Ein Mausmodell der Vaskularisierten Heterotopischen Spleen-Transplantation für das Studium der Zauberzellen und der Transplantation von Transplantationen in der Lagen

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die chirurgischen Schritte eines Mausmodells der vaskularisierten heterotopischen Milztransplantation, ein technisch anspruchsvolles Modell, das als mächtiges Werkzeug bei der Untersuchung des Schicksals und der Langlebigkeit von Milzzellen dienen kann, die Mechanismen der unterschiedlichen Milz Zellpopulationen in Krankheitsverlauf und Transplantationsimmunität.

Zusammenfassung

Die Milz ist ein einzigartiges Lymphorgan, das bei der Homöostase des Immunsystems und des hämatopoetischen Systems eine entscheidende Rolle spielt. Patienten, die sich einer Splenektomie unterzogen haben, unabhängig von den Ursachen, die sich daraus ergeben, neigen dazu, eine überwältigende Infektion nach der Splenektomie zu entwickeln und ein erhöhtes Risiko einer tiefen venösen Thrombose und bösartigen Erkrankungen zu erleben. In jüngster Zeit haben epidemiologische Studien darauf hingewiesen, dass die Splenektomie mit dem Auftreten von Herz-Kreislauf-Erkrankungen in Verbindung gebracht werden könnte, was darauf hindeutet, dass die physiologischen Funktionen der Milz noch nicht vollständig erkannt wurden. Hier führen wir ein Mausmodell der vaskularisierten heterotopischen Milztransplantation ein, das nicht nur zur Untersuchung der Funktion und Verhaltensaktivität von prächtigen Immunzellen-Untergruppen in verschiedenen biologischen Prozessen genutzt werden kann, sondern auch ein leistungsfähiges Werkzeug zum Testen sein kann. Das therapeutische Potenzial der Milztransplantation bei bestimmten Krankheiten. Die wichtigsten chirurgischen Schritte dieses Modells sind die Spenderspitzenernte, die Entfernung der Empfängerspendenz und die Revaskularisierung der Milz. Mit kongenen Mausstämmen (z.B. Mäuse mit CD45.Pyhale-CD5.2-Hintergründen) beobachteten wir, dass nach syngeneischer Transplantation sowohl von Gebern abgeleitete Splene-Lymphozyten als auch Myeloidzellen bereits nach dem operativen Tag 1 aus dem Transplantation abwanderten, was mit dem Der Zustrom mehrerer Arten von Empfängerzellen, wodurch eine einzigartige Chimäre entsteht.  Trotz relativ anspruchsvoller Techniken kann dieses Verfahren mit einer Erfolgsquote von gt;90% durchgeführt werden. Dieses Modell ermöglicht es, das Schicksal, die Langlebigkeit und die Funktion von Splenozyten während des gleichmäßigen Zustandes und in einer Krankheitssituation nach einer Milztransplantation zu verfolgen und bietet somit eine großartige Gelegenheit, die besondere Rolle der von Leben abgeleiteten Immunzellen in der Verschiedene Krankheitsprozesse.

