비장 세포 생물학 및 이식 면역을 연구 하기 위한 혈관 화 된 이종 화제 비장 이식의 마우스 모델

요약

이 프로토콜은 비장 세포의 운명과 장 수를 연구 하는 강력한 도구 역할을 하는 기술적으로 도전적인 모델 인 바소 이종 화제 비장 이식의 마우스 모델의 수술 단계를 자세히 설명 하 고, 별개의 비장의 메커니즘 세포 집단은 질병 진행 및 이식 면역에 있다.

초록

비장은 면역 및 조 혈 시스템의 항상성에 중요 한 역할을 하는 독특한 림프 기관. 원인에 관계 없이 비장 절제술을 받은 환자는 압도적 인 사후 비장 절제술 감염을 개발 하 고 깊은 정 맥 혈전 증과 악성 종양의 증가 위험을 경험 하는 경향이 있다. 최근, 역학 연구는 비장 절제술은 심혈 관 질환의 발생과 관련 될 수 있음을 표시, 비장의 생리 적 기능이 아직 완전히 인식 되지 않은 것을 시사. 여기서, 우리는 혈관 화 된 이종 화제 비장 이식의 마우스 모델을 소개 하 고,이는 상이한 생물학적 과정에서 비장 면역 세포 서브 세트의 기능 및 행동 활동을 연구 하기 위해 활용 될 수 있을 뿐만 아니라, 또한 시험 하는 강력한 도구가 될 수 있다 특정 질병에서 비장 이식의 치료 잠재력. 이 모형의 주요 외과 단계는 기증자 비장 수확, 수령인 기본 비장의 제거, 및 비장 접목 혈관 신생을 포함 합니다. 콘 제 닉 마우스 균 주를 사용 하 여 (예를 들면, 마우스 CD 및 CD를 가진 생쥐), 우리는 신 유전학 이식 후에, 기증자 유래 비장 림프 구와 골수성 세포가 이식 수술의 날 초기에 접목에서 이전 된 것을 관찰 했습니다. 여러 유형의 받는 사람 세포의 유입, 따라서 독특한 키메라를 생성.  비교적 어려운 기술에도 불구 하 고,이 절차는 > 90% 성공률으로 수행 할 수 있습니다. 이 모델은 비장 유래 면역 세포에 대 한 별개의 역할을 발견 할 수 있는 좋은 기회를 제공 하 여 정상 상태 및 비장의 이식에 따라 질병 설정 시의 운명, 장 수 및 기능을 추적 허용 다른 질병 과정.

서문

비장 본문에 가장 큰 보조 림프 장기 이며 면역 및 조 혈 시스템에 중요 하다. 그 기능은 주로 두 가지 형태학 적으로 별개의 구획, 적색 펄프 및 백색 펄프¹에 의해 수행 된다. 적색 펄프는 망상 섬유, 망상 세포 및 관련 대 식 세포로 구성 된 정 맥 공동 및 비장 코드의 입체 메시 작업입니다. 이 독특한 구조는 붉은 펄프가 외국 물질과 오래 되거나 손상 된 적혈구를 제거 하는 효과적인 혈액 필터 역할을 할 수 있습니다. 백색 펄프는 모 낭을 포함 하 고, 한계 구역 및 periarteriolar 림프의 보호관 (PAL) 및 항 원 포착 및 처리, 림프 구 유도, 변환, 증식 및 성숙에 대 한 중요 한 사이트입니다². 그럼에도 불구 하 고 비장은 림프절과 같은 다른 림프 기관이 기능을 수행 할 수 있으며 비장의 손실이 일반적으로 사망으로 이어지는 것이 아니기 때문에 일반적으로 분배 가능한 기관으로 간주 되었습니다. 비장 절제술 따라서 널리 비장 부상 또는 양성 혈액 질환 환자에 대 한 치료 방법으로 수행 된³. 그러나, 비장 절제술을 가진 환자는 많은 장기 합병증을 직면 합니다. 세균 감염은 비장 절제술의 최고 인식 합병증 이다^4,5. 최근, 압도적인 후 비장 절제술 패 혈 증은 높은 사망률과 관련 된 비장 절제술의 집중적 인 합병증으로 인식⁶. 더욱이, 최근의 역학 연구는 비장 절제술이 심혈 관 질환의 발생과 관련 될 수 있음을 나타내며, 비장의 추가 생리 기능을 탐구 하는 것을 제안^7,8.

