نموذج الماوس من الاوعيه الدموية غير المتجانسة زرع الطحال لدراسة البيولوجيا خليه الطحال وزرع المناعة

Summary

هذا البروتوكول تفاصيل الخطوات الجراحية للنموذج الماوس من الاوعيه الدموية غير المتجانسة زرع الطحال ، وهو نموذج صعبه من الناحية الفنية التي يمكن ان تكون بمثابه أداه قويه في دراسة مصير وطول العمر من خلايا الطحال ، أليات الطحال متميزة الخلايا السكانية في تطور المرض ، وزرع المناعة.

Abstract

الطحال هو الجهاز اللمفاوية فريدة من نوعها التي تلعب دورا حاسما في التوازن من الجهاز المناعي والاجهزه التي تكون الدم. المرضي الذين خضعوا لاستئصال الطحال بغض السبب عن الأسباب المسببة هي عرضه لتطوير الساحقة بعد استئصال الطحال العدوى والخبرة زيادة مخاطر التخثر الوريدي العميق والأورام الخبيثة. في الاونه الاخيره ، أشارت الدراسات الوبائية إلى ان استئصال الطحال قد يكون مرتبطا بحدوث امراض القلب والاوعيه الدموية ، مما يوحي بان الوظائف الفسيولوجية لطحال لم يتم الاعتراف بها بعد بشكل كامل. هنا ، ونحن نقدم نموذج الماوس من الاوعيه الدموية غير المتجانسة زرع الطحال ، والتي ليس فقط يمكن استخدامها لدراسة وظيفة والنشاط السلوكي لمجموعات فرعيه الخلايا المناعية الطحال في العمليات البيولوجية المختلفة ، ولكن أيضا يمكن ان تكون أداه قويه لاختبار الإمكانيات العلاجية لزراعه الطحال في بعض الامراض. وتشمل الخطوات الجراحية الرئيسية لهذا النموذج حصاد الطحال المتبرع, أزاله الطحال الأصلي المتلقي, والطحال الترقيع التطعيم. باستخدام سلالات الماوس المنشا (علي سبيل المثال ، الفئران مع CD 45.1/CD 45.2 الخلفيات) ، لاحظنا انه بعد الزرع المتزامن ، هاجرت كل من الخلايا الليمفاوية المستمدة من المانحين والخلية النخاعية من الكسب غير المشروع في وقت لاحق من اليوم السابق للجراحة 1 ، يصاحب ذلك تدفق أنواع متعددة من الخلايا المتلقية ، التالي توليد الوهم فريدة من نوعها.  وعلي الرغم من التقنيات الصعبة نسبيا ، يمكن تنفيذ هذا الاجراء مع معدل النجاح > 90 ٪. هذا النموذج يسمح تتبع مصير ، وطول العمر ، ووظيفة من الطحال خلال حاله مستقره وفي وضع المرض بعد زرع الطحال ، التالي تقديم فرصه كبيره لاكتشاف دور متميز للخلايا المناعية المستمدة من الطحال في مختلف العمليات المرض.

