Un modello murino del trapianto di milza eterotopica vascolarizzata per studiare la biologia delle cellule della milza e l'immunità ai trapianti

Riepilogo

Questo protocollo descrive le fasi chirurgiche di un modello murino di trapianto di milza eterotopica vascolarizzata, un modello tecnicamente impegnativo che può fungere da potente strumento per studiare il destino e la longevità delle cellule della milza, i meccanismi della milza distinta popolazioni di cellule nella progressione della malattia e immunità ai trapianti.

Abstract

La milza è un organo linfoide unico che svolge un ruolo critico nell'omeostasi dei sistemi immunitari e ematopoietici. I pazienti che sono stati sottoposti a splenectomia indipendentemente dalle cause precipitose sono inclini a sviluppare un'infezione post-splenectomia travolgente e sperimentano un aumento dei rischi di trombosi venosa profonda e neoplasie maligne. Recentemente, studi epidemiologici hanno indicato che la splenectomia potrebbe essere associata al verificarsi di malattie cardiovascolari, suggerendo che le funzioni fisiologiche della milza non sono ancora state pienamente riconosciute. Qui, introduciamo un modello murino di trapianto di milza eterotopica vascolarizzata, che non solo può essere utilizzato per studiare la funzione e l'attività comportamentale dei sottogruppi di cellule immunitarie spleniche in diversi processi biologici, ma può anche essere un potente strumento per testare il potenziale terapeutico del trapianto di milza in certe malattie. Le principali fasi chirurgiche di questo modello includono la raccolta della milza del donatore, la rimozione della milza nativa ricevente e la rivascolarizzazione del trapianto di milza. Usando ceppi di topo Congenici (ad es. topi con CD 45.1/CD 45.2 background), abbiamo osservato che dopo il trapianto syngeneico, entrambi i linfociti splenici e le cellule mieloidi derivate dal donatore migrarono fuori dal trapianto già nel giorno 1 post-operatorio, in concomitanza con l'afflusso di molteplici tipi di cellule riceventi, generando così una chimera unica.  Nonostante le tecniche relativamente impegnative, questa procedura può essere eseguita con > 90% tasso di successo. Questo modello consente di tracciare il destino, la longevità e la funzione dei splenociti durante lo steady state e in un setting di malattia a seguito di un trapianto di milza, offrendo così una grande opportunità per scoprire il ruolo distinto delle cellule immunitarie derivate dalla milza in diversi processi di malattia.

Introduzione

La milza è il più grande organo linfoide secondario nel corpo ed è critica nei sistemi immunitari e ematopoietici. Le sue funzioni sono principalmente svolte da due compartimenti morfologicamente distinti, la polpa rossa e la polpa bianca¹. La polpa rossa è un reticolo tridimensionale di seni venosi e corde spleniche costituite da fibre reticolari, cellule reticolari e macrofagi associati. Questa struttura unica permette alla polpa rossa di agire come un filtro del sangue efficace che rimuove i materiali estranei e gli eritrociti vecchi o danneggiati. La polpa bianca comprende i follicoli, la zona marginale e le guaine linfoidi periarteriolari (PALS) ed è un sito importante per l'intrappolamento e l'elaborazione di antigene, la produzione di linfociti, la trasformazione, la proliferazione e la maturazione². Tuttavia, la milza è stata comunemente considerata come un organo dispensabile perché altri organi linfatici, come i linfonodi, possono anche svolgere alcune delle sue funzioni e la perdita della milza non porta di solito alla morte. La splenectomia è stata quindi ampiamente eseguita come metodo terapeutico per i pazienti con lesione splenica o malattie ematologiche benigne³. Tuttavia, i pazienti con splenectomia affrontano una serie di complicazioni a lungo termine. Le infezioni batteriche sono le complicanze più riconosciute della splenectomia^4,5. Recentemente, la schiacciante sepsi post-splenectomia è stata riconosciuta come una complicazione intensiva di splenectomia associata ad un'alta mortalità⁶. Inoltre, recenti studi epidemiologici indicano che la splenectomia può essere associata al verificarsi di malattie cardiovascolari, suggerendo che ulteriori funzioni fisiologiche della milza restano da esplorare^7,8.

