מודל של העכבר של ואסיאני הטרוגרההשתלת הטחול ללמוד תא הטחול ביולוגיה וחסינות להשתלות

Summary

פרוטוקול זה מפרט את הצעדים הכירורגית של מודל העכבר של השתלת הטחול הטרולפית, מודל מאתגר מבחינה טכנית שיכול לשמש כלי רב עוצמה בחקר הגורל ואריכות החיים של תאי הטחול, מנגנונים של טחול ברורים אוכלוסיות תאים בהתקדמות המחלה, וחסינות להשתלה.

Abstract

הטחול הוא איבר הלימפה ייחודי המשחק תפקיד קריטי הומאוסטזיס של המערכת החיסונית המטתית. מטופלים שעברו כריתת טחול ללא קשר לגורמים מאיצים נוטים לפתח זיהום מוחץ לאחר כריתת הטחול וניסיון מוגבר של פקקת ורידים עמוקים וממאירות. לאחרונה, מחקרים אפידמיולוגיים ציין כי כריתת טחול עשוי להיות קשור להתרחשות של מחלות לב וכלי דם, הרומז כי פונקציות פיזיולוגיות של הטחול עדיין לא הכירו במלואו. כאן, אנו מציגים מודל העכבר של השתלת הטחול הטרולייום, אשר לא רק יכול להיות מנוצל כדי ללמוד את הפונקציה ואת פעילות התנהגותית של קבוצות החיסון של תאים חיסוניים הטחול בתהליכים יולוגי שונים, אבל גם יכול להיות כלי רב עוצמה כדי לבדוק הפוטנציאל הטיפולי של השתלת הטחול במחלות מסוימות. השלבים העיקריים כירורגי של מודל זה כוללים הקציר הטחול התורם, הסרת טחול יליד הנמען, ו הטחול השתל revascularization. באמצעות זני העכבר הקונגניים (למשל, עכברים עם 45.1 CD/CD 45.2 רקעים), הבחנו כי לאחר השתלת syngeneic, הן לימפוציטים הטחול הנגזר שניהם, התאים מיאלואיד היגרו מתוך השתל מוקדם כמו יום שלאחר הניתוח 1, במקביל עם זרם של סוגים מרובים של תאים הנמען, ובכך לייצר כמירה ייחודית.  למרות טכניקות מאתגרות יחסית, הליך זה ניתן לבצע עם > 90% שיעור הצלחה. מודל זה מאפשר מעקב אחר גורל, אריכות ימים, ותפקוד של הטחול במהלך המצב היציב בקביעת המחלה בעקבות השתלת הטחול, ובכך מציע הזדמנות גדולה לגלות את התפקיד הייחודי עבור תאים חיסוניים הנגזרים הטחול ב תהליכי מחלה שונים.

Introduction

הטחול הוא איבר הלימפה המשני הגדול ביותר בגוף, והוא קריטי במערכות החיסונית המטפאות. הפונקציות שלה מתבצעות בעיקר על ידי שני תאים ברורים מורפולוגית, את הציפה האדומה ואת עיסת לבן¹. הציפה האדומה היא עבודה תלת ממדית של הסינוסים ורידים ומיתרי הטחול המורכבים מסיבים רשתית, תאי רשתית ומקרופאגים משויכים. זה מבנה ייחודי מאפשר עיסת אדום לפעול כמסנן דם אפקטיבי המסירה חומרים זרים או הישן או ניזוק אריתרופוציטים. הזולה הלבנה כוללת זקיקי, אזור שולי, ומעילי הלימפה periarteriolar (ידידי) והוא אתר חשוב להשמנה ועיבוד אנטיגן, ביות לימפוציטים, טרנספורמציה, התפשטות והתבגרות². עם זאת, הטחול בדרך כלל נחשב כאיבר מותר כי איברים לימפתיים אחרים, כגון בלוטות הלימפה, יכול גם לבצע כמה פונקציות שלה ואת אובדן הטחול לא בדרך כלל להוביל למוות. כריתת טחול התבצע אפוא באופן נרחב כשיטה טיפולית עבור חולים עם פציעה הטחול או מחלות המטקולוגיות שפיר³. עם זאת, חולים עם כריתת טחול הפנים מספר סיבוכים ארוכי טווח. זיהומים חיידקיים הם הסיבוכים המוכרים ביותר של כריתת טחול^4,5. לאחרונה הכירו את אלח-הדם המכריע שלאחר הטחול, כסיבוך אינטנסיבי של כריתת טחול הקשורה לתמותה גבוהה⁶. יתר על כן, מחקרים אפידמיולוגיים האחרונות מצביעים על כך שניתוח הטחול עשוי להיות קשור להתרחשות של מחלות לב וכלי דם, הרומז כי פונקציות פיזיולוגיות נוספות של הטחול נותרו לחקור^7,8.

