Un modelo de ratón del trasplante de bazo heterotópico vascularizado para estudiar biología de células del bazo y inmunidad al trasplante

Resumen

Este protocolo detalla los pasos quirúrgicos de un modelo de ratón de trasplante de bazo heterotópico vascularizado, un modelo técnicamente desafiante que puede servir como una herramienta poderosa en el estudio del destino y la longevidad de las células del bazo, los mecanismos de distinto bazo las poblaciones celulares en progresión de la enfermedad e inmunidad al trasplante.

Resumen

El bazo es un órgano linfoide único que desempeña un papel crítico en la la homeostasis de los sistemas inmunológico y hematopoyético. Los pacientes que se han sometido a una esplenectomía, independientemente de las causas desencadenantes, son propensos a desarrollar una infección de post-esplenectomía abrumadora y experimentan un mayor riesgo de trombosis venosa profunda y neoplasias malignas. Recientemente, los estudios epidemiológicos indicaron que la esplenectomía podría estar asociada a la aparición de enfermedades cardiovasculares, lo que sugiere que las funciones fisiológicas del bazo aún no se han reconocido plenamente. Aquí, presentamos un modelo de ratón de trasplante de bazo heterotópico vascularizado, que no sólo se puede utilizar para estudiar la función y la actividad conductual de los subconjuntos de células inmunitarias esplénica en diferentes procesos biológicos, sino que también puede ser una herramienta poderosa para probar el potencial terapéutico del trasplante de bazo en ciertas enfermedades. Los principales pasos quirúrgicos de este modelo incluyen la cosecha del bazo del donante, la extirpación del bazo nativo receptor y la revascularización del injerto del bazo. Utilizando cepas de ratón Congénicos (p. ej., ratones con fondos de CD 45.1/CD 45.2), observamos que después del trasplante singénico, los linfocitos esplénicos derivados de donantes y las células mieloide migraron del injerto tan pronto como el día 1 postoperatorio, concomitantemente con la afluencia de múltiples tipos de células destinatarias, generando así una quimera única.  A pesar de las técnicas relativamente desafiantes, este procedimiento se puede realizar con > 90% tasa de éxito. Este modelo permite rastrear el destino, la longevidad y la función de los esplocitos durante el estado estacionario y en un entorno de enfermedad después de un trasplante de bazo, ofreciendo así una gran oportunidad para descubrir el papel distintivo de las células inmunes derivadas del bazo en diferentes procesos de la enfermedad.

Introducción

El bazo es el órgano linfoide secundario más grande del cuerpo y es crítico en los sistemas inmunológico y hematopoyético. Sus funciones se llevan a cabo principalmente por dos compartimentos morfológicamente distintos, la pulpa roja y la pulpa blanca¹. La pulpa roja es una malla tridimensional de senos venosos y cuerdas esplénica que consisten en fibras reticulares, células reticulares y macrófagos asociados. Esta estructura única permite que la pulpa roja actúe como un filtro sanguíneo eficaz que elimina los materiales extraños y los eritrocitos viejos o dañados. La pulpa blanca incluye folículos, zona marginal y vainas linfoides periarteriolares (PALS) y es un sitio importante para la captura y procesamiento de antígeno, el homing de linfocitos, la transformación, la proliferación y la maduración². Sin embargo, el bazo se ha considerado comúnmente como un órgano prescindible porque otros órganos linfáticos, como los ganglios linfáticos, también pueden llevar a cabo algunas de sus funciones y la pérdida del bazo no suele conducir a la muerte. Por lo tanto, la esplenectomía se ha realizado ampliamente como un método terapéutico para pacientes con lesión esplénica o enfermedades hematológicas benignas³. Sin embargo, los pacientes con esplenectomía enfrentan una serie de complicaciones a largo plazo. Las infecciones bacterianas son las complicaciones mejor reconocidas de la esplenectomía^4,5. Recientemente, la abrumadora sepsis post-esplenectomía ha sido reconocida como una complicación intensiva de la esplenectomía asociada a una alta mortalidad⁶. Por otra parte, estudios epidemiológicos recientes indican que la esplenectomía puede estar asociada a la ocurrencia de enfermedades cardiovasculares, lo que sugiere que aún quedan por explorar las funciones fisiológicas del bazo^7,8.

