Dalak hücre biyoloji ve nakli bağışıklık eğitimi için vascularized heterotopik dalak transplantasyonunun fare modeli

Özet

Bu protokol, dalak hücrelerin kaderi ve uzun ömürlü çalışmasında güçlü bir araç olarak hizmet veren, farklı dalak mekanizmaları olan vaskülarized heterotopik dalak transplantasyonunun bir fare modelinin cerrahi adımlarını ayrıntılarıyla araştırabilir. hastalık progresyonunda hücre nüfusa ve nakli bağışıklık.

Özet

Dalak, bağışıklık ve hematopoetik sistemlerin homeostazı 'te kritik bir rol oynayan benzersiz bir lenfoid organıdır. Ne olursa olsun çökelme nedenleri splenektomi geçirmiş hastalar ezici bir sonrası splenektomi enfeksiyon geliştirmek ve derin venöz tromboz ve malignite riskleri artan deneyim eğilimli. Son zamanlarda, epidemiyolojik çalışmalar splenektomi kardiyovasküler hastalıkların oluşumu ile ilişkili olabileceğini belirtti, dalak fizyolojik fonksiyonları henüz tam olarak tanınmadı düşündürmektedir. Burada, sadece farklı biyolojik süreçlerde splenik immün hücre alt setlerinin fonksiyon ve davranışsal aktivitesini incelemek için kullanılabilecek değil, aynı zamanda test etmek için güçlü bir araç olabilir vaskülarize heterotopik dalak nakli, bir fare modeli tanıtmak bazı hastalıklarda dalak nakli terapötik potansiyeli. Bu modelin Ana cerrahi adımlar donör dalak hasat içerir, alıcı yerli dalak kaldırılması, ve dalak greft revaskülarizasyon. Konjenik fare suşları (örn., CD 45.1/CD 45.2 arka planlar ile fareler) kullanarak, syngeneic transplantasyondan sonra, hem donör türetilen splenik lenfositler ve miyeloid hücreler, ameliyat sonrası gün olarak erken olarak greft dışına göç ederek böylece benzersiz bir Chimera üreten alıcı hücrelerinin birden fazla tür akını.  Nispeten zorlu tekniklere rağmen, bu prosedür >% 90 başarı oranı ile yapılabilir. Bu model, sürekli devlet sırasında ve dalak nakli takiben bir hastalık ayarında, böylece dalak türevi bağışıklık hücrelerinin farklı rolünü keşfetmek için büyük bir fırsat sunan, kaderin, uzun ömürlü ve splenanositlerin fonksiyonunu izleme sağlar farklı hastalık süreçleri.

Giriş

Dalak vücutta en büyük ikincil lenfoid organ ve bağışıklık ve hematopoetik sistemlerde kritik öneme sahiptir. Fonksiyonları öncelikle iki morfolojik ayrı bölmeler, kırmızı hamuru ve beyaz hamuru¹tarafından gerçekleştirilir. Kırmızı selüloz, venöz sinüslerin ve retiküler liflerden, retiküler hücrelerden ve ilişkili makrofajlardan oluşan splenik kabloların üç boyutlu meshişidir. Bu eşsiz yapı, kırmızı hamuru, yabancı maddeleri ve eski veya hasarlı eritrositleri kaldıran etkili bir kan filtresi olarak hareket etmesini sağlar. Beyaz hamuru foliküller, marjinal bölge ve periarteriolar lenfoid Kılıf (PALS) içerir ve antijen bindirme ve işleme, lenfosit homing, dönüşüm, proliferasyon ve olgunlaşma için önemli bir sitedir². Yine de, dalak genellikle bir vazgeçilebilir organ olarak kabul edilmiştir, çünkü diğer lenfatik organlar, lenf nodları gibi, ayrıca bazı işlevlerini yürütmek ve dalak kaybı genelde ölüme yol açmaz. Splenektomi bu nedenle splenik yaralanma veya benign hematolojik hastalıklar olan hastalar için terapötik bir yöntem olarak yaygın olarak yapılmıştır³. Ancak splenektomi olan hastalarda uzun süreli komplikasyonlar görülmektedir. Bakteriyel enfeksiyonlar splenektomi en iyi tanınan komplikasyonlarıdır^4,5. Son zamanlarda, ezici sonrası splenektomi sepsis yüksek mortalite ile ilişkili splenektomi yoğun bir komplikasyon olarak tanınmıştır⁶. Dahası, son epidemiyolojik çalışmalar splenektomi kardiyovasküler hastalıkların oluşumu ile ilişkili olabileceğini gösteriyor, dalak daha fazla fizyolojik fonksiyonların incelenecek kalır düşündürmektedir,^7,8.