Introduction

الطحال هو أكبر جهاز لمفاوي ثانوي في الجسم ، وهو أمر بالغ الاهميه في الجهاز المناعي والاجهزه التي تكون الدم. وتضطلع بمهامها في المقام الأول من قبل اثنين من المقصورات المتميزة شكليا, اللب الأحمر واللب الأبيض¹. اللب الأحمر هو العمل ثلاثي الابعاد من الجيوب الوريدية والحبال الطحال التي تتكون من ألياف شبكي ، خلايا شبكي ، والضامة المرتبطة بها. هذا الهيكل الفريد يسمح للب الأحمر بالعمل كفلتر دم فعال يزيل المواد الاجنبيه والكريات الحمر القديمة أو التالفة. ويشمل اللب الأبيض بصيلات, منطقه هامشيه, والبيريارتيريولار اللمفاوية (الزملاء) وهو موقع مهم لمحاصره مستضد ومعالجه, اللمفاوية الموجه, التحول, انتشار, ونضوج². ومع ذلك, وقد اعتبر الطحال عاده كجهاز استغناء عن لان الاجهزه اللمفاوية الأخرى, مثل الغدد الليمفاوية, يمكن أيضا تنفيذ بعض وظائفها وفقدان الطحال لا يؤدي عاده إلى الموت. ولذلك تم اجراء استئصال الطحال علي نطاق واسع كطريقه علاجيه للمرضي الذين يعانون من إصابات الطحال أو امراض الدم الحميدة³. ومع ذلك ، يواجه المرضي الذين يعانون من استئصال الطحال عددا من المضاعفات علي المدى الطويل. التهابات البكتيرية هي أفضل المضاعفات المعترف بها من استئصال الطحال^4,5. في الاونه الاخيره ، تم الاعتراف بالإنتان الساحق بعد استئصال الطحال كمضاعفات مكثفه لاستئصال الطحال المرتبطة بارتفاع معدل الوفاات⁶. وعلاوة علي ذلك ، تشير الدراسات الوبائية الاخيره إلى ان استئصال الطحال قد تترافق مع حدوث امراض القلب والاوعيه الدموية ، مما يوحي بان المزيد من الوظائف الفسيولوجية من الطحال لا تزال لاستكشاف^7،8.

وقد استخدمت كل من زرع الطحال الذاتي وزراعه الطحال في العيادة. حاليا ، الطحال زرع الذاتي من خلال زرع الأجزاء من الانسجه الطحال في الحقائب التي تم إنشاؤها في مينوتوم أكبر يعتبر الامكانيه الوحيدة للحفاظ علي وظيفة الطحال بعد الصدمة استئصال الطحال^9،10. ومع ذلك ، فان فعاليه هذه الجراحة قابله للنقاش كمضاعفات ما بعد الجراحة مثل نخر العقيم للانسجه الطحال وانسداد الأمعاء الدقيقة بسبب التصاقات بعد العملية الجراحية يمكن ان تحدث¹¹. وتشارك زراعه الطحال في زرع متعدد الأحشاء¹². تشير الادله السريرية من الزرع المتعدد الأحشاء إلى ان زراعه الطحال قد تلعب دورا وقائيا في رفض الكسب غير المزروع بالأمعاء الصغيرة دون التسبب في مرض الطعم مقابل المضيف (GVHD)¹². ومع ذلك ، لا تزال الأدبيات المتعلقة بالتاثير المفيد لزراعه الطحال كمكون للزرع المتعدد الأحشاء محدوده ولا تزال أليات الاساسيه التي يتعين تحديدها. وفي ال2006 ، ذكر ياير راتنر وآخرون ان زرع انسجه الطحال الجنينية التي لا توجد بها خلايا تائية للفئران يمكن ان يشفي الاصابه بالشلل النصفي A ، وهو مرض وراثي دون ان يسبب GVHD¹³، ودعم ان زرع الطحال يحمل وعدا علاجيا في بعض الامراض. لذلك ، هناك حاجه لمزيد من التحقيقات حول الإمكانيات العلاجية لزراعه الطحال.

النماذج الحيوانية من زرع الطحال هي قيمه لاستكشاف وظيفة غير مقدره من الخلايا المناعية المستمدة من الطحال في تطور المرض وكذلك لاختبار التاثير العلاجي المحتمل لزرع الطحال. تم توثيق نماذج زراعه الطحال الكاملة التجريبية منذ أوائل القرن العشرين ، كما استعرضها كوهين¹⁴. في 1969, coburn ريتشارد j. ولي et al. مفصله تقنيه زرع الطحال في الفئران^15,16. وفي الاونه الاخيره ، وصفت الدوامات FK وآخرون نموذج الماوس لزرع الطحال¹⁷. بالمقارنة مع نماذج الفئران ، نماذج الفار من زرع الطحال هي أكثر جاذبيه بسبب العديد من المزايا المتاصله. علي سبيل المثال ، من خلال استخدام نموذج الماوس ، يمكننا الوصول إلى مجموعه واسعه من الكواشف غير متوفرة لتلك النماذج الفئران. وعلاوة علي ذلك ، باستخدام الفئران الجينية (علي سبيل المثال ، الفئران مع CD 45.1/CD 45.2 الخلفية) ، وزرع الطحال synجينه يجعل من الممكن لتتبع مصير ، وطول العمر ، ووظيفة الطحال¹⁸. استنادا إلى العمل الذي تقوم به الدوامات FK وآخرون¹⁷، انشانا كذلك هذا البروتوكول المبسط والمعزز لزرع الطحال في الفئران. يجمع البروتوكول الموصوف أدناه بين الموثوقيه والجدوى بطريقه موحده ويمكن استخدامه كاداه لدراسة بيولوجيا الطحال ومناعة الزرع.

