Um modelo de camundongo de transplante de baço heterotópico vascularizado para estudar a biologia celular do baço e a imunidade a transplantes

Resumo

Este protocolo detalha as etapas cirúrgicas de um modelo do rato da transplantação Heterotopic vascularized do spleen, um modelo tecnicamente desafiante que possa serir como uma ferramenta poderosa em estudar o Fate e a longevidade de pilhas do spleen, os mecanismos do spleen distinto populações de células na progressão da doença e imunidade ao transplante.

Resumo

O baço é um órgão linfoide único que desempenha um papel crítico na homeostase dos sistemas imunológico e hematopoiético. Os pacientes que foram submetidos a esplenectomia independentemente das causas precipitantes são propensos a desenvolver uma infecção pós-esplenectomia esmagadora e experimentam riscos aumentados de trombose venosa profunda e malignidades. Recentemente, estudos epidemiológicos indicaram que a esplenectomia pode estar associada à ocorrência de doenças cardiovasculares, sugerindo que as funções fisiológicas do baço ainda não foram totalmente reconhecidas. Aqui, nós introduzimos um modelo do rato do transplante Heterotopic vascularized do spleen, que pode não somente ser utilizado para estudar a função e a atividade comportável de subconjuntos imunes splenic da pilha em processos biológicos diferentes, mas igualmente pode ser uma ferramenta poderosa para testar o potencial terapêutico do transplante de baço em certas doenças. As etapas cirúrgicas principais deste modelo incluem a colheita fornecedora do spleen, a remoção do spleen nativo receptor, e o Revascularization do enxerto do spleen. Usando estirpes congênicas de camundongo (por exemplo, camundongos com CD de 1/1/CD 45,2 fundos), observamos que após o transplante sintémico, tanto os linfócitos esplênicos derivados do doador quanto as células mielóides migraram para fora do enxerto logo após o dia pós-operatório 1, concomitante com o influxo de vários tipos de células receptoras, gerando assim uma quimera única.  Apesar de técnicas relativamente desafiadoras, este procedimento pode ser realizado com > 90% de taxa de sucesso. Este modelo permite rastrear o destino, a longevidade e a função dos esplendócitos durante o estado estacionário e em um ambiente de doença após um transplante de baço, oferecendo assim uma grande oportunidade para descobrir o papel distinto para as células imunes do baço em diferentes processos de doença.

Introdução

O baço é o maior órgão linfóide secundário do corpo e é crítico nos sistemas imunológico e hematopoiético. Suas funções são realizadas principalmente por dois compartimentos morfologicamente distintos, a polpa vermelha e a polpa branca¹. A polpa vermelha é uma malha tridimensional de seios venosos e de cordas esplênica que consistem em fibras reticulares, células reticulares e macrófagos associados. Esta estrutura original permite que a polpa vermelha aja como um filtro de sangue eficaz que remova materiais extrangeiros e eritrócitos velhos ou danificados. A polpa branca inclui folículos, zona marginal e bainhas linfoides periarteriolares (PALS) e é um local importante para a captura e processamento de antígenos, homing de linfócitos, transformação, proliferação e maturação². No entanto, o baço tem sido comumente considerado como um órgão dispensável porque outros órgãos linfáticos, como linfonodos, também podem realizar algumas de suas funções e a perda do baço geralmente não leva à morte. A esplenectomia, portanto, tem sido amplamente realizada como um método terapêutico para pacientes com lesão esplênica ou doenças hematológicas benignas³. Entretanto, os pacientes com esplenectomia enfrentam um número de complicações a longo prazo. As infecções bacterianas são as complicações mais reconhecidas da esplenectomia^4,5. Recentemente, o sepsis borne-esplenectomia oprimindo foi reconhecido como uma complicação intensiva do esplenectomia associado com uma mortalidade elevada⁶. Além disso, estudos epidemiológicos recentes indicam que a esplenectomia pode estar associada à ocorrência de doenças cardiovasculares, sugerindo que outras funções fisiológicas do baço continuem a ser exploradas^7,8.

