Un modèle de souris de transplantation de rate Hétérootopique vascularisée pour étudier la biologie cellulaire de la rate et l’immunité aux greffes

Résumé

Ce protocole détaille les étapes chirurgicales d’un modèle de souris de transplantation hétérotopique vascularisée de la rate, un modèle techniquement stimulant qui peut servir d’outil puissant dans l’étude du sort et de la longévité des cellules de la rate, les mécanismes de la rate distincte populations cellulaires dans la progression de la maladie et l’immunité aux greffes.

Résumé

La rate est un organe lymphoïde unique qui joue un rôle crucial dans l’homéostasie des systèmes immunitaires et hématopoïétiques. Les patients qui ont subi une splénectomie, quelles que soient les causes précipitantes, sont enclins à développer une infection post-splénectomie écrasante et éprouvent des risques accrus de thrombose veineuse profonde et de tumeurs malignes. Récemment, des études épidémiologiques ont indiqué que la splénectomie pourrait être associée à l’apparition de maladies cardiovasculaires, suggérant que les fonctions physiologiques de la rate n’ont pas encore été pleinement reconnues. Ici, nous introduisons un modèle de souris de transplantation de rate hétérootopique vascularisée, qui non seulement peut être utilisé pour étudier la fonction et l’activité comportementale des sous-ensembles de cellules immunitaires spléniques dans différents processus biologiques, mais peut également être un outil puissant pour tester le potentiel thérapeutique de la transplantation de la rate dans certaines maladies. Les principales étapes chirurgicales de ce modèle comprennent la récolte de la rate des donneurs, l’élimination de la rate indigène du receveur et la revascularisation de la greffe de la rate. En utilisant des souches de souris congéniques (p. ex., des souris ayant des antécédents de CD 45,1/CD 45,2), nous avons observé qu’après une transplantation syngénique, les lymphocytes spléniques dérivés des donneurs et les cellules myéloïdes ont migré hors de la greffe dès le jour post-opératoire 1, en concomitance avec l’afflux de plusieurs types de cellules réceptrice, générant ainsi une chimère unique.  Malgré des techniques relativement difficiles, cette procédure peut être réalisée avec > taux de réussite de 90%. Ce modèle permet de suivre le destin, la longévité et la fonction des splénocytes pendant l’état d’équilibre et dans un contexte de maladie après une transplantation de la rate, offrant ainsi une excellente occasion de découvrir le rôle distinct des cellules immunitaires dérivées de la rate dans différents processus de la maladie.

Introduction

La rate est le plus grand organe lymphoïde secondaire dans le corps et est critique dans les systèmes immunitaires et hématopoïétiques. Ses fonctions sont principalement réalisées par deux compartiments morphologiquement distincts, la pulpe rouge et la pulpe blanche¹. La pulpe rouge est un trabéculum tridimensionnel de sinus veineux et de cordons spléniques constitués de fibres réticulaires, de cellules réticulaires et de macrophages associés. Cette structure unique permet à la pulpe rouge d’agir comme un filtre sanguin efficace qui élimine les matières étrangères et les érythrocytes anciens ou endommagés. La pulpe blanche comprend les follicules, la zone marginale et les gaines lymphoïdes périartériolaires (PALS) et est un site important pour le piégeage et le traitement des antigènes, l’homing lymphocytes, la transformation, la prolifération et la maturation². Néanmoins, la rate a souvent été considérée comme un organe dispensable parce que d’autres organes lymphatiques, tels que les ganglions lymphatiques, peuvent également effectuer certaines de ses fonctions et la perte de la rate ne conduit pas habituellement à la mort. La splénectomie a donc été largement pratiquée comme méthode thérapeutique pour les patients souffrant de lésions spléniques ou de maladies hématologiques bénignes³. Cependant, les patients atteints de splénectomie sont confrontés à un certain nombre de complications à long terme. Les infections bactériennes sont les complications les mieux reconnues de la splénectomie^4,5. Récemment, l’écrasante septicémie post-splénectomie a été reconnue comme une complication intensive de la splénectomie associée à une mortalité élevée⁶. En outre, des études épidémiologiques récentes indiquent que la splénectomie peut être associée à l’apparition de maladies cardiovasculaires, suggérant que d’autres fonctions physiologiques de la rate restent à explorer^7,8.

