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要約

このプロトコルの目的は、シロイヌナズナの底部の異なるサイトに CFDA をロードする方法を示すことです。次に、シュートで CF の結果の分布パターンを提示します。

要約

Symplastic トレーサー 5 (6)-carboxyfluorescein スジ (CFDA) は、細胞間接続、師部輸送、血管パターニングを実証するために、生きた植物に広く適用されています。このプロトコルは、それぞれルート切断と胚軸の手順を使用して、シロイヌナズナ内の下から上の CARBOXYFLUORESCEIN (CF) の動きを示します。これらの2つの異なる手順は、CF の動きの異なる効率をもたらします: 約 91% 胚軸での芽の CF の外観, 一方、根切断手順で CF の約 70% の外観.ローディングサイトの単純な変更は、この symplastic 染料のモバイル効率の著しい変化をもたらし、CF の動きは、おそらく根胚軸接合部によって、symplastic 規制の対象となるかもしれないことを示唆している。

概要

5 (6)-carboxyfluorescein (CF)1、8-hydroxypyrene-1、3、6-trisulphonic 酸2、ルシファーイエロー CH (LYCH)3、Esculin および結実4などのスペクトル特性の範囲を有する多くの蛍光トレーサーが開発され、symplastic の動きおよび師部の活動を監察するために植物で適用される。一般的には、symplastic 色素を標的組織の切断に装填し、レポーターを植物の他の部分に順次分散させることで、細胞間通信を実証することができます。色素吸収のメカニズムは完全には解明されていないが、生細胞内の CF 運動の根底にある原理は広く認められている。CF (CF スジ、CFDA) のエステル形態は非蛍光性であるが、膜透過性である。この特性は、色素の細胞への迅速な膜拡散を可能にします。生きた細胞の中で一旦、細胞内エステラーゼは、CFDA の 3 ' および 6 ' 位置で酢酸基を除去し、蛍光および膜非透過性 CF を放出する (図 1、またはライト et al.2を参照)。CF は、plasmodesmata を通って植物の他の部分に移動することができます。

CFDA の確立された手順は、それがソースの葉にロードし、多くの種のシンク組織内の師部ストリーミングおよび師部アンロードを監視するために使用することができるということであり、例えば、シロイヌナズナルート5、師部における CF アンロードとして、ジャガイモ tuberization6の間に、 Nicotianaシンク内の師部アンロードは7を残し、というように。同様のローディングアプローチによって、他の研究は、宿主と寄生虫8、9との間の symplastic 接続を実証するためにこの染料を採用し、または共生関係10、11を明らかにする。

この染料を使用する別の方法は、その分布パターンを決定するためにマイクロインジェクションによって特定の細胞または単一細胞にそれをロードすることである。このような洗練された技術は、特に symplastic ドメイン12,13の概念の開発において、plasmodesmata 媒介性細胞間通信に対する我々の深い理解を促進した。例えば、シロイヌナズナの子葉細胞への CFDA のマイクロインジェクションは、胚軸表皮における色素結合パターンをもたらしたが、基になる細胞または根表皮では非カップリングであり、したがって胚軸表皮はsymplastic ドメイン14.同様のドメインは、例えば、気孔ガード細胞15、篩要素−コンパニオンセル 16、根毛細胞14および根キャップ17、18などの微量注入技術によって同定されている。驚くべきことに、一部のドメインでは、トレーサー分子を特定の方向に動かすことができます。トライコームドメインを取るたとえば、支持表皮細胞への蛍光プローブのマイクロインジェクションは、トライコームドメインへのトレーサーの流れにつながりますが、逆注射は真の19を保持しません。最近の報告はまた、セダム胚20の symplastic ドメインにおいて同様の状況を見出した。したがって、上記のすべてのケースは、ローディングサイトのスワップが symplastic コミュニケーションに新たな洞察をもたらす可能性があることを暗示しています。ルート・ツー・シュートのモバイル・サイレンシングの経路を分析することを目的とした以前の実験で、新規の symplastic ドメイン、または HEJ (胚軸-epicotyl ジャンクション) ゾーンを特定し、ルートローディング (非標準のシンクローディング) を通じてさらに検証しました CFDA実験21.ここでは、ロードサイトをシフトすることにより、簡単な方法で symplastic の潜在的なドメインを回復させることにより、ルートツーシュート CF の動きをさらに詳しく説明します。さらに、この手順は、ルートからシュートへの長距離輸送を変更した遺伝的背景を区別するように調整することができる。

