Мышь Модель васкуляризированной гетеротопной трансплантации селезенки для изучения биологии селезенки и трансплантации иммунитета

Резюме

Этот протокол детализирует хирургические шаги мышиной модели васкуляризированной трансплантации гетеротопической селезенки, технически сложной модели, которая может служить мощным инструментом в изучении судьбы и долговечности клеток селезенки, механизмов различных селезенки популяций клеток в прогрессировании заболевания и трансплантации иммунитета.

Аннотация

Селезенка является уникальным лимфоидным органом, который играет важную роль в гомеостазе иммунной и гематопойетической систем. Пациенты, которые подверглись спленэктомии, независимо от осаждения причин склонны к развитию подавляющего пост-спленэктомии инфекции и опыт повышенный риск глубокого венозного тромбоза и злокачественных новообразований. Недавно эпидемиологические исследования показали, что спленэктомия может быть связана с возникновением сердечно-сосудистых заболеваний, что свидетельствует о том, что физиологические функции селезенки еще не полностью признаны. Здесь мы представляем модель вылагостающих гетеротопических трансплантаций селезенки, которая не только может быть использована для изучения функции и поведенческой активности подмножеств селезенки иммунной клетки в различных биологических процессах, но и может быть мощным инструментом для тестирования терапевтический потенциал трансплантации селезенки при определенных заболеваниях. Основные хирургические шаги этой модели включают сбор донорской селезенки, удаление реципиента родной селезенки, и реваскуляризации селезенки трансплантата. Используя конгенические штаммы мыши (например, мыши с CD45.1/CD45.2 фонами), мы заметили, что после сингенной трансплантации, как донорские селезенки лимфоцитов и миелоидные клетки мигрировали из трансплантата уже после операционный день 1, в соответствии с приток нескольких типов клеток-реципиентов, тем самым генерируя уникальную химеру.  Несмотря на относительно сложные методы, эта процедура может быть выполнена с коэффициентом успеха 90%. Эта модель позволяет отслеживать судьбу, долговечность и функцию спленоцитов во время устойчивого состояния и в условиях болезни после трансплантации селезенки, тем самым предлагая прекрасную возможность открыть для себя определенную роль для селезенки полученных иммунных клеток в различных процессов заболевания.

Введение

Селезенка является крупнейшим вторичным лимфоидным органом в организме и имеет решающее значение в иммунной и гематопойетической систем. Его функции в основном выполняются двумя морфологически отдельными отсеками, красной мякотью и белой мякотью^1. Красная мякоть представляет собой трехмерную сетку из венозных пазух и селезенки, которые состоят из ретикулярных волокон, ретикулярных клеток и связанных с ними макрофагов. Эта уникальная структура позволяет красной мякоти выступать в качестве эффективного фильтра крови, который удаляет посторонние материалы и старые или поврежденные эритроциты. Белая мякоть включает в себя фолликулы, маргинальные зоны, и периартериолярных лимфоидных оболочек (PALS) и является важным местом для антигена захвата и обработки, лимфоцитов самонаведения, преобразования, распространения и созревания². Тем не менее, селезенка обычно рассматривается как незаменимый орган, потому что другие лимфатические органы, такие как лимфатические узлы, также могут выполнять некоторые из своих функций и потеря селезенки обычно не приводит к смерти. Поэтому спленэктомия широко выполняется в качестве терапевтического метода для пациентовс селезенкой или доброкачественными гематологическими заболеваниями 3. Однако пациенты с спленэктомией сталкиваются с рядом длительных осложнений. Бактериальные инфекции являются наиболее признанными осложнениями спленэктомии^4,5. В последнее время подавляющее пост-спленэктомии сепсис был признан интенсивным осложнением спленэктомии, связанные с высокой смертностью⁶. Кроме того, последние эпидемиологические исследования показывают, что спленэктомия может быть связана с возникновением сердечно-сосудистых заболеваний, предполагая, что дальнейшие физиологические функции селезенки еще предстоит изучить^7,8.

