Movimiento de shootward de CFDA Tracer cargado en los tejidos de sumidero inferior de Arabidopsis

Resumen

El objetivo de este protocolo es mostrar cómo cargar el CFDA en diferentes sitios de las partes inferiores de Arabidopsis. A continuación, presentamos el patrón de distribución resultante de CF en los brotes.

Resumen

El marcador simplástica 5 (6)-carboxyfluorescein diacetato (CFDA) se ha aplicado ampliamente en plantas vivas para demostrar la conexión intercelular, el transporte de floema y los patrones vasculares. Este protocolo muestra el movimiento carboxyfluorescein (CF) de abajo a arriba en la Arabidopsis utilizando el procedimiento de corte de la raíz y del hipocotilo-pinching respectivamente. Estos dos procedimientos diferentes resultan en diferentes eficiencias del movimiento CF: alrededor del 91% de aparición de CF en los brotes con el procedimiento hipocotilo-pinching, mientras que sólo alrededor del 70% de la aparición de la CF con el procedimiento de corte de la raíz. El simple cambio de los sitios de carga, lo que resulta en cambios significativos en la eficiencia móvil de este tinte simplástica, sugiere movimiento CF podría estar sujeto a la regulación simplástica, muy probablemente por la Unión raíz-hipocotilo.

Introducción

Muchos trazadores fluorescentes con una gama de propiedades espectrales, tales como 5 (6)-carboxifluoresceina (CF)¹, 8-hidroxiypyrene-1, 3, 6-ácido trisulfónico², Lucifer Yellow CH (lych)³, Esculin y cter⁴, se han desarrollado y aplica en plantas para monitorear el movimiento simplásico y la actividad del floema. Generalmente, un tinte simplástica se carga en un corte en el tejido objetivo y la dispersión secuencial del reportero en otras partes de la planta demostrará la comunicación intercelular. Aunque el mecanismo de absorción del tinte no se entiende completamente, el principio subyacente del movimiento CF dentro de las células vivas ha sido ampliamente reconocido. La forma de éster de CF (Diacetato de CF, CFDA) es no fluorescente, pero permeable a la membrana. Esta propiedad permite la rápida difusión de la membrana del tinte en las células. Una vez dentro de las células vivas, las esterasas intracelulares eliminan los grupos de acetato en la posición 3 ' y 6 ' de CFDA, liberando el CF fluorescente y impermeable a la membrana (figura 1, alternativamente referir a Wright et al.²); El CF puede entonces desplazarse a través de los plasmodesmata a otras partes de las plantas.

Un procedimiento bien establecido con CFDA es que se puede cargar en hojas de origen y se utiliza para monitorear la transmisión de floema y la descarga de floema en los tejidos de fregadero de muchas especies, por ejemplo, como descarga de CF en la raíz de Arabidopsis ⁵, floema descarga durante la tuberización de patata⁶, descarga de floema en el fregadero Nicotiana hojas⁷, y así sucesivamente. Mediante enfoques de carga similares, otros estudios han adoptado este tinte para demostrar la conexión simplástica entre el huésped y el parásito^8,9, o para revelar las relaciones simbióticas^10,11.

Otra forma de hacer uso de este tinte es cargarlo en celdas específicas o una sola célula por microinyección para determinar su patrón de distribución. Estas técnicas sofisticadas han facilitado en gran medida nuestra comprensión más profunda de la comunicación intercelular mediada por plasmodesmata, particularmente en el desarrollo del concepto de dominio simplástica^12,13. Por ejemplo, la microinyección de CFDA en células de cotiledón de Arabidopsis dio como resultado el patrón de acoplamiento de tinte en la epidermis de hipocotilo pero no acoplamiento en las células subyacentes o en la epidermis de la raíz, por lo tanto, la epidermis hipocotilo forma un dominio simplástica¹⁴. Dominios similares, tales como las células de la Guardia estomas¹⁵, elemento de tamiz-células acompañantes¹⁶, células de pelo raíz¹⁴ y casquillo de raíz^17,18 han sido identificados por la técnica de microinyección. Sorprendentemente, algunos dominios permiten que las moléculas trazadoras se muevan en una dirección determinada. Por ejemplo, tomar el dominio de tricomas, la microinyección de una sonda fluorescente en la célula epidérmica de soporte conduce al flujo de trazador en el dominio de tripeme, sin embargo, la inyección inversa no es verdadera¹⁹. Un informe reciente también ha encontrado situaciones similares en los dominios symplásicos del embrión²⁰de Sedum . Por lo tanto, todos los casos anteriores implican que el intercambio de sitios de carga puede conducir a nuevas perspectivas en la comunicación simplástica. Nuestro experimento anterior con el objetivo de diseccionar la ruta del silenciamiento móvil de raíz a disparo identificó un nuevo dominio simplástica, o la zona Hej (Unión hipocotil-epicotilo), que se verificó aún más a través de la carga de la raíz (carga de sumidero no canónico) CFDA experimento²¹. Aquí, elaboramos aún más el movimiento CF de raíz a disparo usando un método simple y recuperando un potencial dominio simplástica desplazando los sitios de carga. Además, este procedimiento puede ser adaptado para diferenciar los antecedentes genéticos que han alterado el transporte de larga distancia de raíz a brote.

