Medium berühren, dann die sterilisierten Samen einzeln auf die feste Position jedes Petrischellers tauchen, das durch die Aussaatkarte angezeigt wird.
4. Die Petrischale mit Paraffinfolie und Klebeband versiebenhalten und vertikal auf einen klaren Stand in einem Wachstumsraum (22 ° C, 70% Feuchtigkeit) mit einem Tageszyklus von 16 h Licht und 8 h Dunkelheit (Beleuchtung von 6 bis 22 Uhr) legen. Die Arabidopsis-Anlage ist nach der Aussaat am Tag 9-13 für die CFDA-Verladung bereit.
   Achtung: Die folgende Prozedur wird am Nachmittag von 14 bis 17 Uhr durchgeführt.

2. CFDA-Verladung mit dem Wurzelschneideverfahren

1. Bereiten Sie sofort vor dem Einsatz eine neue CFDA-Arbeitslösung vor. Die 1 mM CFDA Lagerlösung, die in-20 ° C Gefrierschrank mit sterilem ultrarem Wasser gelagert ist, verdünnen Sie eine Arbeitskonzentration von 5 μM.
2. Die mikroporöse Paraffin-Membranfolie (siehe Materialtabelle) in kleine Stücke von 3 mm x 3 mm schneiden.
3. Entdecken Sie die wachsenden Pflanzen im Raum bei 22 ° C und löschen Sie die überschüssige Feuchtigkeit mit einem Papiertuch. Legen Sie die kleinen Filmstücke unter jede Wurzel.
   Hinweis: Von diesem bis zu Schritt 2.6 sollte der gesamte Prozess innerhalb von 15 Minuten abgeschlossen sein.
4. Die Pflanzen auf den Petrischülel heben. Schneiden Sie die Wurzeln in einer Position von 5-10 mm unter dem Wurzel-Hypokotyl-Kreuz. Legen Sie den Dreh auf den Film auf das Medium zurück.
5. Unter einem Trennmikroskop werden vorsichtig 0,25 μL CFDA auf das Schneidende jeder Wurzel aufgetragen. Vermeiden Sie es, auf andere Pflanzenteile zu spritzen.
6. Die Platte bedecken und die Pflanzen 2-3 h im Wachstumsraum unter Licht lassen.
7. Spülen Sie die gebeizten Pflanzen dreimal sequenziell in drei separaten Bechern, die mit destilliertem Wasser gefüllt sind, und beobachten Sie dann die Pflanzen unter einem Stereo-Fluoreszenzmikroskop mit Zoom von 1,4 x bis 3,3x (siehe Materialliste). Für die Fluoreszenzerkennung verwenden Sie einen hocheffizienten Filterwürfel (470/20 nm Anregung, 495 nm Split und 525/50 nm Emission), der montiert wird, um das Fluoreszenzsignal zu übertragen.

3. CFDA Verladung mit Hypocotyl-Kneigeverfahren

1. Bereiten Sie sofort vor dem Einsatz eine neue CFDA-Arbeitslösung vor. Die 1 mM CFDA Lagerlösung, die in-20 ° C Gefrierschrank mit sterilem ultrarem Wasser gelagert ist (siehe Materialtabelle), wird auf eine Arbeitskonzentration von 5 μM geparkt.
2. Die mikroporöse Paraffin-Membranfolie (siehe Materialtabelle) in kleine Stücke von 3 mm x 3 mm schneiden.
3. Entdecken Sie die wachsenden Pflanzen im Raum bei 22 ° C und löschen Sie die überschüssige Feuchtigkeit mit einem Papiertuch.
   Hinweis: Von diesem bis zum Schritt 3.7 sollte der gesamte Prozess innerhalb von 15 Minuten abgeschlossen sein.
4. Legen Sie ein kleines Stück Film unter die Wurzel-Hypocotyl-Knotenpunkt jeder Pflanze.
5. Verwenden Sie Zangen, um das Hypokotyl in der Nähe des Wurzel-Hypokotyl-Knokls unter einem sich abgetrennten Mikroskop sanft zu kneifen.
6. Unter einem Abschnittmikroskop vorsichtig 0,1 μL CFDA auf die Wundstelle auftragen. Vermeiden Sie es, auf andere Pflanzenteile zu spritzen.
7. Bedecken Sie die Platte und lassen Sie die Pflanzen unter Licht (22 ° C) für 2-3 h.
8. Spülen Sie die gebeizten Pflanzen dreimal sequenziell in drei separaten Bechern, die mit destilliertem Wasser gefüllt sind, und beobachten Sie dann die Pflanzen unter einem Stereo-Fluoreszenzmikroskop mit Zoom von 1,4 x bis 3,3x (siehe Materialliste). Für die Fluoreszenzerkennung sollten Sie einen hocheffizienten Filterwürfel (470/20 nm Anregung, 495 nm Split und 525/50 nm Emission) montieren, um das Fluoreszenzsignal zu übertragen.