Einleitung

Die Milz ist das größte sekundäre Lymphorgan im Körper und ist im Immunsystem und in der hämatopoetischen Systemen entscheidend. Seine Funktionen werden in erster Linie von zwei morphologisch ausgeprägten Fächern, dem roten Fruchtfleisch und dem weißen Fruchtfleisch¹, ausgeführt. Das rote Fruchtfleisch ist ein dreidimensionales Geflecht aus venösen Nasennebenhöhlen und splenischen Schnüren, die aus Netzfasern, Netzzellen und zugehörigen Makrophagen bestehen. Diese einzigartige Struktur ermöglicht es dem roten Fruchtfleisch, als effektiver Blutfilter zu wirken, der fremde Materialien und alte oder beschädigte Erythrozyten entfernt. Das weiße Fruchtfleisch umfasst Follikel, Randzone und die periarteriolaren Lymphhüllen (PALS) und ist ein wichtiger Ort für Antigen-Fang und-verarbeitung, Lymphozyten-Homing, Transformation, Proliferation und Reifung². Dennoch wurde die Milz allgemein als entbehrliches Organ angesehen, da auch andere lymphatische Organe, wie Lymphknoten, einige ihrer Funktionen erfüllen können und der Milzverlust in der Regel nicht zum Tod führt. Die Splenektomie wurde daher als therapeutische Methode für Patienten mit prächtiger Verletzung oder gutartigen hämatologischen Erkrankungen3 durchgeführt. Patienten mit einer Splenektomie sehen sich jedoch einer Reihe von Langzeitkomplikationen gegenüber. Bakterielle Infektionen sind die am besten erkannten Komplikationen der Splenektomie^4,5. In jüngster Zeit wurde die überwältigende postsplenektomische Sepsis als intensive Komplikation der Splenektomie mit einer hohen Sterblichkeit assoziiert erkannt 6^. Darüber hinaus deuten jüngste epidemiologische Studien darauf hin, dass die Splenektomie mit dem Auftreten von Herz-Kreislauf-Erkrankungen in Verbindung gebracht werden kann^,was darauf hindeutet, dass weitere physiologische Funktionen der Milz noch 7^,8erforscht werden müssen.

Sowohl Milbenautotransplantation als auch Milzallotransplantation wurden in der Klinik eingesetzt. Derzeit wird die Milz Autotransplantation durch die Implantation von Teilen des prächtigen Gewebes in Beutel,^dieim größeren Omanum^erzeugtwerden, als die einzige Möglichkeit, die prächtige Funktion nach der traumatischen Splenektomie 9,10^zuerhalten. Die Wirksamkeit dieser Operation ist jedoch umstritten, da nach der Operation Komplikationen wie aseptische Nekrose des Splenengewebes und kleine Darm-Obstruktion durch postoperative Haftung auftreten könnten¹¹. Die Milletransplantation ist an der multiviszeralen Transplantation¹²beteiligt. Klinische Erkenntnisse aus der multiviszeralen Transplantation deuten darauf hin, dass die Milbenallotransplantation eine schützende Rolle bei der Abstoßung von Kleindarm spielen kann, ohne dass eine Graft-versus-Wirst-Erkrankung (GVHD) 12 verursacht wird. Dennoch ist die Literatur über die positive Wirkung der Milzlegierung als Bestandteil der multiviszeralen Transplantation noch begrenzt und die zugrunde liegenden Mechanismen müssen noch definiert werden. Im Jahr 2006 berichtete Yair Reisner et al., dass die Transplantation von embryonalem Milbengewebe Schwein, das keine T-Zellen an Mäuse hat, die Hemophilie A heilen könnte, eine genetische Erkrankung, ohne GVHD¹³zu verursachen, und die Unterstützung der Milztransplantation, die therapeutische Versprechen in Bestimmte Krankheiten. Daher seien weitere Untersuchungen zum therapeutischen Potenzial der Milztransplantation notwendig.

Tierische Modelle der Milztransplantation sind wertvoll, um die nicht geschätzte Funktion der von Milz abgeleiteten Immunzellen im Krankheitsverlauf zu erforschen und die mögliche therapeutische Wirkung der Milztransplantation zu testen. Experimentelle Vollmilgentransplantationsmodelle sind seit Anfang des 20. Jahrhunderts dokumentiert, wie Cohen¹⁴. 1969 beschrieben Coburn Richard J. und Lee et al. die Technik der Milztransplantation in Ratten^15,16. In jüngerer Zeit beschrieb Swirski FK et al. ein Mausmodell der Milz Transplantation 17. Im Vergleich zu Rattenmodellen sind Mausmodelle der Milztransplantation aufgrund mehrerer Vorteile attraktiver. Zum Beispiel, indem wir ein Mausmodell verwenden, können wir auf eine große Vielfalt von Reagenzien zugreifen, die nicht verfügbar sind, um die von Rattenmodellen. Darüber hinaus ermöglicht eine syngenförmige Milztransplantation durch den Einsatz von kongenen Mäusen (z.B. Mäuse mit CD45.MP3-Hintergrund), das Schicksal, die Langlebigkeit und die Funktion von Splenozyten 18 zu verfolgen. Auf der Grundlage der Arbeit von Swirski FK et al. 17 haben wir dieses vereinfachte und erweiterte Protokoll der Milztransplantation bei Mäusen weiter etabliert. Das unten beschriebene Protokoll vereint sowohl Zuverlässigkeit als auch Machbarkeit in standardisierter Weise und kann als Werkzeug zur Untersuchung von Milzbiologie und Transplantationsimmunität genutzt werden.