Nella clinica sono stati utilizzati sia l'autotrandisplazione della milza che l'allotrapianto della milza. Attualmente, la milza autotrandisplazione impiantando sezioni di tessuto splenico in sacchetti creati nel maggiore omento è considerata l'unica possibilità per preservare la funzione splenica dopo la splenectomia traumatica^9,10. Tuttavia, l'efficacia di questo intervento chirurgico è discutibile come complicazioni post-chirurgia come necrosi asettica del tessuto splenico e piccola ostruzione intestinale a causa di aderenze postoperatorie potrebbe verificarsi¹¹. L'allotrapianto della milza è coinvolto nel trapianto multiviscerale¹². Le evidenze cliniche del trapianto multiviscerale suggeriscono che l'allotrapianto della milza può svolgere un ruolo protettivo nel rigetto dell'alloinnesto dell'intestino tenue senza causare la malattia del trapianto contro l'ospite (GVHD)¹². Eppure la letteratura riguardante l'effetto benefico dell'allotrapianto della milza come componente del trapianto multiviscerale è ancora limitata e i meccanismi sottostanti restano da definire. Nel 2006, Yair Reisner et al. ha riferito che trapiantare il tessuto della milza embrionale suina che non ha cellule T ai topi potrebbe curare l'emofilia A, una malattia genetica senza causare GVHD¹³, sostenendo che il trapianto di milza detiene una promessa terapeutica in alcune malattie. Pertanto, vi è la necessità di ulteriori indagini sul potenziale terapeutico del trapianto di milza.

I modelli animali di trapianto di milza sono preziosi per esplorare la funzione non apprezzata delle cellule immunitarie derivate dalla milza nella progressione della malattia e per testare il potenziale effetto terapeutico del trapianto di milza. I modelli sperimentali di trapianto di milza interi sono stati documentati fin dai primi anni del 1900, come Recensito da Cohen¹⁴. Nel 1969, Coburn Richard J. e Lee et al. dettagliato la tecnica del trapianto di milza in ratti^15,16. Più di recente, Swirski FK et al. ha descritto un modello murino di trapianto di milza¹⁷. Rispetto ai modelli di ratto, i modelli murini di trapianto di milza sono più attraenti a causa dei suoi numerosi vantaggi intrinseci. Ad esempio, utilizzando un modello di mouse, possiamo accedere a un'ampia varietà di reagenti non disponibili a quello dei modelli di ratto. Inoltre, utilizzando topi Congenici (ad es. topi con CD 45.1/CD 45.2 background), un trapianto di milza singenici permette di tracciare il destino, la longevità e la funzione delle splenociti¹⁸. Sulla base del lavoro di Swirski FK et al.¹⁷, abbiamo ulteriormente istituito questo protocollo semplificato e migliorato del trapianto di milza nei topi. Il protocollo descritto di seguito combina l'affidabilità e la fattibilità in modo standardizzato e può essere utilizzato come strumento per studiare la biologia della milza e l'immunità ai trapianti.

Protocollo

Tutte le procedure e l'uso animale in questo studio sono stati eseguiti secondo protocolli approvati dal comitato interno per la cura e l'uso degli animali della Northwestern University (IACUC). In questo studio, 8 a 10 settimana vecchio CD 45.2 e CD 45.1 topi (entrambi su sfondo BALB/c, dal laboratorio di Jackson) sono stati utilizzati come donatori di milza e riceventi, rispettivamente, per creare modelli di trapianto di milza singenici. Tutti gli animali sono stati ospitati nell'ambiente sterile nelle strutture animali della Northwestern University. Il lubrificante per gli occhi è stato applicato a tutti i topi post-anestetizzazione per prevenire la secchezza.

1. preparazione chirurgica, anestetizzazione, e regime di analgesia

1. Posizionare un telo monouso sterile (45,7 cm x 66 cm) sulla piattaforma chirurgica. Afferrare delicatamente il mouse, iniettare ketamina (50 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) intraperitoneale (i. p) per l'anestesia, e iniettare 0,05 mg/kg di buprenorfina per via sottocutanea per l'analgesia.
2. Assicurarsi che la profondità di anestesia di toe-pizzico, radersi i capelli in tutta l'area dell'addome con un rasoio e posizionare il mouse sulla piattaforma chirurgica sterile sotto il microscopio operativo a 6-10x ingrandimento.