Ergebnisse

Die Bewegung von Symplastic ist häufig Umweltschwankungen unterworfen. Die Störung des Pflanzenanbauzustandes, und auch der Prozess der Gewebeaufbereitung wird die Größe der Ausschlussgrenze von Plasmodesmata beeinflussen, wodurch sichder Symplastik-Transport 22. Um die Färbung zu verbessern, beschränken wir unseren Betrieb auf den Wachstumsraum, in dem Temperatur und Feuchtigkeit streng kontrolliert werden, und führen auch das gesamte Verfahren so schnell w...

Diskussion

Aufstrebende Studien haben gezeigt, dass Pflanzen schnell auf äußere Reize²³reagieren können, einschließlich Manipulationen, diein die experimentellen Verfahren eingeführt werden 22. In unserem ersten Experiment führt unsere Aufsicht über dieses Wissen oft zu einem Ferkeln. Mit diesen Lektionen schlagen wir vor, dass bei der Durchführung dieses Experiments folgende Vorsichtsmaßnahmen im Auge behalten werden: (1) die Samen nach der Ernte sollten in einem Aufbewahrun...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
KNO3	Sinopharm Chemical Reagent	10017218
KH2PO4	Sinopharm Chemical Reagent	10017608
MgSO4·7H2O	Sinopharm Chemical Reagent	10013018
CaCl2·2H2O	Sinopharm Chemical Reagent	20011160
MnSO4·H2O	Sinopharm Chemical Reagent	10013418
Na2MoO4·2H2O	Sinopharm Chemical Reagent	10019818
Boric Acid	Sinopharm Chemical Reagent	10004818
ZnSO4·7H2O	Sinopharm Chemical Reagent	10024018
CuSO4·5H2O	Sinopharm Chemical Reagent	10008218
CoCl2·6H2O	Sinopharm Chemical Reagent	10007216
KI	Sinopharm Chemical Reagent	10017160
FeSO4·7H2O	Sinopharm Chemical Reagent	10012118
EDTA	Sinopharm Chemical Reagent	10009717
NaOH	Sinopharm Chemical Reagent	10019718
KOH	Sinopharm Chemical Reagent	10017018
Sucrose	Sinopharm Chemical Reagent	10021418
Myo-inositol	MACKLIN	I811835
Nicotinic Acid	MACKLIN	N814565
Pyridoxine HCl	MACKLIN	V820447
Thiamine HCl	MACKLIN	T818865
Glycine	MACKLIN	G800880
Agar powder	Novon	ZZ14022
Fluorescence Microscope	Zeiss	Axio Zoom V16
Dissecting microscope	SDPTOP	SRE-1030
200μl pipette	Dragon Laboratory Instruments	713111110000-20-200ul
2.5μl pipette	Eppendorf	3120000011
Fine forceps	TWEEZERS	ST-15
Parafilm	PARAFILM	PM-996
Stainless steel double-sided blade	Gillette	Platinum-Plus Double-Edge Blade