プロトコル

1. MS 培地のシロイヌナズナ垂直成長

  1. 層流キャビネットの内部は、使用前に30分の UV 光と15分の気流で処理する必要があります。UV ライトが点灯しているときは、必ずガラス扉を閉めてください。すべての工具とプレートを 70% のエタノールでスプレーしてから、キャビネットに入れます。
  2. Murashige および Skoog (MS) 媒体を層流キャビネットの下の標準的な 90 mm のペトリ皿で準備しなさい。
    注: MS 媒体には、次のコンポーネントが含まれています。 20.6 mm NH4NO3, 18.8 mm KNO3, 1.25 mm KH2PO4, 1.5 MM MgSO4· 7h2o, 3 mM CaCl2· 2h2o, 0.1 mm MnSO4·H2o, 1.03 μ m Na2MoO4・ 2h2o, 0.1 mM H3BO3, 30 μ m ZnSO4・ CuSO 2 o, 0.1μ m 4 ・ 5h 2 o, 0.1 μ m CoCl2・ 6h 2 o, 1.39 μ m KI, 97 μM FeSO4 · 7H2O、114.5 μ m ethylenediaminetetraacetic 酸 (EDTA)、4.07 μ m のニコチン酸、2.44 μ m ピリドキシン hcl、0.15 μ m チアミン hcl、2.68 mm グリシン、555μ m のイノシトール、87.7 mm スクロースおよび 10G/L 寒天。
  3. 先端または爪楊枝を MS 培地に接触させることにより滅菌された先端または爪楊枝に潤いを及ぼし、その後、滅菌された種子を、播種カードによって示される各ペトリ皿の固定位置に1つずつ浸します。
  4. パラフィンフィルムと粘着テープを使用してペトリ皿を密封し、16時間の光の1日周期と8時間の暗闇 (6 am から 10 pm までの照明) で、成長室 (22 ° c、70% の水分) の明確なスタンドに垂直に置きます。シロイヌナズナ工場は播種後9-13 日目に CFDA を装填する準備ができています。
    注: 以下の手順は午後2時から午後5時まで行われます。

2. ルートカット手順による CFDA ローディング

  1. すぐに使用する前に新鮮な CFDA 作業ソリューションを準備します。-20 ° c の冷凍庫に保存された 1 mM CFDA ストック液を5μ m の作業濃度に希釈します。
  2. 微小多孔性パラフィン膜膜 (材料表参照) を 3 mm x 3mm サイズの小片に切ります。
  3. 22° c で部屋で成長している植物を明らかにし、ペーパータオルで余分な水分をクリアします。各ルートの下に小さなフィルムピースを配置します。
    注: これからステップ2.6 に、全体のプロセスは15分以内に完了する必要があります。
  4. ペトリ皿の蓋の上に植物を持ち上げます。根を胚軸ジャンクションの約 5-10 mm 下の位置に切ります。撮影部分をメディア上のフィルムに戻します。
  5. 慎重に解剖顕微鏡の下で各根の切断端に CFDA の0.25 μ l を加えなさい。植物の他の部分に飛散しないようにします。
  6. プレートをカバーし、成長室で 2-3 h (22 ° c) のための光の下に植物を残します。
  7. 染色した植物を蒸留水で満たされた3つのビーカーに3回連続してすすぎ、その後、1.4 x から 3.3 x までのズームを備えたステレオ蛍光顕微鏡下で植物を観察します (材料の表を参照してください)。蛍光検出の場合、高効率フィルタキューブ (470/20 nm 励起、495 nm スプリットおよび 525/50 nm エミッション) を使用して、蛍光シグナルを送信します。