2. raccolta della milza del donatore

1. Sterilizzare l'addome con un tampone di preparazione di alcol, fissare gli arti con nastro chirurgico, e fare un 3-4 cm linea mediana verticale incisione cutanea dal pube al processo xifoideo con le forbici.
2. Ritrarre la parete addominale con retrattili sterili realizzati con graffette. Spostare l'intestino sul fianco destro dell'addome (sinistra del chirurgo) con un batuffolo di cotone sterile per esporre la milza. Cauterizzare la breve vena gastrica attaccata alla milza con una cautela sterile a bassa temperatura (Figura 1a). Collocare un pezzo di garza sterile impregnati di 37 ° c di soluzione salina sulla milza per mantenerlo umido (Figura 1B).
3. Separare e mobilitare la vena portale dal tessuto pancreatico (Figura 1C) legando i rami della vena portale (vena pancreaticoduodenale superiore e vena gastrica destra); Posizionare una sutura intorno alla vena del portale distale dalla vena splenica (Figura 1D).
4. Capovolgere la milza sul lato destro per esporre l'aorta e il tronco celiaca con l'arteria splenica (Figura 1e). Dissect e mobilizza l'arteria aortica-celiaca-splenica legando l'arteria epatica e l'arteria gastrica; Posizionare una sutura intorno all'aorta prossimale all'arteria celiaca (Figura 1F-G).
5. Iniettare 100 unità internazionali (UI) di eparina nella vena cava inferiore (IVC) per eparinizzare l'intero corpo e attendere 3 minuti per assicurare che l'eparina prenda effetti. Legare l'aorta prossimale all'arteria celiaca, traslegare la vena portale, quindi perfutilizzare tutto il corpo utilizzando 10 mL di soluzione salina fredda (4 ° c) eparinizzata (10 mL/20 s) dall'aorta addominale distale al tronco celiaca (Figura 1h).
6. Raccogliere l'innesto della milza in blocco con il segmento aortico-celiaco-splenico associato e la vena portale insieme a un segmento di vena splenica e una piccola porzione di tessuto pancreatico. Conservare l'innesto in 5 mL di 4 ° c di soluzione salina prima del trapianto. Euthanize il topo per dislocazione cervicale.

3. la splenectomia del ricevente e l'impianto di innesto della milza

1. Posizionare un tampone riscaldante sulla piattaforma chirurgica e regolare la temperatura a 37 ° c. Posizionare un drappo sterile (45,7 cm x 66 cm) sulla parte superiore del tappetino riscaldante per creare una piattaforma chirurgica sterile. Ripetere i passaggi 2,1 e 2,2 per la preparazione chirurgica e l'anestetizzazione. Fare un 3-4 cm linea mediana incisione e ritrarre la parete addominale come descritto nel passo 2,1 e passo 2,2.
2. Spostare con cautela l'intestino sul lato destro del mouse con un batuffolo di cotone sterile per esporre la milza del ricevente. Ligare la vena splenica e l'arteria e rimuovere la milza.
3. Spostare con cautela l'intestino sul lato sinistro del mouse e coprire l'intestino con garza umida (impregnata con soluzione salina sterile a 37 ° c). Dissect e legare i rami lombari dell'aorta infrarenare e IVC; a croce l'aorta infrarenale e l'IVC utilizzando due morsetti microvascolari da 4 mm.
4. Posizionare una sutura di nylon 11-0 attraverso l'aorta infrarenale (a pieno spessore) e ritrarre per creare un'aortotomia ellittica da un singolo taglio con microforbici (la lunghezza dovrebbe corrispondere al diametro dell'aorta del donatore, Figura 2a). Perforare l'IVC utilizzando un ago da 30 G per creare una venotomia ellittica ed estendere l'apertura al portale donatore con una lunghezza corrispondente con microforbici (Figura 2a).
5. Eliminare il sangue intraluminale o il coagulo di sangue (nell'aorta e nell'IVC) con 500 μL di soluzione salina eparinizzata (10 unità/mL).
6. Posizionare l'innesto della milza nel fianco destro dell'addome del mouse ricevente; identificare con attenzione il bracciale aortico del donatore e la vena portale del donatore. Dopo essersi assicurati che i vasi non siano attorcigliati, coprire l'innesto della milza con una garza impregnata di soluzione salina fredda (4 ° c).
7. Collegare la cuffia aortica del donatore all'apice prossimale e distale dell'aortaotomia del ricevente con due suture di soggiorno (11-0 nylon sutura, come sotto) (Figura 2B, C). Fare un'anastomosi con 2-3 morsi di suture continue in nylon 11-0 tra il polsino aortico del donatore e l'aortaotomia del ricevente (parete anteriore) (Figura 2D). Capovolgere il innesto della milza sul lato sinistro del ricevente; fare l'anastomosi tra il polsino aortico del donatore e l'aortotomia del ricevente (parete posteriore) (Figura 2e).
8. Eseguire un'anastomosi per collegare la vena portale del donatore alla parete posteriore dell'IVC del ricevente, utilizzando da 4 a 5 morsi di sutura continue all'interno dell'IVC e quindi chiudere la sutura all'esterno dell'IVC (Figura 2F, G).
9. Rilasciare i morsetti del recipiente e utilizzare il tampone di cotone sterile per tamponare il sanguinamento fino a quando il colore della milza viene recuperato (Figura 2h).
10. Chiudere l'addome con una sutura di Vicryl riassorbibibile sintetica 5-0 in un modello continuo. Chiudere lo strato di pelle con una sutura di nylon 5-0 in un motivo interrotto.
    Nota: Per i passaggi 4.7-4.8, in alternativa, fare un'anastomosi tra la vena portale del donatore e il IVC del ricevente prima (passo 4,8); quindi fare un'anastomosi tra il polsino aortico del donatore e la parete posteriore dell'aortotomia del ricevente, utilizzando da 2 a 3 sutura continue all'interno dell'aorta e chiudere la sutura all'esterno dell'aorta.

