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摘要

该协议的目的是展示如何将 CFDA 加载到拟南芥底部的不同部位。然后给出了在芽中产生的 CF 分布模式。

摘要

对塑性示踪剂 5 (6)-羧基荧光素二乙酸酯 (CFDA) 已广泛应用于活植物中, 以证明细胞间的连接、韧皮部的迁移和血管模式。该方案分别采用根切法和下胚切法显示拟南芥中的底部到顶部羧基荧光素 (cf) 运动。这两个不同的程序导致不同的效率 CF 运动: 约91% 的 CF 出现在芽与下胚轴捏过程, 而只有约70% 的外观 CF 与根切割程序。加载位置的简单变化, 导致这种共生染料的移动效率发生重大变化, 这表明 CF 运动可能受到共生调节的影响, 很可能是由根下胚轴连接。

引言

许多具有光谱特性的荧光示踪剂, 如 5 (6)-羧荧光素 (CF)1、8-羟基苯甲酸1、3、6-三硫基苯甲酸2、路西奥黄 CH(lsch) 3、ES奎因和 cter4, 已经开发出来,应用于植物中, 以监测共体运动和韧皮部的活性。一般情况下, 共生染料被加载到目标组织中的切割中, 记者连续分散到植物的其他部位将证明细胞间的通信。虽然染料吸收的机制还没有得到充分的理解, 但活细胞内 CF 运动的原理已经得到了广泛的认可。CF (CF 二乙酸酯, CFDA) 的酯形态为非荧光, 但膜渗透性。这种特性允许染料快速地将膜扩散到细胞中。一旦进入活细胞, 细胞内酯酶去除 CFDA 3 ' 和 6 ' 位置的醋酸盐基团, 释放荧光和膜不渗透 CF (图 1, 也参考赖特等人 2);然后, CF 可以通过质粒移动到植物的其他部分。

一个既定的程序与 CFDA 是, 它可以加载到源叶, 并用于监测韧皮部流和韧皮部卸载在许多物种的水槽组织, 例如, cf 卸载在拟南芥根5, 韧皮部卸载马铃薯块茎化过程中6、韧皮部卸除在烟叶中, 叶7, 依此类推。通过类似的加载方法, 其他研究采用这种染料来证明宿主和寄生虫8,9之间的共生联系, 或揭示共生关系10,11.

另一种利用这种染料的方法是通过微注射将其加载到特定的细胞或单个细胞中, 以确定其分布模式。这种复杂的技术极大地促进了我们对质粒介导的细胞间通信的更深入理解, 特别是在共生域 12、13 概念的发展过程中。例如, 在拟南芥子叶细胞中注射 cfda 导致下胚轴表皮的染料耦合模式, 但在底层细胞或根表皮中产生非耦合, 因此下胚轴表皮形成共用域14。类似的领域, 如气孔保护细胞15, 筛片元素-伴生细胞16 , 根毛细胞14和根帽17,18已被确定为微注射技术。最令人惊讶的是, 有些领域允许示踪分子向某一方向移动。以滴管域为例, 微注射荧光探针进入支撑表皮细胞, 导致示踪剂流入滴虫域, 但反向注射并不成立 19.最近的一份报告还在Sedum胚胎20的共生域中发现了类似的情况。因此, 所有上述情况都意味着, 交换加载站点可能会导致对共生通信的新见解。我们以前的实验旨在剖析根-拍摄移动沉默的路径确定了一个新的共生域, 或 HEJ (低音节-表观结合部交界处) 区, 这是进一步验证通过根加载 (非规范的正弦加载) CFDA实验21。在这里, 我们进一步阐述根到拍摄 cf 运动使用一个简单的方法, 并通过移动加载站点恢复一个潜在的符号域。此外, 这一程序可以适应区分改变根对镜头长途运输的遗传背景。