שניהם השתלת הטחול autotransplantation שתלת טחול השתמשו במרפאה. כיום, הטחול השתלת אוטומטית על ידי שתילת חלקים של רקמת הטחול לתוך שקיות שנוצרו במנטום הגדול נחשב האפשרות היחידה לשימור תפקוד הטחול לאחר כריתת טחול טראומטי^9,10. עם זאת, את היעילות של ניתוח זה הוא במחלוקת כמו לאחר הניתוח סיבוכים כמו נמק אספטי של רקמת הטחול ואת חסימת המעי הקטן עקב הידקויות לאחר הניתוח יכול להתרחש¹¹. השתלת הטחול מעורבת. בהשתלה מרובת הקרביים¹² ראיות קליניות מפני השתלת מרובת הקרביים מציע כי השתלת הטחול עשוי לשחק תפקיד המגן דחייה קטנה אלוגרפט המעי ללא גרימת השתל-מול-מארחים מחלה (gvhd)¹². עם זאת, ספרות לגבי ההשפעה המועילה של השתלת הטחול כרכיב של השתלת רב הקרביים עדיין מוגבל והמנגנונים הבסיסיים נשארים להיות מוגדרים. בשנת 2006, יאיר רייזנר ואח ' דיווחו כי שתילת רקמת הטחול מתחלקים חזיר כי אין תאי T לעכברים יכול לרפא המופיליה A, מחלה גנטית מבלי לגרום GVHD¹³, תמיכה השתלת הטחול מחזיקה הבטחה טיפולית מחלות מסוימות. לכן, יש צורך בחקירות נוספות על הפוטנציאל הטיפולי של השתלת הטחול.

מודלים של בעלי חיים של השתלת הטחול הם יקרי ערך כדי לחקור את תפקוד לא מוערך של תאים החיסון נגזר הטחול בהתקדמות המחלה, כמו גם כדי לבדוק את ההשפעה הטיפולית הפוטנציאלית של השתלת הטחול. השתלת הטחול המלא הדגמים תועדו מאז תחילת 1900, כפי שנבדקו על ידי כהן¹⁴. בשנת 1969, קובורן ריצ'רד ג'יי ולי ואח ' מפורטים הטכניקה של השתלת הטחול בחולדות^15,16. לאחרונה, מסוויסקי FK אל. תיאר מודל העכבר של השתלת טחול¹⁷. לעומת מודלים חולדה, העכבר מודלים של השתלת הטחול הם אטרקטיביים יותר בשל היתרונות הטבועים שלה מספר. לדוגמה, על ידי ניצול מודל העכבר, אנחנו יכולים לגשת למגוון רחב של ריאגנטים לא זמין זה של מודלים חולדה. יתר על כן, באמצעות עכברים הקונגניים (למשל, עכברים עם CD 45.1/CD 45.2 רקע), השתלת הטחול syngeneic מאפשר לעקוב אחר הגורל, אריכות-החיים, ותפקוד של הטחול¹⁸. בהתבסס על העבודה על ידי מערבולות FK et al.¹⁷, הקמנו את הפרוטוקול הזה פשוט ומשופר של השתלת הטחול בעכברים. הפרוטוקול המתואר להלן משלב אמינות והיתכנות באופן מתוקננת ויכול להיות מנוצל ככלי למחקר ביולוגיה הטחול וחסינות השתלת.

