Mouvement de la fusillade du traceur CFDA chargé dans les tissus de l’évier inférieur de l' Arabidopsis

Résumé

Le but de ce protocole est de montrer comment charger la CFDA dans différents sites des parties inférieures de l' Arabidopsis. Nous présentons ensuite le modèle de distribution de CF dans les pousses.

Résumé

Le traceur symplastique 5 (6)-carboxyfluorescéine diacétate (CFDA) a été largement appliqué dans les plantes vivantes pour démontrer la connexion intercellulaire, le transport de phloème et le modelage vasculaire. Ce protocole montre le mouvement de la carboxyfluorescéine de bas en haut (CF) dans l' Arabidopsis à l’aide de la procédure de découpage des racines et de l’hypocotyle-pincement respectivement. Ces deux procédures différentes résultent en différentes efficacités du mouvement des FC: environ 91% de l’apparition de CF dans les pousses avec la procédure d’hypocotyle-pincement, alors que seulement environ 70% de l’apparition de CF avec la procédure de coupe des racines. Le simple changement des sites de chargement, entraînant des changements significatifs dans l’efficacité mobile de ce colorant symplastique, suggère que le mouvement des FC pourrait être soumis à la régulation symplasique, probablement par la jonction racine-hypocotyle.

Introduction

De nombreux traceurs fluorescents avec une gamme de propriétés spectrales, comme l’acide 5 (6)-carboxyfluorescéine (CF) 1,8-hydroxypyrène-1, 3, 6-trisulphonique², Lucifer Yellow ch (Lych)³, esculine et cter⁴, ont été développés et appliqué dans les plantes pour surveiller le mouvement symplastique et l’activité de phloème. En général, un colorant symplastique est chargé dans une coupe dans le tissu cible et la dispersion séquentielle du reporter dans d’autres parties de la plante démontrera la communication intercellulaire. Bien que le mécanisme d’absorption des colorants ne soit pas pleinement compris, le principe sous-jacent du mouvement des FC à l’intérieur des cellules vivantes a été largement reconnu. La forme ester de CF (diacétate des FC, CFDA) est non-fluorescente, mais perméable à la membrane. Cette propriété permet la diffusion rapide de la membrane du colorant dans les cellules. Une fois à l’intérieur des cellules vivantes, les estérases intracellulaires éliminent les groupes d’acétate à la position 3 'et 6 'de la CFDA, libérant les CF fluorescentes et imperméables à la membrane (figure 1, alternativement, Wright et al.²); Les FC peuvent alors se déplacer à travers les plasmodesmes vers d’autres parties de plantes.

Une procédure bien établie avec CFDA est qu’il peut être chargé dans les feuilles de source et utilisé pour surveiller le streaming phloème et le déchargement du phloème dans les tissus de l’évier de nombreuses espèces, par exemple, comme le déchargement des FC dans la racine Arabidopsis ⁵, le déchargement phloème pendant la tuberisation de la pomme de terre⁶, le déchargement du phloème dans l’évier Nicotiana laisse⁷, et ainsi de suite. Par des approches de chargement similaires, d’autres études ont adopté ce colorant pour démontrer la liaison symplasique entre l’hôte et le parasite^8,9, ou pour révéler les relations symbiotiques^10,11.

Une autre façon de faire usage de ce colorant est de le charger dans des cellules spécifiques ou une seule cellule par microinjection pour déterminer son modèle de distribution. De telles techniques sophistiquées ont grandement facilité notre compréhension plus approfondie de la communication intercellulaire médiée par plasmodesmata, en particulier dans le développement du concept de domaine symplastique^12,13. Par exemple, la microinjection de CFDA dans les cellules de cotylédons de l' Arabidopsis a entraîné le modèle de couplage de colorant dans l’épiderme de l’hypocotyle, mais sans couplage dans les cellules sous-jacentes ou dans l’épiderme des racines, par conséquent l’épiderme hypocotyle forme une domaine symplastique¹⁴. Des domaines similaires, tels que les cellules de la garde stomatale¹⁵, les cellules de l’élément-compagnon¹⁶, les cellules capillaires¹⁴ et la coiffe des racines^17,18 ont été identifiés par la technique de la microinjection. Le plus surprenant, certains domaines permettent aux molécules traceurs de se déplacer dans une certaine direction. Prenez le domaine de trichome par exemple, la microinjection d’une sonde fluorescente dans la cellule épidermique de soutien conduit au flux de traceur dans le domaine de trichome, cependant, l’injection inverse ne tient pas vrai¹⁹. Un rapport récent a également trouvé des situations similaires dans les domaines symplasiques de l’embryon Sedum ²⁰. Ainsi, tous les cas ci-dessus impliquent que l’échange de sites de chargement peut conduire à de nouveaux aperçus de la communication symplastique. Notre expérience précédente visant à disséquer la voie du silençage mobile de la racine à la pousse a identifié un nouveau domaine symplastique, ou la zone Hej (hypocotyle-épicotyle), qui a été vérifiée par le chargement des racines (chargement de l’évier non canonique) CFDA l’expérience²¹. Ici, nous élaborons en outre le mouvement de la racine à la pousse des FC en utilisant une méthode simple et de récupérer un domaine symplastique potentiel en déplaçant les sites de chargement. En outre, cette procédure peut être adaptée pour différencier les antécédents génétiques qui ont modifié le transport de longue distance de la racine à la pousse.