Klinikte hem dalak ototransplantasyon hem de dalak allotransplantasyon kullanılmıştır. Şu anda, splenik doku bölümlerini büyük omentum 'da oluşturulan torbalar içine yerleştirerek dalak ototransplantasyon, travmatik splenektomi sonrası splenik fonksiyon korunması için tek olasılık olarak kabul edilir^9,10. Bununla birlikte, bu ameliyatın etkinliği, Dalik dokuda aseptik nekroz ve postoperatif yapışmalar nedeniyle küçük barsak tıkanıklığı gibi cerrahi sonrası komplikasyonlar ortaya çıkabilir¹¹. Dalak allotransplantasyonu çok viseral transplantasyon¹²' de yer almaktadır. Multivisceral transplantasyondan gelen klinik kanıtlar, dalak allonakli 'nin, Greft-versus-Host hastalığına (GVHD)¹²' ye neden olmadan küçük barsak allogreft reddi içinde koruyucu rol oynayabileceği anlamına gelmiştir. Ancak dalak allotransplantasyonunun çok viseral transplantasyonun bir bileşeni olarak yararlı etkisi ile ilgili literatür hala sınırlıdır ve temel mekanizmalar tanımlanmaya devam eder. 2006 yılında, Yair Reisner ve ark., GVHD¹³neden olmadan bir genetik hastalık hemofili a tedavi edebilir fareler hiçbir T hücreleri olan nakil domuz embriyonik dalak doku bildirdi, bu dalak transplantasyonu destekleyen terapötik söz tutar Bazı hastalıklar. Bu nedenle, dalak nakli terapötik potansiyeli hakkında daha fazla soruşturma için bir ihtiyaç vardır.

Dalak transplantasyonunun hayvan modelleri, hastalık ilerlemesinde dalak türevi immün hücrelerin tanınmaz fonksiyonunu keşfetmek ve dalak transplantasyonunun potansiyel terapötik etkisini test etmek için değerlidir. Deneysel tüm dalak nakil modelleri, Cohen¹⁴tarafından gözden geçirildiği gibi 1900 ' lerin başlarında belgelenmiştir. 1969 yılında, Coburn Richard J. ve Lee et al. fareler^15,16dalak transplantasyon tekniği detaylı. Daha Geçenlerde, Swirski FK ve ark. dalak nakli¹⁷bir fare modeli nitelendirdi. Sıçan modelleriyle karşılaştırıldığında, dalak transplantasyonunun fare modelleri, çeşitli doğal avantajları nedeniyle daha çekicidir. Örneğin, bir fare modeli kullanarak, biz sıçan modelleri için kullanılamıyor reaktifler geniş bir çeşitlilik erişebilirsiniz. Ayrıca, konjenik fareler kullanarak (örneğin, CD 45.1/CD 45.2 arka plan ile fareler), bir syngeneic dalak nakli mümkün kaderi izlemek için yapar, uzun ömürlü, ve splenanosit fonksiyonu¹⁸. Swirski FK ve ark.¹⁷' nin çalışmalarına dayanarak, farelerde Bu basitleştirilmiş ve gelişmiş dalak nakli protokolünü kurduk. Aşağıda açıklanan protokol hem güvenilirlik hem de fizibilite standartlaştırılmış bir şekilde birleştirir ve dalak biyoloji ve nakil bağışıklık çalışması için bir araç olarak kullanılabilir.

Protokol

Bu çalışmada tüm prosedürler ve hayvan kullanımı Northwestern Üniversitesi Iç hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (ıABUC) tarafından onaylanmış protokollere göre yapılmıştır. Bu çalışmada, 8 ila 10 hafta eski erkek CD 45.2 ve CD 45.1 fareler (hem BALB/c arka planda, Jackson laboratuvarından) dalak bağış ve alıcılar olarak kullanılan, sırasıyla syngeneic dalak transplantasyon modelleri oluşturmak için. Tüm hayvanlar Northwestern Üniversitesi hayvan tesislerinde steril ortamda yer aldı. Göz yağlayıcısı, kuruluğu önlemek için anestezinin sonrası tüm farelere uygulandı.

1. cerrahi hazırlık, Anestezizasyon ve Analgesia rejimi

1. Cerrahi platformda steril tek kullanımlık bir örtü (45,7 cm x 66 cm) yerleştirin. Yavaşça fareyi kapmak, ketamin enjekte (50 mg/kg) ve xylazine (10 mg/kg) intraperitoneal (i. p) anestezi için, ve enjekte 0,05 mg/kg buprenorfik analjezi için subkutan.
2. Toe-tutam ile anestezi derinliği sağlamak, bir jilet ile tüm karın bölgesinde saç tıraş ve 6-10X büyütme işletim mikroskop altında Steril Cerrahi platforma fare yerleştirin.