В клинике были использованы аутотрансплантация селезенки и аллотрансплантация селезенки. В настоящее время аутотрансплантация селезенки путем имплантации секций селезенки в мешки, созданные в большей области, рассматривается как единственная возможность для сохранения селезенки после травматической спленэктомии^9,10. Тем не менее, эффективность этой операции является спорным, как послеоперационные осложнения, как асептический некроз селезенки и мелкой непроходимости кишечника из-за послеоперационных спаек может произойти¹¹. Аллотрансплантация селезенки участвует в многовисцеральной трансплантации^12. Клинические данные от многовисцеральной трансплантации предполагает, что аллотрансплантация селезенки может играть защитную роль в отторжении аллотрансплантата тонкой кишки, не вызывая трансплантата против хозяина болезни (GVHD)¹². Однако литература о благотворном воздействии аллотрансплантации селезенки как компонента многовисцеральной трансплантации по-прежнему ограничена, и основные механизмы еще предстоит определить. В 2006 году Яир Райснер и др. сообщили, что пересадка ткани эмбриональной селезенки свиньи, которая не имеет Т-клеток для мышей, может вылечить гемофилию А, генетическое заболевание, не вызывая GVHD¹³, поддерживая, что трансплантация селезенки имеет терапевтические перспективы в определенных заболеваний. Поэтому необходимо провести дальнейшие исследования терапевтического потенциала трансплантации селезенки.

Модели трансплантации селезенки животных являются ценными для изучения недооцененной функции иммунных клеток селезенки при прогрессировании заболевания, а также для проверки потенциального терапевтического эффекта трансплантации селезенки. Экспериментальные модели пересадки цельной селезенки были задокументированы с начала 1900-х годов, как было рассмотрено Коэном¹⁴. В 1969 году Коберн Ричард J. и Ли и др. подробно техники трансплантации селезенки у крыс^15,16. Совсем недавно, Swirski FK et al. описал модель мыши трансплантации селезенки¹⁷. По сравнению с крысиными моделями, мышиные модели трансплантации селезенки более привлекательны из-за ряда присущих ей преимуществ. Например, используя модель мыши, мы можем получить доступ к обширному разнообразию реагентов, недоступных для моделей крыс. Кроме того, с помощью конгенических мышей (например, мышей с CD45.1/CD45.2 фоне), сингенной трансплантации селезенки позволяет отслеживать судьбу, долговечность, и функции спленоцитов¹⁸. На основе работы Swirski FK et al.¹⁷, мы дополнительно установили этот упрощенный и расширенный протокол трансплантации селезенки у мышей. Описанный ниже протокол сочетает в себе как надежность, так и осуществимость в стандартизированном порядке и может быть использован в качестве инструмента для изучения биологии селезенки и иммунитета к трансплантации.

протокол

Все процедуры и использование животных в этом исследовании были выполнены в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по уходу и использованию животных Северо-Западного университета (IACUC). В этом исследовании, от 8 до 10 недель мужчин CD45.2 и CD45.1 мышей (как на BALB/c фон, из лаборатории Джексона) были использованы в качестве доноров селезенки и получателей, соответственно, для создания сингенных моделей трансплантации селезенки. Все животные были размещены в стерильной среде в животноводческой среде Северо-Западного университета. Глазная смазка была применена ко всем мышам после анестезии для предотвращения сухости.

1. Хирургическая подготовка, анестезия и режим обезболивании

1. Поместите стерильную одноразовую драпировку (45,7 см х 66 см) на хирургическую платформу. Аккуратно возьмите мышь, введите кетамин (50 мг/кг) и ксилазин (10 мг/кг) интраперитонеально (ивр) для анестезии, и введите 0,05 мг/кг бупренорфина подкожно для обезболивания.
2. Обеспечьте глубину анестезии занозой, побрить волосы во всей области живота бритвой и поместить мышь на стерильной хирургической платформе под операционным микроскопом при 6-10x увеличении.