Protokoll

Alle Verfahren und die Verwendung von Tieren wurden nach Protokollen durchgeführt, die vom Ausschuss für Tierpflege und-nutzung der Northwestern Universität (IACUC) genehmigt wurden. In dieser Studie wurden 8 bis 10 Wochen alte männliche CD45.2 und CD45.1-Mäuse (beide auf BALB/Hintergrund, aus dem Jackson-Labor) als Milzspender und-empfänger verwendet, um syngenice Milztransplantationsmodelle zu erstellen. Alle Tiere wurden in der sterilen Umgebung in den Tieranlagen der Northwestern University untergebracht. Das Augenschmiermittel wurde auf alle Mäuse nach der Betäubung aufgetragen, um Trockenheit zu verhindern.

1. Chirurgische Zubereitung, Anästhesie und Analgesie Regimen

1. Legen Sie einen sterilen Einwegdrape (45,7 cm x 66 cm) auf die OP-Plattform. Günstig greifen Sie die Maus, injizieren Sie Ketamin (50 mg/kg) und Xylazin (10 mg/kg) intraperitoneal (i.p) für die Anästhesie, und injizieren 0,05 mg/kg Buprenorphin subkutan für die Analgesie.
2. Stellen Sie die Tiefe der Anästhesie durch Zehenspinke, rasieren Sie das Haar im gesamten Bauchbereich mit einem Rasiermesser und platzieren Sie die Maus auf der sterilen chirurgischen Plattform unter dem Operationsmikroskop bei 6-10x Vergrößerung.

2. Donor Spleen Harvest

1. Sterilisieren Sie den Bauch mit einem Alkohol-Prep-Pad, sichern Sie die Gliedmaßen mit chirurgischem Klebeband, und machen Sie einen 3-4 cm mittleren Mittelzeige-vertikalen Hautschnitt von den Pubis zum Xiphoid-Prozess mit einer Schere.
2. Die Bauchwand mit sterilen Retraktoren aus Papierklammern zurückziehen. Bewegen Sie den Darm auf die rechte Flanke des Bauches (Chirurge links) Seite mit einem sterilen Baumwollschwab, um die Milz zu entlarven. Die kurze Magenvene, die an der Milz befestigt ist, mit einer sterilen Niedertemperaturkammtion(Abbildung 1A) vorsichtig. Ein Stück sterile Gaze mit 37 ° C Salz über die Milz eingeweicht, damit sie feucht bleibt (Abbildung 1B).
3. Die Portalvene vom Bauchspeicheldrüsengewebe trennen und mobilisieren (Abbildung 1C), indem die Portalvene (überlegene Bauchspeicheldrüsen-und rechte Magenvene) ligiert wird; Platzium eine Naht um die Portalvene distal von der prächtigen Vene (Abbildung 1D).
4. Drehen Sie die Milz nach rechts, um den Aorta und den Zöliakie-Stamm mit der prächtigen Arterie(Abbildung 1E) zu entlarven. Die asortisch-zeliakult-prächtige Arterie zu zerkleinern und zu mobilisieren, indem die Leber-und Magenarterie ligiert wird; Eine Naht um die Aorta in der Nähe der Zöliakie-Arterie (Abbildung 1F-G) legen.
5. Injektieren Sie 100 internationale Einheiten (IU), die in die untere vena cava (IVC) hepariniert werden, um den ganzen Körper zu heparinieren und 3 Minuten zu warten, um sicherzustellen, dass die Heparin-Wirkung wirkt. Ligieren Sie die Aorta in der Nähe der Zöliakie, transect die Portalvene, und dann parfümieren Sie den ganzen Körper mit 10 mL heparinierter Kälte (4 ° C) Salz (10 mL/20 s) von der abdominalen Aorta distal bis Zöliakie (Abbildung 1H).
6. Sammeln Sie die Milz graft en bloc mit dem zugehörigen Aortic-Zöliak-Sechn-Segment und die Portalvene zusammen mit einem Segment von prächtige Vene und einem kleinen Teil der Bauchspeicheldrüsengewebe. Vor der Transplantation in 5 mL von 4 ° C Salz aufbewahren. Sterbegedanke der Maus durch zervikale Dislokation.