2. donör dalak hasat

1. Karın bir alkol hazırlık Pad ile sterilize, cerrahi bant ile ekstremite güvenli ve makas ile ksifoid süreci pubis bir 3-4 cm orta hat dikey cilt kesi yapmak.
2. Karın duvarını, kağıt klipslerden yapılmış steril retraktörler ile geri çekin. Bağırsakları karın (cerrahın sol) tarafında, dalağı açığa çıkarmak için steril bir pamuklu çubukla sağ tarafa taşıyın. Bir steril düşük sıcaklık koter ile dalak bağlı kısa gastrik ven cauterize (Şekil 1a). Nemli tutmak için dalak üzerinde 37 °C serum tuz ile ıslatılmış steril bir gazlı bez parçası yerleştirin (Şekil 1B).
3. Portal ven dalları (üstün pankreaticoduodenal ven ve sağ gastrik ven) bağlanması ile pankreas dokusundan (Şekil 1C) portalı ven ayrı ve seferber; splenik ven distal portal ven etrafında bir sütür koyun (Şekil 1D).
4. Splenik arter ile aort ve çölyak gövde ortaya çıkarmak için sağ tarafına dalak çevirin (Şekil 1E). Hepatik arter ve gastrik arter bağlanarak aort-Çölyak-splenik arter dissect ve seferber; aort etrafında çölyak arter (Şekil 1F-G) proksimal bir sütür yerleştirin.
5. 100 uluslararası birimler (ıU) heparin inferior vena cava (ıVC) içine enjekte tüm vücudu heparinize ve heparin etkileri sağlamak için 3 dakika bekleyin. Aort, çölyak arter için proksimal, portal ven Transect ve daha sonra 10 ml heparinize soğuk (4 °c) tuzlu (10 ml/20 s) abdominal aort Çölyak gövdesine distal (Şekil 1h) kullanarak tüm vücudu serpmek.
6. Dalak greft en bloğu ile ilişkili aort-Çölyak-splenik segment ve portal ven ile birlikte splenik ven bir segment ve pankreatik doku küçük bir kısmı ile toplayın. Nakil işleminden önce 5 mL 4 °C ' lik tuz içinde greftini koruyun. Servikal dislocation fare ötenize.

3. alıcı splenektomi ve dalak greft Implantasyonu

1. Cerrahi platforma bir ısıtma yastığı yerleştirin ve sıcaklığı 37 °C ' ye ayarlayın. Steril bir cerrahi platform oluşturmak için ısıtma yastığı üstüne steril bir örtü (45,7 cm x 66 cm) yerleştirin. Cerrahi hazırlama ve anestezizasyon için 2,1 ve 2,2 adımları yineleyin. 3-4 cm orta hat kesi yapın ve adım 2,1 ve adım 2,2 ' de açıklandığı gibi karın duvarını geri çekin.
2. Alıcı dalağını açığa çıkarmak için, bağırsaklarını dikkatli bir şekilde Mouse 'un sağ tarafına steril bir pamuklu çubukla taşıyın. Splenik ven ve arter ligate ve dalağı çıkarın.
3. Dikkatle fare sol tarafına bağırsak hareket ve ıslak gazlı bez ile bağırsak kapağı (steril 37 °C tuz ile ıslatılmış). İnfrarenal aort ve IVC 'nin lomber dallarını ortadan sökme ve indirgeme uzman; Iki 4 mm mikrovasküler kelepçeleri kullanarak infrarenal aort ve ıVC Çapraz kelepçe.
4. İnfrarenal aort (tam kalınlıkta) ile bir 11-0 naylon sütür yerleştirin ve mikromakas ile tek bir kesim ile eliptik aotomi oluşturmak için geri çekilmelidir (uzunluk donör aort çapı maç olmalıdır, Şekil 2a). Bir eliptik venotomi oluşturmak için 30 G iğne kullanarak ıVC delin ve mikromakas kullanarak donör portalı ven-eşleşen uzunlukta açılması uzatmak (Şekil 2a).
5. İntraluminal kan veya kan pıhtısı (aort ve IVC) ile 500 μL heparinize tuz (10 adet/ml) ile temizleyin.
6. Dalak greftini alıcının fare karnının sağ kanadına yerleştirin; Donörün aort manşet ve donör portal ven dikkatle tanımlayın. Damarların bükülmez olduğundan emin olduktan sonra, dalak greftini soğuk (4 °C) tuz ile ıslatılmış gazlı bez ile kapla.
7. Donör aort manşeti, alıcının aortotominin proksimal ve distal zirvine iki konaklama sütür (11-0 naylon dikiş, aşağıda aynı) (Şekil 2B, C) ile bağlayın. 2-3, donör aort manşet ve alıcının aortaotomi (ön duvar) (Şekil 2D) arasında sürekli 11-0 naylon dikiş ısırıkları ile anastomoz yapın. Dalak greftini alıcının sol tarafına çevirin; donör aort manşet ve alıcının aotomi (arka duvar) arasında anastomoz yapmak (Şekil 2E).
8. Alıcının portal ven, ıVC içinde sürekli sütürler 4 ila 5 ısırıkları kullanarak, alıcının ıVC posterior duvara bağlamak için bir anastomoz gerçekleştirin ve sonra ıVC dışında sütür kapatın (Şekil 2F, G).
9. Gemi kelepçelerini serbest bırakın ve dalak rengi kurtarılana kadar kanamayı tamponad etmek için steril pamuklu çubukla kullanın (Şekil 2H).
10. Sürekli bir desen 5-0 sentetik emici vicryl sütür ile karın kapatın. Kesilmiş bir desen bir 5-0 naylon sütür ile cilt tabakası kapatın.
    Not: Alternatif olarak 4.7-4.8 adımları için donör portal ven ve alıcının ıVC arasında anastomoz yapın (adım 4,8); daha sonra donör aort manşet ve alıcının aotunun posterior duvarı arasında bir anastomoz yapmak, aort içinde 2 ila 3 sürekli sütürler kullanarak ve aort dışında sütür kapatın.