Protocole

1. Arabidopsis croissance verticale dans le milieu MS

1. L’intérieur de l’armoire à écoulement laminaire doit être traité avec 30 min de lumière UV et 15 min d’air avant utilisation. Assurez-vous de fermer la porte vitrée lorsque la lumière UV est allumé. Vaporisez tous les outils et plaques avec 70% d’éthanol avant de les placer dans l’armoire.
2. Préparer le milieu Murashige et Skoog (MS) dans une boîte de Petri standard de 90 mm de diamètre sous une armoire à flux laminaire.
   NOTE: le médium MS contient les éléments suivants: 20,6 mM NH₄no₃, 18,8 mm kno₃, 1,25 mm KH₂po₄, 1,5 mM MgSO₄· 7H₂o, 3 mm CaCl₂· 2H₂o, 0,1 mm MnSO₄· H₂o, 1,03 μM na₂Moo₄· 2H₂o, 0,1 mm H₃Bo₃, 30 μm ZnSO₄· 7h₂o, 0,1 μM CUSO₄· 5h₂o, 0,1 μM COCl₂· 6H₂o, 1,39 μm Ki, 97 μ M FeSO4 · 7H₂O, 114,5 μM d’acide éthylenediaminetétraacétique (EDTA), 4,07 μM d’acide nicotinique, 2,44 μM de pyridoxine hcl, 0,15 μm de thiamine hcl, 2,68 mm de glycine, 555 μm de myo-inositol, 87,7 mm de saccharose et 10 g/L de gélose.
3. Hydrater les pointes stérilisées ou les cure-dents en touchant la pointe ou les cure-dents au milieu MS, puis tremper les graines stérilisées une par une sur la position fixe de chaque boîte de Petri indiquée par la carte de semis.
4. Sceller la boîte de Petri avec du film de paraffine et du ruban adhésif et la placer verticalement sur un stand clair dans une salle de croissance (22 ° c, 70% d’humidité) avec un cycle de jour de 16 h de lumière et 8 h d’obscurité (éclairage de 6 heures à 22 heures). L’usine Arabidopsis est prête pour le chargement CFDA le jour 9-13 après le semis.
   Remarque: la procédure suivante est effectuée dans l’après-midi de 14h à 17h.

2. chargement CFDA avec la procédure de découpe de la racine

1. Préparez une solution de travail CFDA fraîche immédiatement avant utilisation. Diluer la solution stock de 1 mM de CFDA stockée dans un congélateur de-20 ° c avec de l’eau ultrapure stérile à une concentration de travail de 5 μM.
2. Coupez le film microporeux de la membrane de paraffine (voir tableau des matériaux) en petits morceaux de 3 mm x 3 mm de diamètre.
3. Découvrez les plantes qui poussent dans la pièce à 22 ° c et effacez l’excès d’humidité avec une serviette en papier. Placez les petits morceaux de film sous chaque racine.
   NOTE: de ceci à l’étape 2,6, l’ensemble du processus devrait être complété dans les 15 min.
4. Soulever les plantes sur le couvercle de la boîte de Petri. Coupez les racines dans une position d’environ 5-10 mm sous la jonction racine-hypocotyle. Replacez la partie de tournage sur le film sur le support.
5. Appliquer avec précaution 0,25 μL de CFDA sur l’extrémité de coupe de chaque racine sous un microscope disséant. Évitez d’éclabousser les autres parties de la plante.
6. Couvrir la plaque et laisser les plantes sous la lumière pour 2-3 h (22 ° c) dans la salle de croissance.
7. Rincez les plantes colorées trois fois séquentiellement dans trois béchers distincts remplis d’eau distillée, puis observez les plantes sous un microscope stéréo-fluorescence avec un zoom de 1,4 x à 3,3 x (voir le tableau des matériaux). Pour la détection de fluorescence, utilisez un cube filtrant à haut rendement (excitation 470/20 nm, 495 nm divisé et 525/50 nm émission) monté pour transmettre le signal de fluorescence.