비장 자동 이식 및 비장 allotransplantation 모두 클리닉에서 활용 되었습니다. 현재, 비장에 의해 자동 이식 큰 전조에 만든 파우치에 비장 조직의 섹션을 이식 하 여 외상 비장 절제술 후 비장 기능을 보존 하기 위한 유일한 가능성으로 간주 됩니다^9,10. 그러나이 수술의 효능은 수술 후 합병증으로 인해 비장 조직의 무 균 괴 사와 수술 후 유착으로 인 한 작은 창 자 폐색이 발생할 수 있습니다 (¹¹). 비장 allotransplantation 다중 내장 이식¹²에 관여 합니다. 다중 내장 이식 으로부터의 임상 증거는 비장 allotransplantation 이식 편대 숙주 질환 (GVHD)을 유발 하지 않고 작은 창 자 이식 거부에서 보호 역할을 할 수 있음을 시사한다. 그러나 다중 내장 이식의 구성 요소로 서 비장 allotransplantation의 유익한 효과에 관한 문학은 여전히 제한적 이며 근본적인 기전이 정의 될 수 있다. 2006에서, Yair Reisner et은 마우스에 T 세포가 없는 배아 비장 조직을 이식 하 여 혈우병을 치료할 수 있다고 보고 하였으며, 유전자 질환 인 GVHD (¹³)를 유발 하지 않고, 비장 이식이 치료 약속을 보유 하 고 있음을 지지 한다 특정 질병. 따라서, 비장 이식의 치료 가능성에 대 한 추가 조사에 대 한 필요성이 있다.

비장 이식의 동물 모델은 비장 이식의 잠재적 인 치료 효과를 테스트 할 뿐만 아니라 질병 진행에서 비장 유래 면역 세포의 비 평가 기능을 탐구 하는 것이 중요 합니다. 실험적인 전체 비장 이식 모델은 코헨¹⁴에 의해 검토로 1900 년대 초 이후 문서화 되었습니다. 1969, coburn 리처드 j.와이 외. 쥐에 비장 이식의 기술^15,16. 더 최근, 소용돌이 스키 FK 외. 비장 이식¹⁷의 마우스 모델을 설명 했다. 쥐 모델에 비해, 비장 이식의 마우스 모델은 여러 가지 고유 한 장점으로 인해 더 매력적 이다. 예를 들어, 마우스 모델을 활용 하 여 쥐 모델에서 사용할 수 없는 광대 한 다양 한 시 약 들에 접근할 수도 있습니다. 또한, 콘 제 닉 마우스 (예를 들어, CD를 사용 하는 마우스, 예컨대)를 이용 하 여 비장이 식은, 비장 (¹⁸)의 운명, 장 수 및 기능을 추적 하는 것을 가능 하 게 한다. 소용돌이 스키 FK 외에 의해 작업을 기반으로¹⁷, 우리는 또한 쥐에 비장 이식의이 간단 하 고 향상 된 프로토콜을 설립. 아래에 설명 된 프로토콜은 신뢰성과 타당성을 표준화 된 방식으로 결합 하 고 비장 생물학 및 이식 면역을 연구 하는 도구로 활용할 수 있습니다.

프로토콜

이 연구에서 모든 절차와 동물 사용은 노스웨스턴 대학 내부 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)가 승인한 프로토콜에 따라 수행 되었습니다. 본 연구에서, 8 ~ 10 주 남성 CD 72.8 및 CD 45.1 마우스 (둘 다의 BALB/c 배경, 잭슨 실험실에서)는 각각 비장 기증자 및 수혜자로 사용 되었으며, 신 제네 비장 이식 모델을 생성 하였다. 모든 동물은 노스웨스턴 대학의 동물 시설에서 무 균 환경에 보관 되었다. 안구 윤활제는 건조를 방지 하기 위해 마 취 후 모든 마우스에 적용 되었다.

1. 외과 준비, 마 취 및 진통 요법

1. 외과 용 플랫폼에 멸 균 일회용 드 레이프 (45.7 x 66)를 놓습니다. 마우스를 살짝 잡고 케 타 민 (50 밀리 그램)과 자일 라 진 (10mg/kg) 복 강 내을 마 취 하 고 진통에 대 한 0.05 mg/kg 부 프레 노르 핀을 주사 합니다.
2. 발가락 핀치에의 한 마 취의 깊이를 확인 하 고, 면도기로 전체 복 부 영역에서 머리를 면도 하 고 6-10 배 확대에서 작동 현미경 아래 멸 균 수술 플랫폼에 마우스를 놓습니다.