3. Rekzeppient Splenektomie und Spleen Graft Implantation

1. Legen Sie ein Heizpolster auf die OP-Plattform und stellen Sie die Temperatur auf 37 ° C ein. Legen Sie einen sterilen Drahter (45,7 cm x 66 cm) auf das Heizungspolster, um eine sterile OP-Plattform zu schaffen. Wiederholen Sie die Schritte 2.1 und 2.2 für die chirurgische Vorbereitung und Betäubung. Machen Sie einen 3-4 cm mittleren Schnitt und ziehen Sie die Bauchwand zurück, wie in Schritt 2.1 und Schritt 2.2 beschrieben.
2. Begetucht den Darm mit einem sterilen Wattestäbchen auf die rechte Seite der Maus, um die Milz des Empfängers zu entlarven. Die prächtigen Ader und die Arterie abspülen und die Milz entfernen.
3. Den Darm vorsichtig auf die linke Seite der Maus bewegen und den Darm mit feuchter Gaze bedecken (mit sterilen 37 ° C Salz getränkt). Die Lendenwirbelsäule der Infrarandaorta und des IVC zerlegen und einordnen; Die Infrarenaorta und das IVC mit zwei 4-mm-Mikrovaskulationsklemmen verkrießen.
4. Legen Sie eine 11-0 Nylon-Nylonnaht durch die Infrarenaorta (eine volle Dicke) und ziehen Sie sich zurück, um eine elliptische Aortotomie durch einen einzigen Schnitt mit Mikroscheren zu erstellen (die Länge sollte dem Durchmesser der Spenderaorta entsprechen, Abbildung 2A). Durchstechen Sie das IVC mit einer 30-G-Nadel, um eine elliptische Venotomie zu erstellen und die Öffnung zum Spenderportal mit Hilfe der Mikroschere mit einer Venenlänge zu verlängern.
5. Reinigen Sie das intraluminale Blut oder Blutgerinnsel (in der Aorta und IVC) mit 500 μL heelisierter Saline (10 Units/ml).
6. Legen Sie die Milz Graft in die rechte Flanke des Empfängers Maus Bauch; Die Aortenmanschette des Spenders und die Portalvene des Spenders sorgfältig identifizieren. Nachdem Sie darauf geachtet haben, dass die Gefäße nicht verdreht sind, bedecken Sie die Milz mit einer mit kalten (4 ° C) getränkten Sorte.
7. Verbinden Sie die Aortenmanschette des Spenders mit der proximalen und distalen Spitze der Aortaotomie des Empfängers mit zwei Aufenthaltsnähten (11-0 Nylonnähte, wie unten) (Abbildung 2B, C). Machen Sie eine Anastomose mit 2-3 Bissen von ununterbrochenen 11-0 Nylonnahten zwischen der Aortenmanschette des Spenders und der Aortaotomie des Empfängers(Vorderwand) (Abbildung 2D). Drehen Sie die Milz auf die linke Seite des Empfängers umdrehen; Machen Sie die Anastomose zwischen der Aortenmanschette des Spenders und der Aortotomie des Empfängers (hintere Wand) (Abbildung 2E).
8. Führen Sie eine Anastomose durch, um die Portalvene des Spenders mit der hinteren Wand des IVC des Empfängers zu verbinden, wobei 4 bis 5 Bisse durchgängige Nähte auf der Innenseite des IVC verwendet werden und dann die Naht auf der Außenseite des IVC geschlossen wird (Abbildung 2F, G).
9. Lassen Sie die Gefäßklemmen und verwenden Sie sterile Baumwollschweine zu Tamponade Blutungen, bis die Milzfarbe wiederhergestellt ist (Abbildung 2H).
10. Schließen Sie den Bauch mit einer 5-0 synthetisch absorbierbaren Vicryl-Naht in einem durchgehenden Muster. Schließen Sie die Hautschicht mit einer 5-0 Nylonnaht in einem unterbrochenen Muster.
    NOTE: Für die Schritte 4.7-4.8, alternativ, eine Anastomose zwischen der Portalvene des Spenders und dem IVC des Empfängers zuerst (Schritt 4.8); Machen Sie dann eine Anastomose zwischen der Aortenmanschette des Spenders und der hinteren Wand der Aortotomie des Empfängers, mit 2 bis 3 kontinuierlichen Nähten im Inneren der Aorta und schließen Sie die Naht an der Außenseite der Aorta.