L’autogreffe de la rate et l’allotransplantation de la rate ont été utilisés dans la clinique. Actuellement, l’autogreffe de la rate en implantant des sections de tissu splénique dans des sachets créés dans le plus grand épiploon est considérée comme la seule possibilité de préserver la fonction splénique après la splénectomie traumatique^9,10. Cependant, l’efficacité de cette chirurgie est discutable en tant que complications post-chirurgicales comme la nécrose aseptique du tissu splénique et l’obstruction de l’intestin grêle due à des adhérences postopératoires pourrait se produire¹¹. L’allotransplantation de la rate est impliquée dans la transplantation multiviscérale¹². Les données cliniques issues de la transplantation multiviscérale suggèrent que l’allotransplantation de la rate peut jouer un rôle protecteur dans le rejet de l’allogreffe de l’intestin grêle sans causer de maladie du greffon contre l’hôte (GVHD)¹². Pourtant, la littérature concernant l’effet bénéfique de l’allotransplantation de la rate en tant que composante de la transplantation multiviscérale est encore limitée et les mécanismes sous-jacents restent à définir. En 2006, Yair Reisner et coll. ont rapporté que la transplantation de tissu de la rate embryonnaire de porc qui n’a pas de lymphocytes T aux souris pourrait guérir l’hémophilie A, une maladie génétique sans causer de GVHD¹³, soutenant que la greffe de la rate détient une promesse thérapeutique dans certaines maladies. Par conséquent, il est nécessaire d’approfondir les investigations sur le potentiel thérapeutique de la transplantation de la rate.

Les modèles animaux de transplantation de la rate sont utiles pour explorer la fonction non appréciée des cellules immunitaires dérivées de la rate dans la progression de la maladie ainsi que pour tester l’effet thérapeutique potentiel de la transplantation de la rate. Des modèles expérimentaux de transplantation de la rate ont été documentés depuis le début des années 1900, tel que révisé par Cohen¹⁴. En 1969, Coburn Richard J. et Lee et coll. détaillent la technique de transplantation de la rate chez le rat^15,16. Plus récemment, Swirski FK et coll. ont décrit un modèle de souris de transplantation de la rate¹⁷. Par rapport aux modèles de rats, les modèles de souris de transplantation de la rate sont plus attrayants en raison de ses nombreux avantages inhérents. Par exemple, en utilisant un modèle de souris, nous pouvons accéder à une grande variété de réactifs non disponibles à celui des modèles de rat. En outre, en utilisant des souris congéniques (par exemple, des souris avec CD 45,1/CD 45,2), une transplantation de la rate syngénique permet de suivre le destin, la longévité et la fonction des splénocytes¹⁸. Sur la base des travaux de Swirski FK et al.¹⁷, nous avons en outre établi ce protocole simplifié et amélioré de transplantation de la rate chez la souris. Le protocole décrit ci-dessous combine à la fois la fiabilité et la faisabilité d’une manière standardisée et peut être utilisé comme un outil pour étudier la biologie de la rate et l’immunité aux greffes.

Protocole

Toutes les procédures et l’utilisation des animaux dans cette étude ont été effectuées conformément aux protocoles approuvés par le Comité interne de soins et d’utilisation des animaux de l’Université Northwestern (IACUC). Dans cette étude, des souris mâles de 8 à 10 semaines, CD 45,2 et CD 45,1 (à la fois sur fond BALB/c, du laboratoire Jackson) ont été utilisés comme donneurs de rate et receveurs, respectivement, pour créer des modèles de transplantation de la rate syngénique. Tous les animaux étaient logés dans l’environnement stérile dans les installations animales de l’Université Northwestern. Le lubrifiant oculaire a été appliqué à toutes les souris post-anesthésiant pour prévenir la sécheresse.

1. préparation chirurgicale, anesthésie et traitement de l’analgésie

1. Placer un drapé jetable stérile (45,7 cm x 66 cm) sur la plate-forme chirurgicale. Prenez doucement la souris, injectez de la kétamine (50 mg/kg) et de la xylazine (10 mg/kg) intrapéritonéale (i. p) pour l’anesthésie et injectez 0,05 mg/kg de buprénorphine par voie sous-cutanée pour l’analgésie.
2. Assurez la profondeur de l’anesthésie par pincement, rasez les cheveux dans toute la zone abdominale avec un rasoir et placez la souris sur la plate-forme chirurgicale stérile sous le microscope d’opération à grossissement de 6-10x.

