血管化异位脾移植小鼠模型在脾细胞生物学和移植免疫研究中的应用

摘要

该协议详细介绍了血管化异位脾移植小鼠模型的手术步骤, 这是一种技术上具有挑战性的模型, 可作为研究脾脏细胞命运和寿命的有力工具, 而脾脏是不同脾脏的机制细胞群在疾病进展, 和移植免疫。

摘要

脾脏是一个独特的淋巴器官, 在免疫和造血系统的稳态中发挥着至关重要的作用。已接受脾切除术的患者, 无论沉淀原因如何, 都容易出现压倒性的脾切除术后感染, 并经历深静脉血栓形成和恶性肿瘤的风险增加。最近, 流行病学研究表明, 脾切除术可能与心血管疾病的发生有关, 这表明脾脏的生理功能尚未得到充分认识。本文介绍了一种小鼠血管化异位脾移植模型, 该模型不仅可用于研究脾脏免疫细胞亚群在不同生物过程中的功能和行为活动, 而且可以作为检测的有力工具脾脏移植治疗某些疾病的潜力。该模型的主要手术步骤包括供体脾收获、供者原生脾脏切除和脾移植血运重建。使用同源小鼠菌株 (例如, 具有 cd45. 半 CD45.2 背景的小鼠), 我们观察到, 在同种异体移植后, 捐献者衍生的脾淋巴细胞和骨髓细胞早在术后第1天就从移植物中移出, 并与多种类型的接收细胞的涌入, 从而产生一个独特的嵌合体。 尽管技术相对具有挑战性, 但这一过程可以用 & gt;90 的成功率来完成。该模型允许跟踪脾细胞在稳定状态下和脾脏移植后的疾病设置中的命运、寿命和功能, 从而提供了一个很好的机会来发现脾脏衍生免疫细胞的独特作用。不同的疾病过程。

引言

脾脏是人体最大的继发性淋巴器官, 在免疫和造血系统中至关重要。它的功能主要是由两个形态上不同的隔间, 红色纸浆和白色纸浆¹。红色牙髓是由网状纤维、网状细胞和相关巨噬细胞组成的静脉窦和脾脊髓的三维网状结构。这种独特的结构使红色的果肉作为一个有效的血液过滤器, 去除异物和旧的或损坏的红细胞。白色牙髓包括卵泡、边缘区和动脉周围淋巴鞘 (ALS), 是抗原捕获和处理、淋巴细胞归巢、转化、增殖和成熟²的重要部位。然而, 脾脏通常被认为是一个可有可无的器官, 因为其他淋巴器官, 如淋巴结, 也可以执行其一些功能, 脾脏的丧失通常不会导致死亡。因此, 脾切除术已被广泛用作脾损伤或良性血液疾病^患者的一种治疗方法3。然而, 脾切除术的患者面临着一些长期的并发症。细菌感染是脾切除术^{4,5 的}最佳公认并发症。最近, 压倒性的脾切除术后脓毒症已被认为是脾切除术的一个密集的并发症与高死亡率⁶。此外, 最近的流行病学研究表明, 脾切除术可能与心血管疾病的发生有关, 这表明脾脏的进一步生理功能仍有待探索 7^,8。

脾脏自体移植和同种异体脾移植在临床上都得到了应用。目前, 脾脏自体移植通过植入部分的脾脏组织在大动量产生的袋被认为是唯一的可能性, 以保持脾功能后外伤性脾切除 9^,10.然而, 这种手术的疗效是值得商榷的, 手术后并发症, 如脾组织无菌坏死和小肠梗阻, 由于术后粘连可能发生¹¹。同种异体脾移植参与^多脏器移植12。多脏器移植的临床证据表明, 同种异体脾移植可能在小肠同种异体排斥反应中起保护作用, 而不会引起移植物抗宿主病 (GVHD)¹²。然而, 关于同种异体脾移植作为多脏器移植成分的有益效果的文献仍然有限, 其潜在机制仍有待界定。2006年, Yair Reisner 等人报告说, 将没有 T 细胞的猪胚胎脾脏组织移植到小鼠身上可以治愈血友病 A, 这是一种没有引起 GVHD¹³的遗传性疾病, 支持脾脏移植具有治疗作用。某些疾病。因此, 有必要进一步研究脾脏移植的治疗潜力。

脾脏移植动物模型对于探讨脾脏免疫细胞在疾病进展中的不欣赏功能以及测试脾脏移植的潜在治疗效果具有重要价值。正如科恩^14号所评论的那样, 自20世纪初以来, 已经记录了整个实验性的脾脏移植模型。1969年, coburn richard j. 和 lee 等人详细介绍了^{15、16 大}鼠的脾脏移植技术。最近, Swirski FK 等人描述了一个小鼠脾脏移植¹⁷模型。与大鼠模型相比, 小鼠脾脏移植模型由于其固有的几个优点而更具吸引力。例如, 通过使用鼠标模型, 我们可以访问大鼠模型所无法获得的各种试剂。此外, 通过使用同源小鼠 (例如, 具有 cd45. NCD45.2 背景的小鼠), 同种异体脾脏移植可以跟踪脾细胞^{18 的}命运、寿命和功能。在 Swirski FK 等人的工作基础上,我们进一步建立了这种简化和增强的小鼠脾移植方案。下面描述的协议以标准化的方式将可靠性和可行性结合起来, 可作为研究脾脏生物学和移植免疫的工具。