3. chargement CFDA avec procédure d’hypocotyle-pincement

1. Préparez une solution de travail CFDA fraîche immédiatement avant utilisation. Diluer la solution de stock de 1 mM de CFDA stockée dans un congélateur de-20 ° c avec de l’eau ultrapure stérile (voir le tableau des matériaux) à une concentration de travail de 5 μm.
2. Coupez le film microporeux de la membrane de paraffine (voir tableau des matériaux) en petits morceaux de 3 mm x 3 mm de diamètre.
3. Découvrez les plantes qui poussent dans la pièce à 22 ° c et effacez l’excès d’humidité avec une serviette en papier.
   NOTE: de ceci à l’étape 3,7, l’ensemble du processus devrait être complété dans les 15 min.
4. Poser un petit morceau de film sous la jonction racine-hypocotyle de chaque plante.
5. Utiliser forceps pour pincer doucement l’hypocotyle près de la jonction racine-hypocotyle sous un microscope disséçant.
6. Appliquer avec précaution 0,1 μL de CFDA sur le site de la plaie sous un microscope disséant. Évitez d’éclabousser les autres parties de la plante.
7. Recouvrir la plaque et laisser les plantes sous la lumière (22 ° c) pour 2-3 h.
8. Rincez les plantes colorées trois fois séquentiellement dans trois béchers distincts remplis d’eau distillée, puis observez les plantes sous un microscope stéréo-fluorescence avec un zoom de 1,4 x à 3,3 x (voir le tableau des matériaux). Pour la détection de fluorescence, montez un cube filtrant à haut rendement (excitation 470/20 nm, 495 nm divisé et 525/50 nm émission) pour transmettre le signal de fluorescence.

Résultats

Le mouvement symplastic est souvent soumis à des fluctuations environnementales. Perturbation de l’état de culture de la plante, et même le processus de préparation tissulaire affectera la limite d’exclusion de la taille des plasmodesmes, affectant ainsi le transport symplastique²². Pour améliorer l’efficacité de coloration, nous limitons notre fonctionnement dans la salle de croissance, où la température et l’humidité est étroitement contrôlée,...

Discussion

Des études émergentes ont montré que les plantes peuvent réagir rapidement aux stimuli externes²³, y compris la manipulation introduite dans les procédures expérimentales²². Dans notre expérience initiale, notre surveillance de cette connaissance conduit souvent à l’échec de coloration. Avec ces leçons, nous suggérons que les précautions suivantes doivent être maintenues à l’esprit lors de l’exécution de cette expérience: (1) les semences après la ré...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
KNO3	Sinopharm Chemical Reagent	10017218
KH2PO4	Sinopharm Chemical Reagent	10017608
MgSO4·7H2O	Sinopharm Chemical Reagent	10013018
CaCl2·2H2O	Sinopharm Chemical Reagent	20011160
MnSO4·H2O	Sinopharm Chemical Reagent	10013418
Na2MoO4·2H2O	Sinopharm Chemical Reagent	10019818
Boric Acid	Sinopharm Chemical Reagent	10004818
ZnSO4·7H2O	Sinopharm Chemical Reagent	10024018
CuSO4·5H2O	Sinopharm Chemical Reagent	10008218
CoCl2·6H2O	Sinopharm Chemical Reagent	10007216
KI	Sinopharm Chemical Reagent	10017160
FeSO4·7H2O	Sinopharm Chemical Reagent	10012118
EDTA	Sinopharm Chemical Reagent	10009717
NaOH	Sinopharm Chemical Reagent	10019718
KOH	Sinopharm Chemical Reagent	10017018
Sucrose	Sinopharm Chemical Reagent	10021418
Myo-inositol	MACKLIN	I811835
Nicotinic Acid	MACKLIN	N814565
Pyridoxine HCl	MACKLIN	V820447
Thiamine HCl	MACKLIN	T818865
Glycine	MACKLIN	G800880
Agar powder	Novon	ZZ14022
Fluorescence Microscope	Zeiss	Axio Zoom V16
Dissecting microscope	SDPTOP	SRE-1030
200μl pipette	Dragon Laboratory Instruments	713111110000-20-200ul
2.5μl pipette	Eppendorf	3120000011
Fine forceps	TWEEZERS	ST-15
Parafilm	PARAFILM	PM-996
Stainless steel double-sided blade	Gillette	Platinum-Plus Double-Edge Blade