Protocol

כל ההליכים ואת השימוש בעלי חיים במחקר זה נערכו על פי פרוטוקולים שאושרו על ידי האוניברסיטה הצפון מערבי טיפול בעלי חיים והוועדה השתמש (IACUC). במחקר זה, 8 כדי 10 שבוע בן זכר 45.2 CD ו-CD 45.1 עכברים (שניהם על רקע BALB/c, מ מעבדה ג'קסון) שימשו תורמים הטחול והנמענים, בהתאמה, כדי ליצור מודלים השתלת הטחול syngeneic. כל החיות שוכנו בסביבה סטרילית במתקני החי של אוניברסיטת נורת'ווסטרן. חומר הסיכה של העין הוחל על כל העכברים שלאחר ההרדמה כדי למנוע יובש.

1. הכנה כירורגית, הפחתות ומשטר כאבים

1. מניחים העטוף סטרילי חד פעמי (45.7 ס מ x 66 ס מ) על פלטפורמת כירורגית. בעדינות לתפוס את העכבר, להזריק קטמין (50 מ"ג/ק"ג) ו xylazine (10 מ"ג/ק"ג) intraperitoneally (i. p) עבור הרדמה, ולהזריק 0.05 mg/ק"ג בופרנורפין תת-עורי עבור כאבים.
2. להבטיח את עומק ההרדמה על ידי הבוהן, לגלח את השיער באזור כל הבטן עם תער ולמקם את העכבר על פלטפורמת כירורגי סטרילי תחת מיקרוסקופ ההפעלה בהגדלה 6-10x.

2. קציר הטחול התורם

1. לחטא את הבטן עם כרית הכנה לאלכוהול, לאבטח את הגפיים עם הקלטת כירורגית, ולעשות 3-4 ס מ העור באמצע חתך ביניים אנכי מהערווה לתהליך xiphoid עם מספריים.
2. למשוך את קיר הבטן עם רטרקטורים סטרילי עשוי מחסניות. הזז את המעיים לאגף הימני של הבטן (שמאל של המנתח) בצד עם מנקי כותנה סטרילית כדי לחשוף את הטחול. לצרוב את הווריד הקיבה קצר מוצמד הטחול עם החום סטרילי נמוכה הטמפרטורה (איור 1A). מניחים פיסת גזה סטרילית ספוגה 37 ° c מלוחים מעל הטחול כדי לשמור אותו לח (איור 1B).
3. להפריד ולהניע את הווריד של הפורטל מרקמת הלבלב (איור 1C) על ידי ליגדירוג הענפים וריד הפורטל (pancreaticoduodenal וריד מעולה וריד הקיבה); מניחים תפר סביב וריד השער מתוך הווריד הטחול (איור 1D).
4. הפוך את הטחול לצד ימין כדי לחשוף את עורק העורקים והגזע הצ עם עורק הטחול (איור 1E). ניתוח והניוד של עורק אבי העורקים-בחלל-הטחול על-ידי ליגולי עורק הכבד ועורק הקיבה; מסביב לעורק הראשי (איור 1F-G).
5. הכנס 100 יחידות בינלאומיות (IU) הפארין לתוך הבנה הריק הנחותים (IVC) כדי heparinize את הגוף כולו ולחכות 3 דקות כדי להבטיח את הפארין לקחת אפקטים. לישער את אבי העורקים הנמצא מתחת לעורק הבטן, מעבר לווריד השער, ולאחר מכן מבשם את הגוף כולו באמצעות 10 מ ל של heparinized קר (4 ° c) תמיסת מלח (10 מ ל/20 s) מהאבי העורקים הבטני הגזע צליאק רייניאק (איור 1h).
6. לאסוף את השתל הטחול en בלוקים עם הקשורים האבי העורקים בקטע הטחול ואת הווריד הפורטל יחד עם קטע של וריד הטחול וחלק קטן של רקמת הלבלב. שמור על השתל ב 5 מ ל של 4 ° c מלוחים לפני ההשתלה. המתת החסד של העכבר על ידי פריקה צוואר הרחם.