2. récolte de la rate des donateurs

1. Stériliser l’abdomen avec un tampon de préparation à l’alcool, sécuriser les membres avec du ruban chirurgical, et faire une incision de la peau verticale de 3-4 cm de la ligne médiane du pubis au processus xiphoïde avec des ciseaux.
2. Rétracter la paroi abdominale avec des enrouleurs stériles fabriqués à partir de trombones. Déplacez les intestins sur le flanc droit du côté de l’abdomen (gauche du chirurgien) avec un coton-tige stérile pour exposer la rate. Cauterize la veine gastrique courte attachée à la rate avec un cautère stérile à basse température (figure 1a). Placer un morceau de gaze stérile imbibé d’une solution saline de 37 ° c sur la rate pour le maintenir humide (figure 1b).
3. Séparer et mobiliser la veine portale du tissu pancréatique (figure 1c) en ligant les branches de la veine portante (veine pancréatite supérieure et veine gastrique droite); placer une suture autour de la veine du portail distale de la veine splénique (figure 1d).
4. Retournez la rate sur le côté droit pour exposer l’aorte et le tronc coeliaque à l’artère splénique (figure 1e). Disséquer et mobiliser l’artère aortique-coeliaque-splénique en ligant l’artère hépatique et l’artère gastrique; placer une suture autour de l’aorte proximale de l’artère coeliaque (figure 1F-G).
5. Injecter 100 unités internationales (UI) d’héparine dans la veine cave inférieure (IVC) pour hépariniser le corps entier et attendre 3 min pour assurer l’héparine prendre des effets. LIGATURE l’aorte proximale à l’artère coeliaque, transect la veine porte, puis perfuser le corps entier en utilisant 10 mL de sérum physiologique hépariné (4 ° c) (10 mL/20 s) de l’aorte abdominale distale au tronc coeliaque (figure 1H).
6. Recueillir la greffe de la rate en bloc avec le segment aortique-coeliaque-splénique associé et la veine portale avec un segment de veine splénique et une petite portion de tissu pancréatique. Conserver la greffe dans 5 mL de solution saline à 4 ° c avant la transplantation. Euthanasier la souris par dislocation cervicale.

3. implantation de la splénectomie et de la greffe de la rate

1. Placez un coussin chauffant sur la plate-forme chirurgicale et réglez la température à 37 ° c. Placer un drapé stérile (45,7 cm x 66 cm) sur le dessus du coussin chauffant pour créer une plate-forme chirurgicale stérile. Répétez les étapes 2,1 et 2,2 pour la préparation chirurgicale et l’anesthésie. Faire une incision de la ligne médiane de 3-4 cm et rétracter la paroi abdominale comme décrit à l’étape 2,1 et à l’étape 2,2.
2. Déplacez délicatement l’intestin sur le côté droit de la souris avec un coton-tige stérile pour exposer la rate du receveur. Ligate la veine splénique et l’artère et enlever la rate.
3. Déplacez délicatement l’intestin sur le côté gauche de la souris et couvrez les intestins avec de la gaze mouillée (imbibé de solution saline stérile de 37 ° c). Disséquer et Liger les branches lombaires de l’aorte infrarénale et de la FIV; l’aorte infrarénale et la IVC en utilisant deux pinces microvasculaires de 4 mm.
4. Placer une suture en nylon 11-0 à travers l’aorte infrarénale (une pleine épaisseur) et se rétracter pour créer une aortotomie elliptique par une seule coupe avec des microciseaux (la longueur doit correspondre au diamètre de l’aorte du donneur, figure 2a). Percer l’IVC à l’aide d’une aiguille de 30 G pour créer une venotomie elliptique et étendre l’ouverture à la longueur de la veine du portail donneur en utilisant des microciseaux (figure 2a).
5. Effacer le sang intraluminale ou le caillot sanguin (dans l’aorte et la IVC) avec 500 μL de sérum physiologique hépariné (10 unités/mL).
6. Placer la greffe de la rate dans le flanc droit de l’abdomen de la souris receveur; identifier attentivement le brassard aortique du donneur et la veine portale du donneur. Après s’être assuré que les vaisseaux ne sont pas tordus, couvrez le greffon de la rate avec de la gaze imbibée de solution saline froide (4 ° c).
7. Relier le brassard aortique du donneur au sommet proximale et distal de l’aortaotomie du receveur avec deux sutures de suspension (suture en nylon 11-0, idem comme ci-dessous) (figure 2b, C). Faire une anastomose avec 2-3 piqûres de sutures continues de nylon 11-0 entre le brassard aortique du donneur et l’aortaotomie du receveur (paroi antérieure) (figure 2D). Tournez la greffe de la rate sur le côté gauche du receveur; faire l’anastomose entre le brassard aortique du donneur et l’aortotomie du receveur (paroi postérieure) (Figure 2e).
8. Effectuer une anastomose pour relier la veine porte du donneur à la paroi postérieure de la IVC du receveur, en utilisant 4 à 5 piqûres de sutures continues à l’intérieur de la IVC, puis fermer la suture à l’extérieur de la IVC (Figure 2F, G).
9. Relâchez les pinces du récipient et utilisez un coton-tige stérile pour tamponner les saignements jusqu’à ce que la couleur de la rate soit récupérée (figure 2H).
10. Fermez l’abdomen avec une suture de Vicryl synthétique absorbable 5-0 dans un motif continu. Fermez la couche de peau avec une suture en nylon 5-0 dans un motif interrompu.
    Remarque: Pour les étapes 4.7 à 4.8, alternativement, faire une anastomose entre la veine portante du donneur et la IVC du receveur d’abord (étape 4,8); puis faire une anastomose entre le brassard aortique du donneur et la paroi postérieure de l’aortotomie du receveur, en utilisant 2 à 3 sutures continues à l’intérieur de l’aorte et fermer la suture à l’extérieur de l’aorte.