Tanto o autotransplante do baço quanto o alotransplante do baço têm sido utilizados na clínica. Atualmente, o autotransplante de baço por implante de seções de tecido esplênico em bolsas criadas no omento maior é considerado como a única possibilidade de preservação da função esplênica após a esplenectomia traumática^9,10. Entretanto, a eficácia desta cirurgia é discutível porque as complicações da borne-cirurgia como a necrose asséptica do tecido splenic e a obstrução pequena das entranhas devido às adesões postoperative poderiam ocorrer¹¹. O alotransplante de baço está envolvido na transplantação multivisceral¹². A evidência clínica da transplantação multivisceral sugere que o allotransplante do spleen possa jogar um papel protetor na rejeição pequena do aloenxerto das entranhas sem causar a doença do transplantar-contra-anfitrião (GVHD)¹². No entanto, a literatura sobre o efeito benéfico do alotransplante de baço como componente do transplante multivisceral ainda é limitada e os mecanismos subjacentes permanecem a ser definidos. Em 2006, Yair Reisner et al. relataram que o transplante de tecido esplênico embrionário de suínos que não tem células T para camundongos poderia curar Hemofilia A, uma doença genética sem causar a GVHD¹³, apoiando que a transplantação do baço detém a promessa terapêutica em certas doenças. Conseqüentemente, há uma necessidade para umas investigações mais adicionais no potencial terapêutico da transplantação do spleen.

Os modelos animais da transplantação do spleen são valiosos explorar a função não apreciada das pilhas imunes Spleen-derivadas na progressão da doença assim como para testar o efeito terapêutico potencial da transplantação do spleen. Modelos experimentais de transplante de baço inteiros foram documentados desde o início de 1900, como revisado por Cohen¹⁴. Em 1969, Coburn Richard J. e Lee et al. detalhou a técnica de transplante de baço em ratos^15,16. Mais recentemente, Swirski FK et al. descreveram um modelo de camundongo de transplante de baço¹⁷. Comparado aos modelos do rato, os modelos do rato do transplante do spleen são mais atrativos devido a suas diversas vantagens inerentes. Por exemplo, utilizando um modelo de mouse, podemos acessar uma ampla variedade de reagentes não disponíveis para os modelos de ratos. Além disso, usando camundongos congênicos (por exemplo, camundongos com fundo CD/CD/45,2), um transplante de baço singeneico possibilita rastrear o destino, a longevidade e a função dos esócito¹⁸. Com base no trabalho de Swirski FK et al.¹⁷, estabelecemos ainda este protocolo simplificado e aprimorado de transplante de baço em camundongos. O protocolo descrito abaixo combina a confiabilidade e a viabilidade de forma padronizada e pode ser utilizado como uma ferramenta para estudar a biologia do baço e a imunidade ao transplante.

Protocolo

Todos os procedimentos e uso de animais neste estudo foram realizados de acordo com protocolos aprovados pelo Comitê interno de cuidado e uso de animais da Universidade do noroeste (IACUC). Neste estudo, 8 a 10 semanas de idade do sexo masculino CD 45,2 e CD (ambos no fundo BALB/c, do laboratório de Jackson) foram utilizados como doadores de baço e receptores, respectivamente, para criar modelos de transplante de baço singeneico. Todos os animais foram alojados no ambiente estéril nas instalações de animais da Northwestern University. O lubrificante ocular foi aplicado a todos os camundongos pós-anestesiarização para evitar a secura.

1. preparo cirúrgico, anestesia e regime de analgesia

1. Coloc um drapeje descartável estéril (45,7 cm x 66 cm) na plataforma cirúrgica. Agarre suavemente o rato, injete cetamina (50 mg/kg) e xilazina (10 mg/kg) intraperitonealmente (i. p) para anestesia, e injete 0, 5 mg/kg de buprenorfina por via subcutânea para analgesia.
2. Assegure a profundidade da anestesia pelo dedo do pé-pinch, raspe o cabelo na área inteira do abdômen com uma lâmina e coloc o rato na plataforma cirúrgica estéril o microscópio de funcionamento na ampliação 6-10x.