3. כריתת טחול המטופל השתל השרשה

1. מניחים משטח חימום על הרציף הכירורגי ומתאימים את הטמפרטורה ל-37 ° c. מניחים את העטוף סטרילי (45.7 ס"מ x 66 ס מ) על גבי משטח החימום כדי ליצור פלטפורמה כירורגית סטרילית. חזור על שלבים 2.1 ו-2.2 להכנה כירורגית ולהרדמה. לעשות חתך 3-4 ס מ באמצע החיתוך ולמשוך את קיר הבטן כמתואר בשלב 2.1 צעד 2.2.
2. בזהירות להעביר את המעי בצד ימין של העכבר עם מנקי כותנה סטרילית כדי לחשוף את הטחול של המטופל. . ולהסיר את הטחול
3. בזהירות להעביר את המעי בצד שמאל של העכבר ולכסות את המעיים עם גזה רטוב (ספוגה עם סטרילי 37 מלוחים צלזיוס). מנתחים ומשערים את ענפי המותניים של העורקים המותני ואת האגודה העברית; באמצעות שני מלחציים מיקרוכלי-דם של 4 מ"מ.
4. מניחים 11-0 ניילון תפר דרך העורקים למטה (עובי מלא) ולבטל כדי ליצור aortotomy אליפטי על ידי חתך אחד עם מיקרו מספריים (האורך צריך להתאים את קוטר העורקים של התורם, איור 2A). לנקב את ה-IVC באמצעות מחט של 30 גרם כדי ליצור בנייה אליפטית ולהאריך את הפתיחה לתוך וריד הפורטל תורם אורך בהתאמה באמצעות מיקרו מספריים (איור 2A).
5. נקה את דם intraluminal או קריש דם (ב העורקים ו-IVC) עם 500 μL של מלוחים heparinized (10 יחידות/mL).
6. מניחים את שתל הטחול באגף הימני של הבטן העכבר המטופל; זהות בזהירות את השרוול של אבי העורקים של התורם ואת וריד השער של התורם. לאחר שהבטיח כי כלי הדם אינם מעוותים, לכסות את שתל הטחול עם גזה ספוגה קר (4 ° c) תמיסת מלח.
7. חבר את השרוול של אבי העורקים של התורם האבותיים והמרוחק של aortaotomy של המטופל עם שני תפרים להישאר (11-0 ניילון תפר, כמו להלן) (איור 2B, ג). הפוך השקה עם 2-3 עקיצות של התפרים ברציפות של 11-0 ניילון בין השרוול של אבי העורקים של התורם לבין aortaotomy של המטופל (הקיר הקדמי) (איור 2D). הפוך את שתל הטחול לצד השמאלי של הנמען; להפוך את החיבור בין השרוול אבי העורקים של התורם לבין הaortotomy של המטופל (הקיר האחורי) (איור 2E).
8. בצעו השקה כדי לחבר את וריד הפורטל של התורם לקיר האחורי של המטופל, באמצעות 4 עד 5 עקיצות של תפרים מתמשכים בחלק הפנימי של ה-IVC ולאחר מכן סגרו את התפר בצד החיצוני של ה-IVC (איור 2F, G).
9. שחררו את התפסים והשתמשו בספוגית כותנה סטרילית עד לדימום בטמפונאדה עד לשחזור צבע הטחול (איור 2H).
10. סגרו את הבטן בעזרת מ5-0. סגור את שכבת העור עם תפר ניילון 5-0 בדפוס קטוע.
    הערה: עבור השלבים 4.7-4.8, לחילופין, לבצע השקה בין וריד הפורטל של התורם לבין IVC של המטופל תחילה (שלב 4.8); לאחר מכן השתמש בחיבור בין השרוול אבי העורקים של התורם לבין הקיר האחורי של הaortotomy, תוך שימוש ב -2 עד 3 תפרים רציפים בתוך החלק הפנימי של אבי העורקים ולסגור את התפר בחלק החיצוני של אבי העורקים.