4. récupération des animaux

1. Injecter 1 mL de solution saline tiède par voie sous-cutanée via 4 emplacements distincts (0,25 mL/emplacement) après la fermeture de l’abdomen.
2. Maintenez la souris dans un incubateur à température contrôlée (30 ° c) pendant les premières heures après l’opération, surveillez la souris jusqu’à ce qu’elle ait retrouvé une conscience suffisante, puis transférez la souris dans une nouvelle cage propre avec de la nourriture et de l’eau régulières, avec un tampon chauffant (30 ° c ) sous la cage. Gardez la souris post-chirurgie dans une cage séparée.

5. gestion de la douleur post-chirurgicale

1. Injecter 0,05 mg/kg de buprénorphine par voie sous-cutanée 24 h et 48 h après la chirurgie pour maintenir le régime d’analgésie.

Résultats

L’ensemble de la procédure de greffe de la rate de souris peut être complété dans 90 min par des microchirurgiens expérimentés. Notre laboratoire a effectué plus de 100 greffes de rate chez la souris. Le taux de réussite est de plus de 90%, tel que défini par la survie de la souris réceptrice et de la greffe de la rate au jour post-opératoire (POD) 1 ou POD 7 (notre point de terminaison d’étude). La survie de la greffe de la rate a été confirmée par l’aspect macroscop...

Discussion

Des preuves convaincantes suggèrent que les monocytes dérivés de la rate jouent un rôle important dans les processus inflammatoires stériles tels que l’athérosclérose¹⁹, le cerveau ischémique aigu²⁰ ou la lésion pulmonaire¹⁸, ainsi que les lésions I/R myocardiques et remodelage^21,22,23. Ces rapports soulignent le rôle de sous-reconnaissance de l...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine	Wyeth	206205-01
Xylazine	Lloyd Laboratories	139-236
Heparin solution	Abraxis Pharmaceutical Products	504031
Injection grade normal saline	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-20
70% Ethanol	Pharmco Products Inc.	111000140
ThermoCare Small Animal ICU System	Thermocare, Inc.
Adson Forceps	Roboz Surgical Instruments	RS-5230
Derf Needle Holder	Roboz Surgical Instruments	RS-7822
Extra Fine Micro Dissecting Scissors	Roboz Surgical Instruments	RS-5881
Micro-clip	Roboz Surgical Instruments	RS-5420
7-0 silk	Braintree Scientific	SUT-S 103
11-0 nylon on 4-mm (3/8) needle	Sharpoint DR4	AK-2119
Ms CD45.2 antibody	BD Bioscience	553772
Ms CD45.1 antibody	BD Bioscience	553776
Ms CD11b antibody	BD Bioscience	557657
Ms B220 antibody	BD Bioscience	553089
Ms Ly6C antibody	eBioscience	48-5932-80
Ms Ly6G antibody	BD Bioscience	561236
Ms F4/80 antibody	BD Bioscience	565614
Ms CD11c antibody	BD Bioscience	558079
Ms CD3 antibody	eBioscience	48-0032-82
Ms CD4 antibody	BD Bioscience	552051
Ms CD8 antibody	BD Bioscience	563786
LIVE/DEAD™ Fixable Violet Dead Cell Stain Kit	Thermo Fisher	L34955