研究方案

1. 多发性能级研究中的垂直生长

  1. 层流柜的内部需要在使用前使用30分钟的紫外线和15分钟的气流进行处理。当紫外线亮起时, 请务必关闭玻璃门。在将所有工具和板材放入机柜之前, 请先将其喷洒70% 的乙醇。
  2. 在层流柜下的标准90毫米直径 Petri 培养皿中制备 Murashige 和 Skoog (MS) 介质。
    注: MS 介质包含以下组件: 20.6 mM NH 4no3, 18.8 mm kno 3, 1.25 mmKh 2 po 4, 1.5 mm MgSO 4·7H2 o, 3 mm ccl 2·2H o, 0.1mm mnso4·H2 o, 1.03 μMna 2moo4·2h2H,0.1 Mm h 3bo 3, 30Μm znso 4·7h 2 o, 0.1μm cuso 4·5h 2H, 0.1μm cl 2 ·6h 2o, 1.03 m ki, 97μMM2o, 114.5μm 乙二胺四乙酸 (edta), 4.07 微米烟酸, 2.44 微米吡啶辛酯 glycine, 0.15μm 硫胺素 Glycine, 2.44 mm 甘氨酸, 555 微米肌肌醇, 87.7 mm 蔗糖和 10G/l 琼脂。
  3. 将灭菌的尖端或牙签与 MS 培养基接触, 然后将灭菌的种子一个接一个地浸入播种卡指示的每个培养皿的固定位置, 从而使灭菌的尖端或牙签保湿。
  4. 用石蜡膜和胶带封住 petri 盘, 并将其垂直放置在生长室内的透明支架上 (22°c, 70% 的水分), 白天周期为16小时的光线和8小时的黑暗 (照明时间为早上6点至晚上 10点)。拟南芥工厂已准备好在播种后的第9-13 天装载美国食品和药物管理局。
    注: 下午2点至5点进行以下手术。

2. CFDA 加载与根系切割程序

  1. 在使用前立即准备新的 CFDA 工作解决方案。将储存在-20°c 冷冻机中的 1 mM CFDA 库存溶液稀释至5μm 的工作浓度。
  2. 将微孔石蜡膜 (见材料表) 切割成3毫米 x 3 毫米大小的小块。
  3. 在22°c 的温度下发现房间里生长中的植物, 用纸巾清除多余的水分。将小胶片放在每个根的下方。
    注: 从这一步骤2.6 到步骤 2.6, 整个过程应在15分钟内完成。
  4. 将植物举到培养皿盖上。将根部切割在根-下胚轴交界处下方约5-10 毫米的位置。将拍摄部分重新放到介质上的胶片上。
  5. 在解剖显微镜下, 小心地将 FFDA 的0.25Μl 应用于每个根部的切割端。避免溅到植物的其他部位。
  6. 盖上板材, 将植物放在光线下 2-3小时 (22°C) 的生长室。
  7. 在三个充满蒸馏水的独立烧杯中依次冲洗三次染色植物, 然后在立体荧光显微镜下使用1.4倍至3.3秒的变焦观察这些植物 (见《材料表》)。对于荧光检测, 使用安装的高效滤光片立方体 (470/20 nm 激发、495 nm 分裂和 525/50 纳米发射) 来传输荧光信号。

3. CFDA 负载与低血压夹紧程序

  1. 在使用前立即准备新的 CFDA 工作解决方案。用无菌的超纯水 (见材料表) 将储存在-20°c 冷冻机中的 1 MM cfda 库存溶液稀释至5μm 的工作浓度。
  2. 将微孔石蜡膜 (见材料表) 切割成3毫米 x 3 毫米大小的小块。
  3. 在22°c 的温度下发现房间里生长中的植物, 用纸巾清除多余的水分。
    注: 从这一步到3.7 步, 整个过程应在15分钟内完成。
  4. 在每个植物的根下胚轴结下放置一小块薄膜。
  5. 使用钳子在解剖显微镜下轻轻捏靠近根下胚轴连接点的下胚轴。
  6. 在解剖显微镜下, 小心地将 CFDA 的0.1Μl 涂抹在伤口部位。避免溅到植物的其他部位。
  7. 盖上盘子, 让植物在光线 (22°c) 下保持2-3小时。
  8. 在三个充满蒸馏水的独立烧杯中依次冲洗三次染色植物, 然后在立体荧光显微镜下使用1.4倍至3.3秒的变焦观察这些植物 (见《材料表》)。对于荧光检测, 安装高效滤光片立方体 (470/20 nm 激发、495 nm 分裂和 525/50 纳米发射) 来传输荧光信号。