Protocol

وقد أجريت جميع الإجراءات واستخدام الحيوانية في هذه الدراسة وفقا للبروتوكولات التي وافقت عليها اللجنة الداخلية للرعاية الحيوانية والاستخدام في جامعه نورث وسترن (IACUC). في هذه الدراسة ، واستخدمت 8 إلى 10 الأسبوع الذكور CD 45.2 و CD 45.1 الفئران (سواء علي الخلفية BALB/c ، من مختبر جاكسون) والمتبرعين الطحال والمتلقيين ، علي التوالي ، لخلق نماذج زرع الطحال synجينه. وكانت جميع الكائنات أليفه في بيئة معقمه في المرافق الحيوانية في جامعه نورث وسترن. تم تطبيق زيوت التشحيم العين علي جميع الفئران بعد التخدير لمنع جفاف.

1. التحضير الجراحي ، التخدير ، ونظام تسكين

1. ضع ستاره معقمه يمكن التخلص منها (45.7 سم × 66 سم) علي المنصة الجراحية. انتزاع الماوس برفق ، حقن الكيتامين (50 ملغ/كغ) و اكسيليازين (10 ملغ/كغ) داخل الصفاق (ط. ع) للتخدير ، وحقن 0.05 ملغم/كغ بوبرينورفين جلد لتسكين.
2. ضمان عمق التخدير عن طريق قرصه اصبع القدم ، وحلق الشعر في منطقه البطن كله مع الحلاقة ووضع الماوس علي منصة الجراحية العقيمة تحت المجهر التشغيل في التكبير 6-10x.

2. حصاد الطحال المتبرع

1. تعقيم البطن مع وساده الاعداديه الكحول ، وتامين أطرافه مع الشريط الجراحية ، وجعل 3-4 سم خط الوسط شق الجلد العمودي من عانة إلى عمليه الخنجري مع مقص.
2. اسحب جدار البطن مع الجرارات المعقمة المصنوعة من المشبك. انقل الأمعاء إلى الجانب الأيمن من البطن (يسار الجراح) مع مسحه قطنية معقمه للكشف عن الطحال. الكي الوريد المعدة قصيرة تعلق علي الطحال مع درجه حرارة منخفضه معقمه الحذر (الشكل 1A). وضع قطعه من الشاش المعقمة غارقه مع 37 درجه مئوية المالحة فوق الطحال للحفاظ علي رطبه (الشكل 1B).
3. فصل وتعبئة الوريد المدخل من نسيج البنكرياس (الشكل 1C) عن طريق ربط فروع الوريد البابي (الوريد بانكريتيكودودينال العلوي والوريد المعدي الأيمن) ؛ وضع خياطه حول الوريد البوابة البعيدة من الوريد الطحال (الشكل 1D).
4. الوجه الطحال إلى الجانب الأيمن لفضح الشريان الابهر والاضطرابات الهضمية مع الشريان الطحال (الشكل 1E). تشريح وتعبئة الشريان الابهري البطني-الطحال عن طريق ربط الشريان الكبدي والشريان المعدي. وضع خياطه حول الشريان الابهر القريب إلى الشريان البطني (الشكل 1F-G).
5. حقن 100 الوحدات الدولية (IU) الهيبارين في الوريد الأجوف السفلي (IVC) لبالهيبارين الجسم كله والانتظار 3 دقائق للتاكد من ان الهيبارين اتخاذ الآثار. Ligate الابهر القريب إلى الشريان البطني ، جوال ميداني الوريد المدخل ، ثم حقنت الجسم كله باستخدام 10 مل من heparinized الباردة (4 درجه مئوية) المالحة (10 مل/20 ثانيه) من الشريان الابهر البطني البعيدة إلى الجذع البطني (الشكل 1h).
6. جمع الطعم الطحال في كتله مع الجزء المرتبط الابهر-الاضطرابات الهضمية-الطحال والوريد المدخل جنبا إلى جنب مع شريحة من الوريد الطحال وجزء صغير من انسجه البنكرياس. الحفاظ علي الطعم في 5 مل من المحلول الملحي 4 درجه مئوية قبل زرع. موت ببطء الماوس عن طريق خلع عنق الرحم.