2. Урожай селезенки донора

1. Стерилизовать живот с алкоголем подготовительной площадки, закрепите конечности хирургической лентой, и сделать 3-4 см средней линии вертикального разреза кожи от лобка к процессу xiphoid с ножницами.
2. Утилищать брюшную стенку стерильными ретракторами из скрепок. Переместите кишечник на правый фланг живота (левый) стороны хирурга с стерильным ватным тампоном, чтобы разоблачить селезенку. Катеризизировать короткую желудочное вену, прикрепленную к селезенке, стерильной низкотемпературной каутерией(рисунок 1A). Поместите кусок стерильной марли, пропитанной солевым раствором 37 градусов по Цельсию над селезенкой, чтобы она была влажной(рисунок 1B).
3. Отделить и мобилизовать портальную вену из ткани поджелудочной железы(рисунок 1С)путем отливания ветвей венпортала (превосходная панкреатикодуоденальная вена и правая желудочная вена); поместите шов вокруг портала вены distal из селеблии(рисунок 1D).
4. Переверните селезенку на правую сторону, чтобы разоблачить ствол аорты и целиакии с селезенкой артерии(рисунок 1E). Вскрыть и мобилизовать аорта-целиакию-селеник артерии путем отливания печеночной артерии и желудочной артерии; поместите шов вокруг проксимальной аорты к целиакии артерии(рисунок 1F-G).
5. Введите 100 международных единиц (IU) гепарина в нижней полывены вены (IVC), чтобы гепаринизировать все тело и ждать 3 мин, чтобы обеспечить гепарин принимать эффекты. Ligate аорты проксимальной к целиакии артерии, трансектировать портальную вену, а затем пронизать все тело с помощью 10 мл гепаринизированного холода (4 кВ) сольника (10 мл/20 с) от брюшной аорты дистальной до целиакии ствола(рисунок 1H).
6. Соберите трансплантатселей для селезенки с соответствующим аортальным селезенко-селенным сегментом и портальной веной вместе с сегментом селезенки и небольшой порцией ткани поджелудочной железы. Сохранить трансплантат в 5 мл 4 градусов по Цельсию сольный раствор перед пересадкой. Эвтаназия мышь шейки матки дислокации.

3. Имплантация спленэктомии и селезенки трансплантата

1. Поместите грелку на хирургическую платформу и отрегулируйте температуру до 37 градусов по Цельсию. Поместите стерильную драпировку (45,7 см х 66 см) на верхней части грелки, чтобы создать стерильную хирургическую платформу. Повторите шаги 2.1 и 2.2 для хирургической подготовки и анестезии. Сделайте разрез средней линии 3-4 см и урепровите брюшную стенку, как описано в шаге 2.1 и шаге 2.2.
2. Тщательно переместите кишечник на правую сторону мыши стерильным ватным тампоном, чтобы разоблачить селезенку получателя. Свайство селезенки вены и артерии и удалить селезенку.
3. Аккуратно переместите кишечник в левую сторону мыши и накройте кишечник влажной марлей (пропитанной стерильным солевым раствором 37 градусов Цельсия). Вскрыть и сваить поясничные ветви инфрагенной аорты и IVC; перекрестный зажим инфрачной аорты и IVC с помощью двух 4 мм микрососудистых зажимов.
4. Поместите 11-0 нейлоновый шов через инфрагенную аорту (полная толщина) и вмагистрайте для создания эллиптической аортомии одним разрезом с микросцисорами (длина должна соответствовать диаметру донорской аорты, рисунок 2А). Пирс IVC с помощью 30 G иглы для создания эллиптической венотомии и расширить открытие донорского портала вены соответствует длина с помощью микроскисаторов(рисунок 2A).
5. Очистить внутрилюмиевную кровь или сгусток крови (в аорте и IVC) с 500 зл игеля гепаринизированного солинового раствора (10 единиц/мл).
6. Поместите трансплантат селезенки в правом фланге живота мыши получателя; тщательно определить аортальные манжеты донора и портал вены донора. Убедившись, что сосуды не скручиваются, накройте пересадку селезенки марлей, пропитанной холодным (4 кВС) солевым раствором.
7. Соедините аортальную манжету донора к проксимальной и дистальной вершине аортаотомии реципиента с двумя швами пребывания (11-0 нейлоновых швов, так же, как ниже)(Рисунок 2B,C). Сделать анастомоз с 2-3 укусов непрерывного 11-0 нейлоновых швов между аорты манжеты донора и аортаотомии реципиента (передняя стенка) (Рисунок 2D). Переверните пересадку селезенки на левую сторону получателя; сделать анастомоз между аорты манжеты донора и аортотомии реципиента (задняя стенка) (Рисунок 2E).
8. Выполните анастомоз для подключения вены портала донора к задней стенке IVC получателя, используя от 4 до 5 укусов непрерывных швов на внутренней стороне IVC, а затем закрыть шов на внешней стороне IVC(Рисунок 2F,G).
9. Отпустите зажимы сосуда и используйте стерильный ватный тампонад, чтобы кровотечение тампонады, пока цвет селезенки не будет восстановлен(рисунок 2H).
10. Закройте брюшную полость с 5-0 синтетический абсорбируемый шов vicryl в непрерывном рисунке. Закройте слой кожи 5-0 нейлоновым швом в прерванном рисунке.
    ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Для шагов 4.7-4.8, в качестве альтернативы, сделать анастомоз между портала вены донора и IVC реципиента первый (шаг 4.8); затем сделать анастомоз между аорты манжеты донора и задней стенки аортоми реципиента, используя от 2 до 3 непрерывных швов внутри аорты и закрыть шов на внешней стороне аорты.