结果

共变运动往往受到环境波动的影响。植物生长状态的扰动, 甚至组织制备过程都会影响质粒的大小排除极限, 从而影响共生体的迁移 22.为了提高染色效率, 我们将操作限制在温度和湿度受到严格控制的生长室内, 并尽快执行整个过程 (最好是在提升培养皿盖后10-15 内)。在实验中的这些预防措施可以有效地降低不成功的拍摄染色率。

讨论

新出现的研究表明, 植物可以对外部刺激23迅速作出反应, 包括在实验程序中引入的操作22。在我们最初的实验中, 我们对这些知识的监督往往导致染色失败。通过这些教训, 我们建议在进行本实验时应注意以下预防措施: (1) 收获后的种子应存放在低温、低水分的储物柜中;(2) 操纵植物, 特别是暴露在柜子里的空气中, 应保持在最低限度;(3) 实验条件应保持不变, 例如...

披露声明

作者没有什么可透露的。

致谢

这项工作由国家自然科学基金 (31671257) 和湖北粮食产业合作创新中心 (LXT-16-16-18) 资助。

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
KNO3  Sinopharm Chemical Reagent10017218
KH2PO4 Sinopharm Chemical Reagent10017608
MgSO4·7H2OSinopharm Chemical Reagent10013018
CaCl2·2H2OSinopharm Chemical Reagent20011160
MnSO4·H2O Sinopharm Chemical Reagent10013418
Na2MoO4·2H2OSinopharm Chemical Reagent10019818
Boric AcidSinopharm Chemical Reagent10004818
ZnSO4·7H2OSinopharm Chemical Reagent10024018
CuSO4·5H2OSinopharm Chemical Reagent10008218
CoCl2·6H2OSinopharm Chemical Reagent10007216
KISinopharm Chemical Reagent10017160
FeSO4·7H2OSinopharm Chemical Reagent10012118
EDTA Sinopharm Chemical Reagent10009717
NaOHSinopharm Chemical Reagent10019718
KOHSinopharm Chemical Reagent10017018
SucroseSinopharm Chemical Reagent10021418
Myo-inositol  MACKLINI811835
Nicotinic Acid MACKLINN814565
Pyridoxine HClMACKLINV820447
Thiamine HClMACKLINT818865
GlycineMACKLING800880
Agar powderNovonZZ14022
Fluorescence MicroscopeZeissAxio Zoom V16
Dissecting microscopeSDPTOPSRE-1030
200μl pipetteDragon Laboratory Instruments713111110000-20-200ul
2.5μl pipetteEppendorf3120000011
Fine forceps TWEEZERSST-15
ParafilmPARAFILMPM-996
Stainless steel double-sided bladeGillettePlatinum-Plus Double-Edge Blade