3. المتلقي استئصال الطحال وزرع الترقيع الطحال

1. وضع وساده التدفئة علي منصة الجراحية وضبط درجه الحرارة إلى 37 درجه مئوية. ضع ستاره معقمه (45.7 سم × 66 سم) فوق لوحه التسخين لإنشاء منصة جراحيه معقمه. كرر الخطوات 2.1 و 2.2 للتحضير الجراحي والتخدير. جعل شق الخط النصفي 3-4 سم وسحب جدار البطن كما هو موضح في الخطوة 2.1 والخطوة 2.2.
2. نقل بعناية الأمعاء إلى الجانب الأيمن من الماوس مع مسحه قطنية معقمه لفضح الطحال المتلقي. Ligate الوريد الطحال والشريان وأزاله الطحال.
3. نقل بعناية الأمعاء إلى الجانب الأيسر من الماوس وتغطيه الأمعاء مع الشاش الرطب (غارقه مع معقمه 37 درجه مئوية المالحة). تشريح وربط الفروع القطنية من الشريان الاورطي المتعدي و IVC; عبر المشبك الشريان الاورطي المتعدي و IVC باستخدام اثنين من المشابك ميكرووعائيه 4 مم.
4. وضع خياطه النايلون 11-0 من خلال الشريان الاورطي المتعدي (سمك كامل) والتراجع لإنشاء أورتوتومي بيضاوي الشكل بواسطة قطعه واحده مع مقص (الطول يجب ان تتطابق مع قطر الشريان الابهر المتبرع ، الرقم 2A). بيرس IVC باستخدام ابره 30 G لإنشاء بضع القطع البيضاوي وتوسيع الفتحة إلى الجهة المانحة طول الوريد المتطابقة باستخدام المقص الصغير (الشكل 2A).
5. مسح الدم داخل ألومنيوم أو تجلط الدم (في الشريان الابهر و IVC) مع 500 μL من المحلول الملحي heparinized (10 وحدات/مل).
6. ضع طعم الطحال في الجناح الأيمن من بطن الفار المتلقي. تحديد بعناية كفه المتبرع الاورطي والوريد المدخل المتبرع. بعد التاكد من ان الاوعيه الدموية ليست ملتوية ، وتغطيه الطعم الطحال مع الشاش غارقه مع البرد (4 درجه مئوية) المالحة.
7. قم بتوصيل كفه المتبرع بالشريان الابهري بالقمة القريبة والبعيدة لأورتاوتومي الخاصة بالمتلقي مع غرزين للبقاء (11-0 خيط من النايلون ، كما هو الحال أدناه) (الشكل 2 ب، ج). جعل الانسمام مع 2-3 لدغات من الخيوط النايلون المستمر 11-0 بين الكفة المتبرع الشريان الابهري وأورتاوتومي المتلقي (الجدار الامامي) (الشكل 2D). تحويل الطعم الطحال إلى الجانب الأيسر من المتلقي. جعل الانسمام بين الكفة الابهري المتبرع وأورتوتومي المتلقي (الجدار الخلفي) (الشكل 2E).
8. قم باجراء العملية الجراحية لتوصيل وريد بوابه المتبرع بالجدار الخلفي لل IVC الخاص بالمستلم ، وذلك باستخدام 4 إلى 5 لدغات من الغرز المستمرة في داخل الجهاز ومن ثم إغلاق الخيط علي الجهة الخارجية لل IVC (الشكل 2F، G).
9. الإفراج عن المشابك السفينة واستخدام مسحه القطن المعقمة إلى النزيف تاملونيد حتى يتم استرداد لون الطحال (الشكل 2H).
10. إغلاق البطن مع خياطه vicryl الاصطناعية 5-0 قابل للامتصاص في نمط مستمر. إغلاق طبقه الجلد مع خياطه النايلون 5-0 في نمط توقف.
    ملاحظه: بالنسبة للخطوات 4.7-4.8 ، بدلا من ذلك ، جعل الانسمام بين الوريد المدخل المتبرع والمتلقي IVC الاولي (الخطوة 4.8) ؛ ثم اجراء الانسمام بين الكفة الابهري المتبرع والجدار الخلفي لأورتوتومي المتلقي ، وذلك باستخدام 2 إلى 3 الغرز المستمر في داخل الشريان الابهر وإغلاق خياطه علي الخارج من الشريان الابهر.