Protocolo

1. crecimiento vertical de Arabidopsis en media MS

1. El interior del gabinete de flujo laminar debe tratarse con 30 min de luz UV y 15 minutos de flujo de aire antes de su uso. Asegúrese de cerrar la puerta de cristal cuando la luz UV esté encendida. Pulverizar todas las herramientas y placas con etanol al 70% antes de colocarlas en el gabinete.
2. Prepare el medio Murashige y Skoog (MS) en una placa de Petri estándar de 90 mm de diámetro bajo un gabinete de flujo laminar.
   Nota: el MS Medium contiene los siguientes componentes: 20,6 mM NH₄no₃, 18,8 mm kno₃, 1,25 mm KH₂po₄, 1,5 mm MgSO₄· 7H₂o, 3 mm CaCl₂· 2H₂o, 0,1 mm MnSO₄· H₂o, 1,03 μm na₂Moo₄· 2H₂o, 0,1 mm H₃Bo₃, 30 ΜM ZnSO₄· 7H₂o, 0,1 μm CUSO₄· 5h₂O, 0,1 μm CoCl₂· 6H₂o, 1,39 μm Ki, 97 μ M FeSO4 · 7H₂O, 114,5 μm ácido ethylenediaminetetraacético (EDTA), 4,07 μm ácido nicotínico, 2,44 μm piridoxina hcl, 0,15 μm tiamina hcl, 2,68 mm glicina, 555 μm myo-inositol, 87,7 mm sacarosa y 10 g/L agar.
3. Hidratar las puntas esterilizadas o palillos de dientes tocando la punta o palillos de dientes al medio MS, luego sumergir las semillas esterilizadas una por una en la posición fija de cada placa de Petri indicada por la tarjeta de siembra.
4. Selle la placa de Petri con película de parafina y cinta adhesiva y colóquelo verticalmente sobre un soporte transparente en una sala de crecimiento (22 ° c, 70% de humedad) con un ciclo de día de 16 h de luz y 8 h de oscuridad (iluminación de 6 AM a 10 PM). La planta de Arabidopsis está preparada para la carga de CFDA el día 9-13 después de la siembra.
   Nota: el siguiente procedimiento se realiza por la tarde de 2 pm a 5 pm.

2. la carga de CFDA con el procedimiento de corte de raíz

1. Prepare una nueva solución de trabajo de CFDA inmediatamente antes de su uso. Diluir la solución de stock de 1 mM de CFDA almacenada en un congelador de-20 ° c con agua ultrapura estéril a una concentración de trabajo de 5 μM.
2. Cortar la película de membrana de parafina microporosa (ver tabla de materiales) en pequeñas piezas de 3 mm x 3 mm de tamaño.
3. Descubra las plantas en crecimiento en la habitación a 22 ° c y borre el exceso de humedad con una toalla de papel. Coloque las pequeñas piezas de película debajo de cada raíz.
   Nota: de esto al paso 2,6, todo el proceso debe completarse dentro de 15 min.
4. Levante las plantas en la tapa del plato de Petri. Cortar las raíces en una posición de unos 5-10 mm por debajo de la Unión de la raíz-hipocotilo. Vuelva a colocar la parte de rodaje en la película en el medio.
5. Aplicar cuidadosamente 0,25 μL de CFDA en el extremo de corte de cada raíz bajo un microscopio de disección. Evite salpicar a otras partes de la planta.
6. Cubra la placa y deje las plantas bajo luz durante 2-3 h (22 ° c) en la sala de crecimiento.
7. Enjuague las plantas teñidas tres veces secuencialmente en tres vasos de precipitados separados llenos de agua destilada, luego Observe las plantas bajo un microscopio de fluorescencia estéreo con zoom de 1.4 x a 3.3 x (consulte la tabla de materiales). Para la detección de fluorescencia, utilice un cubo de filtro de alta eficiencia (excitación de 470/20 nm, División de 495 nm y emisión de 525/50 nm) montado para transmitir la señal de fluorescencia.