2. colheita do baço doador

1. Esterilize o abdômen com uma almofada da preparação do álcool, prenda os membros com fita cirúrgica, e faça uma incisão vertical da pele do midline de 3-4 cm do púbis ao processo do xifóide com tesouras.
2. Retrair a parede abdominal com os afastadores estéreis feitos dos paperclips. Mova os intestinos para o flanco direito do lado do abdômen (esquerda do cirurgião) com um cotonete de algodão estéril para expor o baço. Cauterize a veia gástrica curta presa ao baço com um cauterização estéril de baixa temperatura (Figura 1a). Coloque um pedaço de gaze estéril embebido com 37 ° c salina sobre o baço para mantê-lo úmido (Figura 1b).
3. Separar e mobilizar a veia porta do tecido pancreático (Figura 1C) por meio da ligante das ramificações da veia porta (veia pancreaticoduodenal superior e veia gástrica direita); coloc uma sutura em torno da veia portal longe do ponto de origem da veia splenic (Figura 1D).
4. Vire o baço para o lado direito para expor a aorta e o tronco celíaco com a artéria esplênica (Figura 1e). Dissecar e mobilizar a artéria aórtica-celíaca-splenic ligando a artéria hepatic e a artéria gastric; coloc uma sutura em torno da aorta proximal à artéria celíaca (Figura 1F-G).
5. Injete 100 unidades internacionais (UI) de heparina na veia cava inferior (IVC) para heparinizar todo o corpo e aguarde 3 min para garantir que a heparina tome efeitos. Ligate a aorta proximal à artéria celíaca, transecto a veia portal, e perfuse então o corpo inteiro usando 10 ml do frio heparinizado (4 ° c) salino (10 ml/20 s) da aorta abdominal longe do ponto de origem ao tronco celíaco (Figura 1h).
6. Colete o enxerto de baço em bloco com o segmento aórtico-celíaco-esplênico associado e a veia porta, juntamente com um segmento de veia esplênica e uma pequena porção de tecido pancreático. Preservar o enxerto em 5 mL de soro fisiológico a 4 ° c antes do transplante. Eutanizar o rato por luxação cervical.

3. implante de SPLENECTOMY e do enxerto do spleen do receptor

1. Coloque uma almofada de aquecimento na plataforma cirúrgica e ajuste a temperatura para 37 ° c. Coloc um Drape estéril (45,7 cm x 66 cm) sobre a almofada de aquecimento para criar uma plataforma cirúrgica estéril. Repita as etapas 2,1 e 2,2 para a preparação cirúrgica e a anestesiarização. Fazer uma incisão de 3-4 cm Midline e retrair a parede abdominal como descrito na etapa 2,1 e etapa 2,2.
2. Mova cuidadosamente o intestino para o lado direito do rato com um cotonete de algodão estéril para expor o baço do receptor. Ligate a veia esplênica e artéria e retire o baço.
3. Mova cuidadosamente o intestino para o lado esquerdo do rato e cubra os intestinos com gaze molhada (embebido em soro fisiológico estéril a 37 ° c). Dissecar e ligadura os ramos lombares da aorta infrarrenal e IVC; Cruz-braçadeira a aorta do infrarrenal e o IVC usando duas braçadeiras microvascular de 4 milímetros.
4. Colocar uma sutura de nylon 11-0 através da aorta infrarrenal (uma espessura total) e retrair para criar uma aortotomia elíptica por um único corte com Microtesoura (o comprimento deve corresponder ao diâmetro da aorta fornecedora, Figura 2a). Perfure o IVC usando uma agulha de 30 G para criar uma venotomia elíptica e estenda a abertura ao comprimento combinado veia portal doador usando Microtesoura (Figura 2a).
5. Limpe o sangue intraluminal ou coágulo sanguíneo (na aorta e IVC) com 500 μL de soro fisiológico heparinizado (10 unidades/mL).
6. Coloc a corrupção do spleen no flanco direito do abdômen do rato do receptor; identificar cuidadosamente o manguito aórtico do doador e a veia porta do doador. Depois de certificar-se de que os vasos não são torcidos, cubra o enxerto de baço com gaze embebido com soro fisiológico (4 ° c) frio.
7. Conecte o manguito aórtico do doador ao ápice proximal e distal da aortaotomia do receptor com duas suturas de permanência (11-0 sutura de náilon, igual a abaixo) (Figura 2b, C). Faça uma anastomose com 2-3 picadas de sutura contínua de nylon 11-0 entre o manguito aórtico do doador e a aortaotomia do receptor (parede anterior) (Figura 2D). Gire o enxerto do baço para o lado esquerdo do receptor; fazer a anastomose entre o manguito aórtico do doador e a aortotomia do receptor (parede posterior) (Figura 2e).
8. Realize uma anastomose para conectar a veia porta do doador à parede posterior da VCI do receptor, usando 4 a 5 picadas de suturas contínuas no interior da VCI e, em seguida, feche a sutura do lado de fora do IVC (Figura 2F, G).
9. Solte as braçadeiras do vaso e use cotonete estéril para tamponamento de sangramento até que a cor do baço seja recuperada (Figura 2h).
10. Feche o abdômen com uma sutura 5-0 sintética absorvível Vicryl em um padrão contínuo. Feche a camada da pele com uma sutura de nylon 5-0 em um padrão interrompido.
    Nota: Para as etapas 4.7-4.8, alternativamente, faça uma anastomose entre a veia portal do doador e o IVC do receptor primeiramente (etapa 4,8); em seguida, faça uma anastomose entre o manguito aórtico do doador e a parede posterior da aortotomia do receptor, usando 2 a 3 suturas contínuas no interior da aorta e feche a sutura do lado de fora da aorta.