4. الانتعاش الحيواني

1. حقن 1 مل من جلد المالحة الدافئة عبر 4 مواقع منفصلة (0.25 mL/الموقع) بعد إغلاق البطن.
2. الحفاظ علي الماوس في حاضنه التي تسيطر عليها درجه الحرارة (30 درجه مئوية) للساعات القليلة الاولي بعد العملية ، ومراقبه الماوس حتى استعاد وعيه كافيه ، ومن ثم نقل الماوس إلى قفص نظيف جديد مع الطعام العادي والماء ، مع وساده التدفئة (30 درجه مئوية ) تحت القفص. الحفاظ علي الماوس بعد الجراحة في قفص منفصل.

5. أداره الم بعد الجراحة

1. حقن 0.05 ملغ/كغ البوبرينورفين جلد 24 h و 48 h بعد الجراحة للحفاظ علي نظام تسكين.

النتائج

يمكن إكمال الاجراء بأكمله من زراعه الطحال الفئران في غضون 90 دقيقه من قبل الجراحين المجهريين ذوي الخبرة. وقد أجريت لدينا مختبر أكثر من 100 زرع الطحال في الفئران. معدل النجاح هو أكثر من 90 ٪ ، كما هو محدد من قبل بقاء كل من الماوس المتلقي والطعم الطحال ليوم ما بعد الجراحة (POD) 1 أو ...

Discussion

أدله دامغه تشير إلى ان الخلايا الاحاديه المستمدة من الطحال تلعب دورا هاما في العمليات التهابيه العقيمة مثل تصلب الشرايين¹⁹, الدماغ نقص التروية الحاد²⁰ أو أصابه الرئة¹⁸, وكذلك عضله القلب I/R أصابه أعاده عرض^21,22,

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine	Wyeth	206205-01
Xylazine	Lloyd Laboratories	139-236
Heparin solution	Abraxis Pharmaceutical Products	504031
Injection grade normal saline	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-20
70% Ethanol	Pharmco Products Inc.	111000140
ThermoCare Small Animal ICU System	Thermocare, Inc.
Adson Forceps	Roboz Surgical Instruments	RS-5230
Derf Needle Holder	Roboz Surgical Instruments	RS-7822
Extra Fine Micro Dissecting Scissors	Roboz Surgical Instruments	RS-5881
Micro-clip	Roboz Surgical Instruments	RS-5420
7-0 silk	Braintree Scientific	SUT-S 103
11-0 nylon on 4-mm (3/8) needle	Sharpoint DR4	AK-2119
Ms CD45.2 antibody	BD Bioscience	553772
Ms CD45.1 antibody	BD Bioscience	553776
Ms CD11b antibody	BD Bioscience	557657
Ms B220 antibody	BD Bioscience	553089
Ms Ly6C antibody	eBioscience	48-5932-80
Ms Ly6G antibody	BD Bioscience	561236
Ms F4/80 antibody	BD Bioscience	565614
Ms CD11c antibody	BD Bioscience	558079
Ms CD3 antibody	eBioscience	48-0032-82
Ms CD4 antibody	BD Bioscience	552051
Ms CD8 antibody	BD Bioscience	563786
LIVE/DEAD™ Fixable Violet Dead Cell Stain Kit	Thermo Fisher	L34955