2. 기증자 비장 수확

1. 알코올 준비 패드로 복 부를 소독 하 고, 수술 테이프로 사지를 고정 하 고,가 위를 사용 하 여 장티푸스 프로세스에 3-4 cm 중간 수직 피부 절 개를 만듭니다.
2. 종이 클립으로 만든 멸 균 견인 기를 사용 하 여 복 벽을 후퇴 시킵니다. 비장을 노출 하는 살 균 면봉으로 복 부 (외과 의사의 왼쪽) 측의 오른쪽 측면에 내장을 이동 합니다. 비장에 부착 된 짧은 위 맥을 멸 균 저온 소 작으로 소 작을 (도 1a). 비장에 37 ° c 생리 식 염 수를 적신 살 균 거 즈 조각을 넣고 촉촉한 상태로 유지 합니다 (그림 1b).
3. 문맥을 분리 하 여 췌 장 조직 (도 1c) 으로부터 정 맥을 리 팅 하 여 문맥 분기 (우수한 pancreaticoduodenal 정 맥 및 우측 위 정 맥); 비장 정 맥에서 말단을 문맥 주위에 봉합 사를 놓습니다 (그림 1d).
4. 비장 동맥 (그림 1e)와 대동맥 및 체 강 트렁크를 노출 하는 오른쪽에 비장의 플립. 간 동맥 및 위 동맥을 결 찰 하 여 대동맥-체 강-비장 동맥을 분해 하 고 동원 하십시오; 대동맥 근 위부 주위에 봉합 사를 부 강 동맥 (그림 1f-G)에 놓습니다.
5. 100 국제 단위 (IU) 헤 파 린을 열 등 한 대 정 맥 (IVC)에 주사 하 여 몸 전체를 heparinize 후 헤 파 린이 효과를 확인 하기 위해 3 분간 기다리십시오. 대동맥을 체 강 동맥으로 하 고, 문맥을 변환 하 고, 복 부 대동맥에서 혈장 콜드 (4°c) 생리 식 염 수 (10ml/20s)를 사용 하 여 몸 전체를 전신에 사용 합니다 (그림 1h).
6. 비장 정 맥의 세그먼트와 췌 장 조직의 작은 부분과 함께 관련 된 대동맥-체 강-비장 세그먼트 및 문맥 정 맥과 함께 구획 이식 편 블록을 수집 합니다. 이식 전에 4°c의 염 분 5 mL에 접목을 보존 한다. 경 추 탈 구에 의해 마우스를 안락사.

3. 수령인 비장 절제술 및 비장 접목 이식

1. 수술 플랫폼에 발열 패드를 놓고 온도를 37 ° c로 조절 합니다. 멸 균 수술 플랫폼을 만들 수 있는가 열 패드의 상단에 살 무는 드 레이프 (45.7 x 66)를 놓습니다. 수술 준비 및 마 취를 위해 2.1 및 2.2 단계를 반복 하십시오. 2.1 단계 및 2.2 단계에서 설명한 바와 같이 3-4 cm 중간 선 절 개를 하 고 복 벽을 후퇴 시킵니다.
2. 조심 스럽게 수용자의 비장을 노출 하는 살 균 면봉으로 마우스의 오른쪽에 장을 이동 합니다. 비장 정 맥과 동맥을 ligate 하 고 비장의 제거.
3. 조심 스럽게 마우스의 왼쪽 측면에 내장을 이동 하 고 젖은 거 즈 (살 균 37 ° c 염 수로 적신)와 함께 내장을 커버. 인프라 대동맥 및 IVC의 요 추 분기를 분해 하 고 리 게이트; 두 개의 4mm 미세 혈관 클램프를 사용 하 여 인프라 대동맥과 IVC를 교차 클램프 합니다.
4. 11-0 나일론 봉합 사는 인프라 대동맥 (전체 두께)을 통과 하 고, 마이크로가 위를 사용 하 여 단일 절단으로 타원형 대동맥 절제술을 만듭니다 (길이는 기증자의 지름과 일치 해야 합니다. 그림 2a). IVC를 사용 하 여 30g 바늘을 관통 하 여 타원형의 venotomy를 만들고 마이크로가 위를 사용 하 여 정 맥 일치 길이를 기증자 포털로 확장 합니다 (그림 2a).
5. 혈장 염 (10 단위/m l)의 500 μ l를 사용 하 여 내 알루 민산 혈액 또는 혈전 (대동맥 및 IVC)을 지웁니다.
6. 비장 이식 부를 받는 쥐의 오른쪽 측면에 배치; 기증자의 대동맥 커 프와 기증자의 문맥을 주의 깊게 확인 하십시오. 혈관이 꼬여 있지 않은지 확인 한 후, 비장을 차가운 (4°c) 염 수로 적신 거 즈로 덮으 십시오.
7. 기증자의 대동맥 커 프를 수령인의 대동맥 절제술의 근 위 및 말단 꼭대기에 연결 하십시오 (아래와 같은 2 개의 스테이 봉합 사 (11-0 나일론 봉합 사). 기증자의 대동맥 커 프와 수용자의 아오 도교 절제술 (그림 2d) 사이에 연속 11-0 나일론 봉합 2-3 물기를 사용 하 여 문 합을 합니다. 비장 이식 편을 받는 사람의 왼쪽으로 돌립니다. 기증자의 대동맥 커 프와 받는 사람의 대동맥 절제술 (그림 2e) 사이의 문 합을 확인 하십시오.
8. IVC의 내부에 4 ~ 5 물린 연속 봉합 사를 사용 하 여 기증자의 포털 정 맥을 수령인의 IVC의 후부 벽에 연결 하는 문 합을 수행 하 고 IVC 외부의 봉합 사를 닫으십시오 (그림 2fG).
9. 용기 클램프를 해제 하 고 비장 색상을 복구 할 때까지 출혈을 탬 핑 하기 위해 멸 균 면봉을 사용 하십시오 (그림 2h).
10. 연속 패턴의 5-0 합성 흡수 성 비 릴 봉합으로 복 부를 닫으십시오. 중단 된 패턴의 5-0 나일론 봉합 사로 피부 층을 닫으십시오.
    참고: 4.7-4.8 단계에서 기증자의 문맥 및 수령인의 IVC 사이에 문 합을 먼저 하십시오 (단계 4.8); 그런 다음 대동맥의 내부에 2 ~ 3 개의 연속 봉합을 사용 하 고 대동맥의 외부에 봉합 사를 닫아 기증자의 대동맥 커 프와 수령인의 대동맥 절제술의 후방 벽 사이에 문 합을 만드십시오.