4. Tiererholung

1. Nach dem Schließen des Bauches 1 ml warme Saline subkutan über 4 verschiedene Stellen (0,25 mL/Lage) einspritzen.
2. Halten Sie die Maus in einem temperaturgesteuerten Inkubator (30 ° C) für die ersten Stunden nach der Operation, überwachen Sie die Maus, bis sie genügend Bewusstsein zurückgewonnen hat, und dann übertragen Sie die Maus in einen neuen sauberen Käfig mit regelmäßigem Essen und Wasser, mit einem Heizkissen (30 ° C ) unter dem Käfig. Halten Sie die Maus nach der Operation in einem separaten Käfig.

5. Postchirurgisches Schmerzmanagement

1. Injektieren Sie 0,05 mg/kg Buprenorphin subkutan 24 h und 48 h nach der Operation, um Schmerzmittel zu erhalten.

Ergebnisse

Die gesamte Prozedur der Maus-Milse-Transplantation kann innerhalb von 90 Minuten von erfahrenen Mikrochirurgen abgeschlossen werden. Unser Labor hat mehr als 100 Milztransplantationen in Mäusen durchgeführt. Die Erfolgsrate liegt bei über 90%, wie sie durch das Überleben der Rezipient-Maus und der Milzveredelung bis zum postoperativen Tag (POD) 1 oder POD 7 (unser Studiendendpunkt) definiert wird. Das Überleben der Milzveredelung wurde durch die makroskopische Erläustellungs-und St...

Diskussion

Begabende Hinweise deuten darauf hin, dass lärm abgeleitete Monozyten eine wichtige Rolle bei sterilen Entzündungsprozessenwie Atherosklerose 19, akuter ischämischer Hirn-20 oder Lungenverletzung¹⁸sowie Myokardverletzungen bei I/R spielen und Umbau^21,22,23. In diesen Berichten wird die Rolle der Milz bei vielen chronischen Krankheiten hervorgehoben, von d...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine	Wyeth	206205-01
Xylazine	Lloyd Laboratories	139-236
Heparin solution	Abraxis Pharmaceutical Products	504031
Injection grade normal saline	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-20
70% Ethanol	Pharmco Products Inc.	111000140
ThermoCare Small Animal ICU System	Thermocare, Inc.
Adson Forceps	Roboz Surgical Instruments	RS-5230
Derf Needle Holder	Roboz Surgical Instruments	RS-7822
Extra Fine Micro Dissecting Scissors	Roboz Surgical Instruments	RS-5881
Micro-clip	Roboz Surgical Instruments	RS-5420
7-0 silk	Braintree Scientific	SUT-S 103
11-0 nylon on 4 mm (3/8) needle	Sharpoint DR4	AK-2119
Ms CD45.2 antibody	BD Bioscience	553772
Ms CD45.1 antibody	BD Bioscience	553776
Ms CD11b antibody	BD Bioscience	557657
Ms B220 antibody	BD Bioscience	553089
Ms Ly6C antibody	eBioscience	48-5932-80
Ms Ly6G antibody	BD Bioscience	561236
Ms F4/80 antibody	BD Bioscience	565614
Ms CD11c antibody	BD Bioscience	558079
Ms CD3 antibody	eBioscience	48-0032-82
Ms CD4 antibody	BD Bioscience	552051
Ms CD8 antibody	BD Bioscience	563786
LIVE/DEAD™ Fixable Violet Dead Cell Stain Kit	Thermo Fisher	L34955