参考文献

  1. Grignon, N., Touraine, B., Durand, M. 6(5)Carboxyfluorescein as a tracer of phloem sap translocation. American Journal of Botany. 76, 871-877 (1989).
  2. Wright, K. M., Oparka, K. J. The fluorescent probe HPTS as a phloem-mobile, symplastic tracer: an evaluation using confocal laser scanning microscopy. Journal of Experimental Botany. 47 (3), 439-445 (1996).
  3. Oparka, K. J., Prior, D. A. Movement of Lucifer Yellow CH in potato tuber storage tissues: A comparison of symplastic and apoplastic transport. Planta. 176 (4), 533-540 (1988).
  4. Knoblauch, M., et al. Multispectral Phloem-Mobile Probes: Properties and Applications. Plant Physiology. 167 (4), 1211-1220 (2015).
  5. Oparka, K. J., Duckett, C. M., Prior, D. A. M., Fisher, D. B. Real-time imaging of phloem unloading in the root tip of Arabidopsis. The Plant Journal. 6 (5), 759-766 (1994).
  6. Viola, R., et al. Tuberization in Potato Involves a Switch from Apoplastic to Symplastic Phloem Unloading. The Plant Cell. 13 (2), 385-398 (2001).
  7. Roberts, A. G., et al. Phloem Unloading in Sink Leaves of Nicotiana benthamiana: Comparison of a Fluorescent Solute with a Fluorescent Virus. The Plant Cell. 9 (8), 1381-1396 (1997).
  8. Péron, T., et al. New Insights into Phloem Unloading and Expression of Sucrose Transporters in Vegetative Sinks of the Parasitic Plant Phelipanche ramosa L (Pomel). Frontiers in Plant Science. 7 (2048), (2017).
  9. Spallek, T., et al. Interspecies hormonal control of host root morphology by parasitic plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 114 (20), 5283-5288 (2017).
  10. Complainville, A., et al. Nodule initiation involves the creation of a new symplasmic field in specific root cells of medicago species. The Plant Cell. 15 (12), 2778-2791 (2003).
  11. Bederska, M., Borucki, W., Znojek, E. Movement of fluorescent dyes Lucifer Yellow (LYCH) and carboxyfluorescein (CF) in Medicago truncatula Gaertn. roots and root nodules. Symbiosis. 58 (1-3), 183-190 (2012).
  12. Robards, A. W., Lucas, W. J. Plasmodesmata. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology. 41 (1), 369-419 (1990).
  13. Roberts, A. G., Oparka, K. J. Plasmodesmata and the control of symplastic transport. Plant, Cell & Environment. 26 (1), 103-124 (2003).
  14. Duckett, C. M., Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Dolan, L., Roberts, K. Dye-coupling in the root epidermis of Arabidopsis is progressively reduced during development. Development. 120 (11), 3247-3255 (1994).
  15. Palevitz, B. A., Hepler, P. K. Changes in dye coupling of stomatal cells of Allium and Commelina demonstrated by microinjection of Lucifer yellow. Planta. 164 (4), 473-479 (1985).
  16. van Bel, A. J. E., Kempers, R. Symplastic isolation of the sieve element-companion cell complex in the phloem of Ricinus communis and Salix alba stems. Planta. 183 (1), 69-76 (1991).
  17. Erwee, M. G., Goodwin, P. B. Symplast domains in extrastelar tissues of Egeria densa Planch. Planta. 163 (1), 9-19 (1985).
  18. Oparka, K. J., Prior, D. A. M., Wright, K. M. Symplastic communication between primary and developing lateral roots of Arabidopsis thaliana. Journal of Experimental Botany. 46 (2), 187-197 (1995).
  19. Christensen, N. M., Faulkner, C., Oparka, K. Evidence for Unidirectional Flow through Plasmodesmata. Plant Physiology. 150 (1), 96-104 (2009).
  20. Wróbel-Marek, J., Kurczyńska, E., Płachno, B. J., Kozieradzka-Kiszkurno, M. Identification of symplasmic domains in the embryo and seed of Sedum acre L. (Crassulaceae). Planta. 245 (3), 491-505 (2017).
  21. Liang, D., White, R. G., Waterhouse, P. M. Gene silencing in Arabidopsis spreads from the root to the shoot, through a gating barrier, by template-dependent, non-vascular, cell to cell movement. Plant Physiology. 159 (3), 984-1000 (2012).
  22. Radford, J. E., White, R. G. Effects of tissue-preparation-induced callose synthesis on estimates of plasmodesma size exclusion limits. Protoplasma. 216 (1-2), 47-55 (2001).
  23. Kollist, H., et al. Rapid Responses to Abiotic Stress: Priming the Landscape for the Signal Transduction Network. Trends in Plant Science. 24 (1), 25-37 (2019).
  24. Haupt, S., Duncan, G. H., Holzberg, S., Oparka, K. J. Evidence for Symplastic Phloem Unloading in Sink Leaves of Barley. Plant Physiology. 125 (1), 209-218 (2001).
  25. Botha, C. E. J., et al. A xylem sap retrieval pathway in rice leaf blades: evidence of a role for endocytosis?. Journal of Experimental Botany. 59 (11), 2945-2954 (2008).

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