En la clínica se han utilizado tanto autotrasplante de bazo como alotrasplante de bazo. Actualmente, el autotrasplante de bazo mediante la implantación de secciones de tejido esplámico en bolsas creadas en el epiplón mayor se considera como la única posibilidad para preservar la función esplénica después de la esplenectomía traumática^9,10. Sin embargo, la eficacia de esta cirugía es discutible como complicaciones post-cirugía como necrosis aséptica del tejido esplémico y la obstrucción del intestino delgado debido a adherencias postoperatorias podrían ocurrir¹¹. La alotrasplante de bazo está implicada en el trasplante multivisceral¹². La evidencia clínica del trasplante multivisceral sugiere que el alotrasplante de bazo puede desempeñar un papel protector en el rechazo de los aloinjertos intestinales pequeños sin causar enfermedad de injerto contra huésped (EICH)¹². Sin embargo, la literatura sobre el efecto beneficioso del alotrasplante de bazo como componente del trasplante multivisceral sigue siendo limitada y los mecanismos subyacentes permanecen por definir. En 2006, Yair Reisner y otros informaron que el trasplante de tejido de bazo embrionario de cerdo que no tiene células T a los ratones podría curar la hemofilia a, una enfermedad genética sin causar la EICH¹³, apoyando que el transplante de bazo tiene una promesa terapéutica en ciertas enfermedades. Por lo tanto, es necesario seguir investigando sobre el potencial terapéutico del trasplante de bazo.

Los modelos animales de trasplante de bazo son valiosos para explorar la función no apreciada de las células inmunes derivadas del bazo en la progresión de la enfermedad, así como para probar el posible efecto terapéutico del trasplante de bazo. Se han documentado modelos experimentales de trasplantes de bazo enteros desde principios de 1900, según lo revisado por Cohen¹⁴. En 1969, Coburn Richard J. y Lee et al. detalló la técnica del trasplante de bazo en ratas^15,16. Más recientemente, SWIRSKI FK y otros describieron un modelo de ratón de trasplante de bazo¹⁷. En comparación con los modelos de ratas, los modelos de ratones de trasplante de bazo son más atractivos debido a sus diversas ventajas inherentes. Por ejemplo, al utilizar un modelo de ratón, podemos acceder a una amplia variedad de reactivos no disponibles para los modelos de ratas. Por otra parte, mediante el uso de ratones Congénicos (por ejemplo, ratones con CD 45.1/CD 45.2 fondo), un trasplante singénico de bazo hace posible rastrear el destino, la longevidad y la función de los esplocitos¹⁸. Basado en el trabajo de SWIRSKI FK et al.¹⁷, también establecimos este protocolo simplificado y mejorado de trasplante de bazo en ratones. El protocolo descrito a continuación combina la confiabilidad y la viabilidad de una manera estandarizada y se puede utilizar como una herramienta para estudiar la biología del bazo y la inmunidad al trasplante.

Protocolo

Todos los procedimientos y el uso de animales en este estudio se realizaron de acuerdo con los protocolos aprobados por el Comité interno de cuidado y uso de animales de la Universidad del noroeste (IACUC). En este estudio, de 8 a 10 semanas de edad, CD 45.2 y CD 45.1 ratones (tanto en el fondo BALB/c, del laboratorio Jackson) se utilizaron como donantes de bazo y receptores, respectivamente, para crear modelos de trasplante de bazo singénico. Todos los animales fueron alojados en el ambiente estéril en las instalaciones de animales de la Universidad de Northwestern. El lubricante ocular se aplicó a todos los ratones después de la anestesia para prevenir la sequedad.

1. preparación quirúrgica, anestesiación, y régimen de analgesia

1. Coloque un paño desechable estéril (45,7 cm x 66 cm) en la plataforma quirúrgica. Agarrar suavemente el ratón, inyectar ketamina (50 mg/kg) y xylazina (10 mg/kg) intraperitonealmente (i. p) para la anestesia, e inyectar 0,05 mg/kg de buprenorfina por vía subcutánea para la analgesia.
2. Asegure la profundidad de la anestesia con un pellizco, afeite el cabello en toda la zona del abdomen con una cuchilla y coloque el ratón sobre la plataforma quirúrgica estéril bajo el microscopio de operación a una magnificación de 6-10X.