4. hayvan kurtarma

1. Karın kapattıktan sonra 4 ayrı yer (0,25 mL/konum) aracılığıyla subkutan 1 mL sıcak tuz enjekte et.
2. Hareket sonrası ilk birkaç saat için sıcaklık kontrollü bir kuluçta (30 °C) fare tutun, yeterli bilinç geri kazanıncaya kadar fareyi izlemek ve sonra normal yiyecek ve su ile yeni bir temiz kafes, bir Isıtma Pad (30 ° c) ile fareyi aktarmak ) kafesin altında. Fare ameliyatı sonrası ayrı bir kafeste tutun.

5. cerrahi sonrası ağrı yönetimi

1. Enjekte 0,05 mg/kg buprenorfik subkutan 24 h ve 48 h sonrası cerrahi analjezi rejimi korumak için.

Sonuçlar

Fare dalak nakli tüm prosedür deneyimli mikrocerrahlar tarafından 90 dk içinde tamamlanabilir. Laboratuvarımız farelerde 100 üzerinde dalak nakli gerçekleştirdi. Başarı oranı her iki alıcı fare ve dalak greft sonrası ameliyat günü (POD) 1 veya POD 7 (bizim çalışma uç noktası) hayatta kalma tarafından tanımlanan% 90 üzerinde. Dalak greftinin hayatta kalması, splenanositlerin makroskopik görünümü ve akış sitometri analizi ile doğrulandı. Deneyimimize dayana...

Tartışmalar

Çekici kanıtlar, dalak türevi monositlerin ateroskleroz¹⁹, akut iskemik beyin²⁰ veya akciğer hasarı¹⁸gibi steril inflamatuar süreçlerde önemli bir rol oynarlar, hem de miyokard I/R yaralanma ve remodeling^21,22,23. Bu raporlar, kalp-damar hastalığının önemli bir (özellikle de bir numaralı katil küresel olduğu verilen) bir çok kronik hastalı...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine	Wyeth	206205-01
Xylazine	Lloyd Laboratories	139-236
Heparin solution	Abraxis Pharmaceutical Products	504031
Injection grade normal saline	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-20
70% Ethanol	Pharmco Products Inc.	111000140
ThermoCare Small Animal ICU System	Thermocare, Inc.
Adson Forceps	Roboz Surgical Instruments	RS-5230
Derf Needle Holder	Roboz Surgical Instruments	RS-7822
Extra Fine Micro Dissecting Scissors	Roboz Surgical Instruments	RS-5881
Micro-clip	Roboz Surgical Instruments	RS-5420
7-0 silk	Braintree Scientific	SUT-S 103
11-0 nylon on 4 mm (3/8) needle	Sharpoint DR4	AK-2119
Ms CD45.2 antibody	BD Bioscience	553772
Ms CD45.1 antibody	BD Bioscience	553776
Ms CD11b antibody	BD Bioscience	557657
Ms B220 antibody	BD Bioscience	553089
Ms Ly6C antibody	eBioscience	48-5932-80
Ms Ly6G antibody	BD Bioscience	561236
Ms F4/80 antibody	BD Bioscience	565614
Ms CD11c antibody	BD Bioscience	558079
Ms CD3 antibody	eBioscience	48-0032-82
Ms CD4 antibody	BD Bioscience	552051
Ms CD8 antibody	BD Bioscience	563786
LIVE/DEAD™ Fixable Violet Dead Cell Stain Kit	Thermo Fisher	L34955