3. 胚軸の CFDA ローディング

  1. すぐに使用する前に新鮮な CFDA 作業ソリューションを準備します。-20 ° c の冷凍庫に保存されている 1 mM CFDA ストック溶液を、滅菌した超純水 (材料表参照) を5μ m の作業濃度に希釈します。
  2. 微小多孔性パラフィン膜膜 (材料表参照) を 3 mm x 3mm サイズの小片に切ります。
  3. 22° c で部屋で成長している植物を明らかにし、ペーパータオルで余分な水分をクリアします。
    注: これからステップ3.7 に、全体のプロセスは15分以内に完了する必要があります。
  4. 各植物の根胚軸接合部の下にフィルムの小片を置きます。
  5. 解剖顕微鏡の下の根胚軸接合部の近くに胚軸を穏やかにつまむように鉗子を使用してください。
  6. 0.1 μ l の CFDA を解剖顕微鏡下の創傷部位に慎重に塗布する。植物の他の部分に飛散しないようにします。
  7. プレートを覆い、2-3 h のために光 (22 ° c) の下に植物を残します。
  8. 染色した植物を蒸留水で満たされた3つのビーカーに3回連続してすすぎ、その後、1.4 x から 3.3 x までのズームを備えたステレオ蛍光顕微鏡下で植物を観察します (材料の表を参照してください)。蛍光検出のために、高効率フィルタキューブ (470/20 nm 励起、495 nm スプリットおよび 525/50 nm エミッション) を搭載し、蛍光信号を透過させる。

結果

Symplastic 運動はしばしば環境変動の対象となる。植物成長状態の摂動、および組織調製のプロセスさえも、plasmodesmata のサイズ排除限界に影響を与え、従って symplastic 輸送22に影響を与える。染色効率を向上させるために、温度と水分が厳重に管理されている成長室での作業を制限し、また、可能な限り迅速に (ペトリ皿の蓋を持ち上げてから10-15 分?...

ディスカッション

新たな研究は、植物が迅速に実験手順22に導入された操作を含む外部刺激23に応答することができることを示している。最初の実験では、この知識の見落としはしばしば染色の失敗につながります。これらのレッスンでは、この実験を行う際に次の注意事項を念頭に置くことをお勧めします。 (1) 収穫後の種子は、低温と低水分に設定された貯蔵庫に保管す?...

開示事項

作者は何も開示することはありません。

謝辞

この研究は中国国家自然科学財団 (31671257) と湖北共同イノベーションセンター (LXT-16-18) によって賄われた。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
KNO3  Sinopharm Chemical Reagent10017218
KH2PO4 Sinopharm Chemical Reagent10017608
MgSO4·7H2OSinopharm Chemical Reagent10013018
CaCl2·2H2OSinopharm Chemical Reagent20011160
MnSO4·H2O Sinopharm Chemical Reagent10013418
Na2MoO4·2H2OSinopharm Chemical Reagent10019818
Boric AcidSinopharm Chemical Reagent10004818
ZnSO4·7H2OSinopharm Chemical Reagent10024018
CuSO4·5H2OSinopharm Chemical Reagent10008218
CoCl2·6H2OSinopharm Chemical Reagent10007216
KISinopharm Chemical Reagent10017160
FeSO4·7H2OSinopharm Chemical Reagent10012118
EDTA Sinopharm Chemical Reagent10009717
NaOHSinopharm Chemical Reagent10019718
KOHSinopharm Chemical Reagent10017018
SucroseSinopharm Chemical Reagent10021418
Myo-inositol  MACKLINI811835
Nicotinic Acid MACKLINN814565
Pyridoxine HClMACKLINV820447
Thiamine HClMACKLINT818865
GlycineMACKLING800880
Agar powderNovonZZ14022
Fluorescence MicroscopeZeissAxio Zoom V16
Dissecting microscopeSDPTOPSRE-1030
200μl pipetteDragon Laboratory Instruments713111110000-20-200ul
2.5μl pipetteEppendorf3120000011
Fine forceps TWEEZERSST-15
ParafilmPARAFILMPM-996
Stainless steel double-sided bladeGillettePlatinum-Plus Double-Edge Blade

参考文献

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