2. cosecha del bazo del donante

1. Esterilizar el abdomen con una almohadilla de preparación de alcohol, asegurar las extremidades con cinta quirúrgica, y hacer una incisión de la piel vertical de 3-4 cm de línea media desde el pubis al proceso Apéndice xifoides con tijeras.
2. Retracción de la pared abdominal con retractores estériles hechos de clips de papel. Mueva los intestinos hacia el flanco derecho del abdomen (izquierda del cirujano) con un bastoncillo de algodón estéril para exponer el bazo. Cauterizar la vena gástrica corta unida al bazo con un cauterio estéril de baja temperatura (figura 1A). Coloque un pedazo de gasa estéril empapada con una solución salina de 37 ° c sobre el bazo para mantenerla húmeda (figura 1B).
3. Separar y movilizar la vena porta del tejido pancreático (figura 1C) ligando las ramas de la vena porta (vena pancreática superior y vena gástrica derecha); colocar una sutura alrededor de la vena porta distal de la vena esplénica (Figura 1D).
4. Voltear el bazo hacia el lado derecho para exponer la aorta y el tronco celiaco con la arteria esplénica (Figura 1E). Diseccionar y movilizar arteria aórtica-celiaca-esplénica ligando la arteria hepática y la arteria gástrica; colocar una sutura alrededor de la aorta proximal a la Arteria celíaca (Figura 1F-G).
5. Inyectar 100 unidades internacionales (UI) de heparina en la vena cava inferior (IVC) para heparinizar todo el cuerpo y esperar 3 min para asegurar que la heparina tenga efectos. Ligate la aorta proximal a la arteria celiaca, transecciona la vena porta, y luego perfuca todo el cuerpo usando 10 mL de solución salina heparinizada (4 ° c) (10 mL/20 s) desde la aorta abdominal distal hasta el tronco celiaco (figura 1H).
6. Recoger el injerto de bazo en bloque con el segmento aórtico-celiaco-esplénica asociado y la vena porta junto con un segmento de vena esplénica y una pequeña porción de tejido pancreático. Conservar el injerto en 5 mL de solución salina a 4 ° c antes del trasplante. Eutanasia al ratón por dislocación cervical.

3. implantación de la esplenectomía del receptor y del injerto del bazo

1. Coloque una almohadilla térmica en la plataforma quirúrgica y ajuste la temperatura a 37 ° c. Coloque un paño estéril (45,7 cm x 66 cm) en la parte superior de la almohadilla térmica para crear una plataforma quirúrgica estéril. Repita los pasos 2,1 y 2,2 para la preparación quirúrgica y la anestesia. Haga una incisión de la línea media de 3-4 cm y retracto la pared abdominal como se describe en el paso 2,1 y el paso 2,2.
2. Mueva con cuidado el intestino al lado derecho del ratón con un bastoncillo de algodón estéril para exponer el bazo del receptor. Ligate la vena esplénica y la arteria y retira el bazo.
3. Mueva con cuidado el intestino hacia el lado izquierdo del ratón y cubra los intestinos con gasa húmeda (empapado con solución salina estéril de 37 ° c). Diseccionar y ligar las ramas lumbares de la aorta infrarrenal y la IVC; abrazadera cruzada de la aorta infrarrenal y de la IVC mediante el uso de dos abrazaderas microvasculares de 4 mm.
4. Colocar una sutura de nylon 11-0 a través de la aorta infrarrenal (un espesor completo) y retraer para crear una aortotomía elíptica por un solo corte con microtijeras (la longitud debe coincidir con el diámetro de la aorta donante, figura 2A). Perforar la IVC usando una aguja de 30 G para crear una venotomía elíptica y extender la abertura a la longitud de la vena del portal del donante usando microtijeras (figura 2A).
5. Eliminar la sangre intraluminal o el coágulo sanguíneo (en la aorta y la IVC) con 500 μL de solución salina heparinizada (10 unidades/mL).
6. Coloque el injerto de bazo en el flanco derecho del abdomen del receptor del ratón; Identifique cuidadosamente el manguito aórtico del donante y la vena porta del donante. Después de asegurarse de que los recipientes no están retorcidos, cubra el injerto de bazo con gasa empapada con suero salino frío (4 ° c).
7. Conecte el manguito aórtico del donante al ápice proximal y distal de la aortatomía del receptor con dos suturas de estancia (11-0 sutura de nylon, igual que la siguiente) (figura 2B, C). Haga una anastomosis con 2-3 picaduras de suturas continuas de nylon 11-0 entre el manguito aórtico del donante y la aortatomía del receptor (pared anterior) (Figura 2D). Gire el injerto de bazo hacia el lado izquierdo del receptor; hacer la anastomosis entre el manguito aórtico del donante y la aortotomía del receptor (pared posterior) (Figura 2E).
8. Realizar una anastomosis para conectar la vena porta del donante a la pared posterior de la IVC del receptor, utilizando de 4 a 5 picaduras de suturas continuas en el interior de la IVC y luego cerrar la sutura en el exterior de la IVC (figura 2F, G).
9. Suelte las abrazaderas del recipiente y use un hisopo de algodón estéril para tapar el sangrado hasta que se recupere el color del bazo (figura 2H).
10. Cerrar el abdomen con una sutura de vicryl sintética absorable 5-0 en un patrón continuo. Cierre la capa de piel con una sutura de nylon 5-0 en un patrón interrumpido.
    Nota: Para los pasos 4.7-4.8, alternativamente, haga una anastomosis entre la vena porta del donante y la IVC del receptor primero (paso 4,8); luego hacer una anastomosis entre el manguito aórtico del donante y la pared posterior de la aortotomía del receptor, usando de 2 a 3 suturas continuas en el interior de la aorta y cerrar la sutura en la parte exterior de la aorta.