4. recuperação animal

1. Injete 1 mL de soro fisiológico quente por via subcutânea através de 4 locais separados (0,25 mL/local) após fechar o abdômen.
2. Mantenha o mouse em uma incubadora com temperatura controlada (30 ° c) durante as primeiras horas após a operação, monitore o mouse até recuperar a consciência suficiente e, em seguida, transfira o mouse para uma nova gaiola limpa com comida e água regulares, com uma almofada de aquecimento (30 ° c ) embaixo da gaiola. Mantenha o mouse após a cirurgia em uma gaiola separada.

5. gestão da dor pós-cirúrgica

1. Injete 0, 5 mg/kg de buprenorfina subcutaneamente 24 h e 48 h após a cirurgia para manter o regime de analgesia.

Resultados

O procedimento inteiro da transplantação do spleen do rato pode ser terminado dentro de 90 minutos por microcirurgiões experientes. Nosso laboratório realizou mais de 100 transplantes de baço em camundongos. A taxa de sucesso é de mais de 90%, conforme definido pela sobrevida do rato receptor e do enxerto do baço para o dia pós-operatório (POD) 1 ou POD 7 (nosso ponto final do estudo). A sobrevivência da corrupção do spleen foi confirmada pela análise macroscópica da aparên...

Discussão

Evidências convincentes sugerem que os monócitos derivados do baço desempenham um papel importante em processos inflamatórios estéreis, como aterosclerose¹⁹, cérebro isquêmico agudo²⁰ ou lesão pulmonar¹⁸, bem como lesão miocárdica I/R e remodelação^21,22,23. Esses relatos destacam o papel de subreconhecimento do baço em muitas doenças crônicas,...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine	Wyeth	206205-01
Xylazine	Lloyd Laboratories	139-236
Heparin solution	Abraxis Pharmaceutical Products	504031
Injection grade normal saline	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-20
70% Ethanol	Pharmco Products Inc.	111000140
ThermoCare Small Animal ICU System	Thermocare, Inc.
Adson Forceps	Roboz Surgical Instruments	RS-5230
Derf Needle Holder	Roboz Surgical Instruments	RS-7822
Extra Fine Micro Dissecting Scissors	Roboz Surgical Instruments	RS-5881
Micro-clip	Roboz Surgical Instruments	RS-5420
7-0 silk	Braintree Scientific	SUT-S 103
11-0 nylon on 4 mm (3/8) needle	Sharpoint DR4	AK-2119
Ms CD45.2 antibody	BD Bioscience	553772
Ms CD45.1 antibody	BD Bioscience	553776
Ms CD11b antibody	BD Bioscience	557657
Ms B220 antibody	BD Bioscience	553089
Ms Ly6C antibody	eBioscience	48-5932-80
Ms Ly6G antibody	BD Bioscience	561236
Ms F4/80 antibody	BD Bioscience	565614
Ms CD11c antibody	BD Bioscience	558079
Ms CD3 antibody	eBioscience	48-0032-82
Ms CD4 antibody	BD Bioscience	552051
Ms CD8 antibody	BD Bioscience	563786
LIVE/DEAD™ Fixable Violet Dead Cell Stain Kit	Thermo Fisher	L34955