4. recupero degli animali

1. Iniettare 1 mL di soluzione salina calda per via sottocutanea tramite 4 sedi separate (0,25 mL/posizione) dopo aver chiuso l'addome.
2. Tenere il mouse in un incubatore a temperatura controllata (30 ° c) per le prime ore successive alla post-operazione, monitorare il mouse fino a quando non ha recuperato una coscienza sufficiente, quindi trasferire il mouse in una nuova gabbia pulita con cibo e acqua regolari, con un tampone riscaldante (30 ° c ) sotto la gabbia. Mantenere il mouse post-chirurgia in una gabbia separata.

5. gestione del dolore post-chirurgico

1. Iniettare 0,05 mg/kg di buprenorfina per via sottocutanea 24 h e 48 h post-intervento chirurgico per mantenere il regime di analgesia.

Risultati

L'intera procedura del trapianto di milza del topo può essere completata entro 90 minuti da microchirurghi esperti. Il nostro laboratorio ha eseguito oltre 100 trapianti di milza nei topi. Il tasso di successo è superiore al 90%, come definito dalla sopravvivenza sia del topo ricevente che dell'innesto della milza al giorno post-operatorio (POD) 1 o POD 7 (il nostro endpoint di studio). La sopravvivenza dell'innesto della milza è stata confermata dall'aspetto macroscopico e dall'analis...

Discussione

Prove convincenti suggeriscono che i monociti derivati dalla milza giocano un ruolo importante nei processi infiammatori sterili come l'aterosclerosi¹⁹, il cervello ischemico acuto²⁰ o il trauma polmonare¹⁸, così come I/R del miocardio lesioni e rimodellamento^21,22,23. Questi rapporti evidenziano il ruolo di sotto-riconoscimento della milza in molte malatti...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine	Wyeth	206205-01
Xylazine	Lloyd Laboratories	139-236
Heparin solution	Abraxis Pharmaceutical Products	504031
Injection grade normal saline	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-20
70% Ethanol	Pharmco Products Inc.	111000140
ThermoCare Small Animal ICU System	Thermocare, Inc.
Adson Forceps	Roboz Surgical Instruments	RS-5230
Derf Needle Holder	Roboz Surgical Instruments	RS-7822
Extra Fine Micro Dissecting Scissors	Roboz Surgical Instruments	RS-5881
Micro-clip	Roboz Surgical Instruments	RS-5420
7-0 silk	Braintree Scientific	SUT-S 103
11-0 nylon on 4-mm (3/8) needle	Sharpoint DR4	AK-2119
Ms CD45.2 antibody	BD Bioscience	553772
Ms CD45.1 antibody	BD Bioscience	553776
Ms CD11b antibody	BD Bioscience	557657
Ms B220 antibody	BD Bioscience	553089
Ms Ly6C antibody	eBioscience	48-5932-80
Ms Ly6G antibody	BD Bioscience	561236
Ms F4/80 antibody	BD Bioscience	565614
Ms CD11c antibody	BD Bioscience	558079
Ms CD3 antibody	eBioscience	48-0032-82
Ms CD4 antibody	BD Bioscience	552051
Ms CD8 antibody	BD Bioscience	563786
LIVE/DEAD™ Fixable Violet Dead Cell Stain Kit	Thermo Fisher	L34955