4. 동물 회복

1. 복 부를 닫은 후 4 개의 별도 위치 (0.25 mL/위치)를 통해 1 mL의 따뜻한 식 염 액을 피하에 주입 하십시오.
2. 처음 몇 시간 동안 온도 조절 인큐베이터 (30°c)에 마우스를 보관 하 고, 충분 한 의식이 회복 될 때까지 마우스를 모니터 한 다음, 일반 식품과 물을 사용 하 여 새 깨끗 한 케이지에 마우스를 옮겨가 열 패드 (30°c )이 케이지 아래에 있습니다. 마우스 수술 후 별도의 케이지에 보관 하십시오.

5. 수술 후 통증 관리

1. 진통 처방을 유지 하기 위해 0.05 mg/kg 부 프레 노르 핀 피하 24 h 및 48 h 후 수술을 주입 하십시오.

결과

마우스 비장 이식의 전체 절차는 경험 있는 마이크로 외과 의사에 의해 90 분 이내에 완료 할 수 있습니다. 우리 실험실은 쥐에서 100 비장 이식 이상을 수행 했습니다. 성공률은 90% 이상입니다, 모두의 생존에 의해 정의 된 마우스와 비장 후 수술 일 (포드) 1 또는 포드 7 (우리의 연구 종점)에 접목. 비장 이식의 생존은 비장 세포의 거시적 외관 및 유 세포 분석기 분석에 의해...

토론

강력한 증거가 나왔다 비장 유래 단 핵 구는 동맥 경화 증 등의 멸 균 염증 과정에서 중요 한 역할을 한다¹⁹, 급성 허 혈 성 뇌 (²⁰ ) 또는 폐 부상¹⁸뿐만 아니라 심근 I/R 부상 및 리 모델링²¹,^22,23. 이 보고서는 심혈 관 질환이 중요 한 (특히 그것은 세계적으로 번호를 하나의 살?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine	Wyeth	206205-01
Xylazine	Lloyd Laboratories	139-236
Heparin solution	Abraxis Pharmaceutical Products	504031
Injection grade normal saline	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-20
70% Ethanol	Pharmco Products Inc.	111000140
ThermoCare Small Animal ICU System	Thermocare, Inc.
Adson Forceps	Roboz Surgical Instruments	RS-5230
Derf Needle Holder	Roboz Surgical Instruments	RS-7822
Extra Fine Micro Dissecting Scissors	Roboz Surgical Instruments	RS-5881
Micro-clip	Roboz Surgical Instruments	RS-5420
7-0 silk	Braintree Scientific	SUT-S 103
11-0 nylon on 4-mm (3/8) needle	Sharpoint DR4	AK-2119
Ms CD45.2 antibody	BD Bioscience	553772
Ms CD45.1 antibody	BD Bioscience	553776
Ms CD11b antibody	BD Bioscience	557657
Ms B220 antibody	BD Bioscience	553089
Ms Ly6C antibody	eBioscience	48-5932-80
Ms Ly6G antibody	BD Bioscience	561236
Ms F4/80 antibody	BD Bioscience	565614
Ms CD11c antibody	BD Bioscience	558079
Ms CD3 antibody	eBioscience	48-0032-82
Ms CD4 antibody	BD Bioscience	552051
Ms CD8 antibody	BD Bioscience	563786
LIVE/DEAD™ Fixable Violet Dead Cell Stain Kit	Thermo Fisher	L34955