3. CFDA carga con procedimiento de hipocotilo-pinching

1. Prepare una nueva solución de trabajo de CFDA inmediatamente antes de su uso. Diluir la solución de stock de 1 mM de CFDA almacenada en un congelador de-20 ° c con agua ultrapura estéril (consulte la tabla de materiales) a una concentración de trabajo de 5 μm.
2. Cortar la película de membrana de parafina microporosa (ver tabla de materiales) en pequeñas piezas de 3 mm x 3 mm de tamaño.
3. Descubra las plantas en crecimiento en la habitación a 22 ° c y borre el exceso de humedad con una toalla de papel.
   Nota: de esto al paso 3,7, todo el proceso debe completarse dentro de 15 min.
4. Coloque una pequeña pieza de película bajo el cruce de la raíz-hipocotilo de cada planta.
5. Utilice fórceps para pellizcar suavemente el hipocotilo cerca de la Unión raíz-hipocotilo bajo un microscopio diseccionante.
6. Aplicar cuidadosamente 0,1 μL de CFDA en el sitio de la herida bajo un microscopio de disección. Evite salpicar a otras partes de la planta.
7. Cubrir la placa, y dejar las plantas bajo la luz (22 ° c) para 2-3 h.
8. Enjuague las plantas teñidas tres veces secuencialmente en tres vasos de precipitados separados llenos de agua destilada, luego Observe las plantas bajo un microscopio de fluorescencia estéreo con zoom de 1.4 x a 3.3 x (consulte la tabla de materiales). Para la detección de fluorescencia, Monte un cubo de filtro de alta eficiencia (excitación de 470/20 nm, División de 495 nm y emisión de 525/50 nm) para transmitir la señal de fluorescencia.

Resultados

El movimiento symplastic a menudo está sujeto a fluctuaciones ambientales. La perturbación del estado de cultivo de la planta, e incluso el proceso de preparación de tejido afectará el límite de exclusión de tamaño de plasmodesmata, afectando así el transporte simplástica²². Para mejorar la eficiencia de la tinción, limitamos nuestra operación en la sala de crecimiento, donde la temperatura y la humedad están estrechamente controladas, y también realiz...

Discusión

Los estudios emergentes han demostrado que las plantas pueden responder rápidamente a los estímulos externos²³, incluida la manipulación introducida en los procedimientos experimentales²². En nuestro experimento inicial, nuestra supervisión de este conocimiento a menudo conduce a la falta de manchas. Con estas lecciones, sugerimos que se tengan en cuenta las siguientes precauciones al realizar este experimento: (1) las semillas después de la cosecha deben mantenerse en...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
KNO3	Sinopharm Chemical Reagent	10017218
KH2PO4	Sinopharm Chemical Reagent	10017608
MgSO4·7H2O	Sinopharm Chemical Reagent	10013018
CaCl2·2H2O	Sinopharm Chemical Reagent	20011160
MnSO4·H2O	Sinopharm Chemical Reagent	10013418
Na2MoO4·2H2O	Sinopharm Chemical Reagent	10019818
Boric Acid	Sinopharm Chemical Reagent	10004818
ZnSO4·7H2O	Sinopharm Chemical Reagent	10024018
CuSO4·5H2O	Sinopharm Chemical Reagent	10008218
CoCl2·6H2O	Sinopharm Chemical Reagent	10007216
KI	Sinopharm Chemical Reagent	10017160
FeSO4·7H2O	Sinopharm Chemical Reagent	10012118
EDTA	Sinopharm Chemical Reagent	10009717
NaOH	Sinopharm Chemical Reagent	10019718
KOH	Sinopharm Chemical Reagent	10017018
Sucrose	Sinopharm Chemical Reagent	10021418
Myo-inositol	MACKLIN	I811835
Nicotinic Acid	MACKLIN	N814565
Pyridoxine HCl	MACKLIN	V820447
Thiamine HCl	MACKLIN	T818865
Glycine	MACKLIN	G800880
Agar powder	Novon	ZZ14022
Fluorescence Microscope	Zeiss	Axio Zoom V16
Dissecting microscope	SDPTOP	SRE-1030
200μl pipette	Dragon Laboratory Instruments	713111110000-20-200ul
2.5μl pipette	Eppendorf	3120000011
Fine forceps	TWEEZERS	ST-15
Parafilm	PARAFILM	PM-996
Stainless steel double-sided blade	Gillette	Platinum-Plus Double-Edge Blade