4. Восстановление животных

1. Вводят 1 мл теплого сосудистого подкожного через 4 отдельных места (0,25 мл/локации) после закрытия брюшной полости.
2. Держите мышь в контролируемом температурой инкубаторе (30 градусов по Цельсию) в течение первых нескольких часов после операции, следите за мышью до тех пор, пока она не придет в себя достаточное сознание, а затем перенесите мышь в новую чистую клетку с обычной пищей и водой, с грелкой (30 градусов по Цельсию) ) под клеткой. Держите мышь после операции в отдельной клетке.

5. Послеоперационное управление болью

1. Вводят 0,05 мг/кг бупренорфина подкожно 24 ч и 48 ч после операции для поддержания режима анальгезии.

Результаты

Вся процедура пересадки мышечной селезенки может быть завершена в течение 90 минут опытными микрохирургами. Наша лаборатория провела более 100 пересадок селезенки у мышей. Коэффициент успеха составляет более 90%, как это определено выживанием мыши получателя и пересадк?...

Обсуждение

Убедительные данные свидетельствуют о том, что моноциты селезенки играют важную роль в стерильных воспалительных процессах, таких как атеросклероз¹⁹, острый ишемический мозг²⁰ или травмы легких¹⁸, а также травмы имиокарда I /R и реконструкция

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine	Wyeth	206205-01
Xylazine	Lloyd Laboratories	139-236
Heparin solution	Abraxis Pharmaceutical Products	504031
Injection grade normal saline	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-20
70% Ethanol	Pharmco Products Inc.	111000140
ThermoCare Small Animal ICU System	Thermocare, Inc.
Adson Forceps	Roboz Surgical Instruments	RS-5230
Derf Needle Holder	Roboz Surgical Instruments	RS-7822
Extra Fine Micro Dissecting Scissors	Roboz Surgical Instruments	RS-5881
Micro-clip	Roboz Surgical Instruments	RS-5420
7-0 silk	Braintree Scientific	SUT-S 103
11-0 nylon on 4-mm (3/8) needle	Sharpoint DR4	AK-2119
Ms CD45.2 antibody	BD Bioscience	553772
Ms CD45.1 antibody	BD Bioscience	553776
Ms CD11b antibody	BD Bioscience	557657
Ms B220 antibody	BD Bioscience	553089
Ms Ly6C antibody	eBioscience	48-5932-80
Ms Ly6G antibody	BD Bioscience	561236
Ms F4/80 antibody	BD Bioscience	565614
Ms CD11c antibody	BD Bioscience	558079
Ms CD3 antibody	eBioscience	48-0032-82
Ms CD4 antibody	BD Bioscience	552051
Ms CD8 antibody	BD Bioscience	563786
LIVE/DEAD™ Fixable Violet Dead Cell Stain Kit	Thermo Fisher	L34955