4. recuperación de animales

1. Inyectar 1 mL de solución salina tibia por vía subcutánea a través de 4 lugares separados (0,25 mL/ubicación) después de cerrar el abdomen.
2. Mantenga el ratón en una incubadora de temperatura controlada (30 ° c) durante las primeras horas posteriores a la operación, supervise el ratón hasta que haya recuperado la conciencia suficiente y, a continuación, transfiera el ratón a una nueva jaula limpia con alimentos y agua regulares, con una almohadilla térmica (30 ° c ) debajo de la jaula. Mantenga el ratón después de la cirugía en una jaula separada.

5. manejo del dolor post-quirúrgico

1. Inyectar 0,05 mg/kg de buprenorfina subcutáneamente 24 h y 48 h después de la cirugía para mantener el régimen de analgesia.

Resultados

Todo el procedimiento de trasplante de bazo de ratón se puede completar dentro de 90 min por microcirujanos experimentados. Nuestro laboratorio ha realizado más de 100 trasplantes de bazo en ratones. La tasa de éxito es más de 90%, como se define por la supervivencia del ratón receptor y el injerto de bazo para el día postoperatorio (POD) 1 o POD 7 (nuestro punto final del estudio). La supervivencia del injerto del bazo fue confirmada por la apariencia macroscópica y el análisis d...

Discusión

Una evidencia convincente sugiere que los monocitos derivados del bazo desempeñan un papel importante en los procesos inflamatorios estériles como la aterosclerosis¹⁹, el cerebro isquémico agudo²⁰ o la lesión pulmonar¹⁸, así como la lesión I/R miocárdica y Remodelación^21,22,23. Estos informes destacan el papel de subreconocimiento del bazo en muchas ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine	Wyeth	206205-01
Xylazine	Lloyd Laboratories	139-236
Heparin solution	Abraxis Pharmaceutical Products	504031
Injection grade normal saline	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-20
70% Ethanol	Pharmco Products Inc.	111000140
ThermoCare Small Animal ICU System	Thermocare, Inc.
Adson Forceps	Roboz Surgical Instruments	RS-5230
Derf Needle Holder	Roboz Surgical Instruments	RS-7822
Extra Fine Micro Dissecting Scissors	Roboz Surgical Instruments	RS-5881
Micro-clip	Roboz Surgical Instruments	RS-5420
7-0 silk	Braintree Scientific	SUT-S 103
11-0 nylon on 4 mm (3/8) needle	Sharpoint DR4	AK-2119
Ms CD45.2 antibody	BD Bioscience	553772
Ms CD45.1 antibody	BD Bioscience	553776
Ms CD11b antibody	BD Bioscience	557657
Ms B220 antibody	BD Bioscience	553089
Ms Ly6C antibody	eBioscience	48-5932-80
Ms Ly6G antibody	BD Bioscience	561236
Ms F4/80 antibody	BD Bioscience	565614
Ms CD11c antibody	BD Bioscience	558079
Ms CD3 antibody	eBioscience	48-0032-82
Ms CD4 antibody	BD Bioscience	552051
Ms CD8 antibody	BD Bioscience	563786
LIVE/DEAD™ Fixable Violet Dead Cell Stain Kit	Thermo Fisher	L34955