4. שחזור בעלי חיים

1. הכנס 1 מ ל של תת-עורי מלוחים חמים דרך 4 מיקומים נפרדים (0.25 mL/מיקום) לאחר סגירת הבטן.
2. שמור את העכבר בחממה מבוקרת טמפרטורה (30 ° c) עבור השעות הראשונות שלאחר הפעולה, לפקח על העכבר עד שהוא חזר להכרה מספקת, ולאחר מכן להעביר את העכבר לכלוב נקי חדש עם מזון רגיל ומים, עם משטח חימום (30 ° c ) מתחת לכלוב. לשמור על העכבר לאחר הניתוח בכלוב נפרד.

5. ניתוח לאחר כירורגי הכאב

1. הכנס 0.05 mg/ק"ג בופרנורפין תת-עורי 24 h ו 48 h לאחר ניתוח כדי לשמור על משטר כאבים.

תוצאות

ההליך כולו של השתלת הטחול העכבר ניתן להשלים בתוך 90 דקות על ידי מיקרו מנתחים מנוסים. המעבדה שלנו הופיעה על 100 השתלות הטחול בעכברים. שיעור ההצלחה הוא מעל 90%, כפי שהוגדר על ידי ההישרדות של שני העכבר הנמען ואת שתל הטחול ליום לאחר הניתוח (POD) 1 או POD 7 (נקודת הקצה של המחקר שלנו). ההיש?...

Discussion

ראיות משכנעות עולה כי הטחול נגזר מונוציטים לשחק תפקיד חשוב בתהליכים דלקתיים סטרילי כגון טרשת עורקים¹⁹, המוח האיסכמי חריפה²⁰ או פציעה בריאה¹⁸, כמו גם שריר הלב I/R פציעה . שיפוץ^21,22,23 דוחות אלה להדגיש את תפק...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine	Wyeth	206205-01
Xylazine	Lloyd Laboratories	139-236
Heparin solution	Abraxis Pharmaceutical Products	504031
Injection grade normal saline	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-20
70% Ethanol	Pharmco Products Inc.	111000140
ThermoCare Small Animal ICU System	Thermocare, Inc.
Adson Forceps	Roboz Surgical Instruments	RS-5230
Derf Needle Holder	Roboz Surgical Instruments	RS-7822
Extra Fine Micro Dissecting Scissors	Roboz Surgical Instruments	RS-5881
Micro-clip	Roboz Surgical Instruments	RS-5420
7-0 silk	Braintree Scientific	SUT-S 103
11-0 nylon on 4-mm (3/8) needle	Sharpoint DR4	AK-2119
Ms CD45.2 antibody	BD Bioscience	553772
Ms CD45.1 antibody	BD Bioscience	553776
Ms CD11b antibody	BD Bioscience	557657
Ms B220 antibody	BD Bioscience	553089
Ms Ly6C antibody	eBioscience	48-5932-80
Ms Ly6G antibody	BD Bioscience	561236
Ms F4/80 antibody	BD Bioscience	565614
Ms CD11c antibody	BD Bioscience	558079
Ms CD3 antibody	eBioscience	48-0032-82
Ms CD4 antibody	BD Bioscience	552051
Ms CD8 antibody	BD Bioscience	563786
LIVE/DEAD™ Fixable Violet Dead Cell Stain Kit	Thermo Fisher	L34955