研究方案

本研究中的所有程序和动物使用都是根据西北大学内部动物护理和使用委员会 (IACUC) 批准的协议进行的。在这项研究中, 8 至10周龄的男性 CD45.2 和 CD45.1 小鼠 (均为 balb1 背景, 杰克逊实验室) 分别作为脾脏捐献者和接受者, 建立了同种异体脾脏移植模型。所有的动物都被安置在西北大学动物设施的无菌环境中。眼睛润滑剂应用于所有小鼠麻醉后, 以防止干燥。

1. 手术准备、麻醉和镇痛制度

1. 将无菌一次性悬垂 (45.7 厘米 x66 厘米) 放置在手术平台上。轻轻抓住小鼠, 注射氯胺酮 (50 mg/kg) 和木胺 (10mg变 kg) 腹腔 (i. p) 进行麻醉, 并注射 0.05 mg/kg 丁丙诺非进行镇痛。
2. 通过脚趾捏, 用剃须刀剃须整个腹部区域的头发, 并将鼠标放在无菌手术平台上的手术平台上, 在6-10x 的放大倍率下, 确保麻醉的深度。

2. 供体脾收获

1. 用酒精准备垫消毒腹部 , 用手术胶带固定四肢 , 用剪刀做一个 3 - 4 厘米的中线垂直皮肤切口 , 从到小皮过程。
2. 用纸夹制成的无菌牵引器收回腹壁。将肠子移动到腹部 (外科医生的左侧) 一侧, 用无菌棉签暴露脾脏。用无菌低温烧焦的方法小心附着在脾脏上的短胃静脉 (图 1 a)。将一块用37°c 盐水浸泡的无菌纱布放在脾脏上, 使其保持湿润 (图 1 b)。
3. 通过结扎门静脉分支 (上胰十二指肠静脉和右胃静脉), 将门静脉从胰腺组织 (图 1c) 中分离和动员;在与脾静脉远端的门静脉周围放置缝合线 (图 1d)。
4. 将脾脏向右翻转, 将主动脉和腹腔主干与脾动脉暴露 (图 1e)。通过结扎肝动脉和胃动脉来解剖和动员主动脉脾动脉;在腹腔动脉近端的主动脉周围放置一个缝合线 (图 1F-g)。
5. 将100个国际单位 (IU) 肝素注入下腔静脉 (IVC), 对全身进行肝素化治疗, 并等待 3分钟, 以确保肝素生效。将主动脉近端与腹腔动脉连接, 横切门静脉, 然后使用从腹主动脉远端到腹腔主干的10毫升肝素冷 (10l·20 s) 盐水灌注整个身体 (图 1h)。
6. 收集脾脏移植与相关的主动脉-腹腔脾段和门静脉, 以及部分脾静脉和胰腺组织的一小部分。移植前将移植物保存在5°c 盐水中的5毫升中。通过颈椎脱位使老鼠安乐死。

3. 接受脾切除术和脾移植

1. 将加热垫放置在手术平台上, 并将温度调整为37°c。将无菌悬垂 (45.7 厘米 x66 厘米) 放在加热垫的顶部, 创建无菌手术平台。重复步骤2.1 和2.2 进行手术准备和麻醉。如步骤2.1 和步骤2.2 中所述, 做一个3-4 厘米的中线切口并收回腹壁。
2. 用无菌棉签小心地将肠道移动到老鼠的右侧, 以暴露受者的脾脏。结扎脾静脉和动脉, 切除脾脏。
3. 小心地将肠道移动到小鼠的左侧, 用湿纱布覆盖肠道 (用无菌37°c 盐水浸泡)。解剖和结扎肾下主动脉和 IVC 的腰椎分支;用两个4毫米微血管夹夹住肾下主动脉和 IVC。
4. 将11-0 尼龙缝合穿过肾下主动脉 (全厚度), 然后缩回, 通过使用微剪刀的单一切口创建一个椭圆形主动脉体 (长度应与供体主动脉的直径相匹配,图 2 a)。使用 30 G 针刺穿 IVC 以创建椭圆静脉切开术, 并使用微剪刀将开口延伸到供体门静脉匹配长度 (图 2a)。
5. 用500μl 的肝素化盐水清除腔内血液或血块 (主动脉和 IVC) (10 Units/ml)。
6. 将脾脏移植放置在受者小鼠腹部的右侧;仔细识别供者的主动脉袖口和供者的门静脉。在确保血管没有扭曲后, 用用冷 (4°C) 盐水浸泡的纱布覆盖脾脏移植物。
7. 将供者的主动脉袖口连接到受者主动脉切开术的近端和远端, 并有两个保持缝合线 (11-0 尼龙缝合线, 如下图2B, c)。在供者的主动脉袖口和受者的主动脉切开术 (前壁) 之间进行2-3 咬连续11-0 尼龙缝合的吻合 (图 2d)。将脾脏移植物翻转到受者的左侧;在供者主动脉袖口和受者主动脉腔 (后壁) 吻合 (图 2e)。
8. 进行吻合, 将供者的门静脉连接到受者 IVC 的后壁, 在 IVC 内侧使用4至5段连续缝合, 然后关闭 IVC 外部的缝合线 (图 2F, g)。
9. 松开血管夹具, 使用无菌棉签来止血, 直到脾脏颜色恢复 (图 2h)。
10. 关闭腹部与5-0 合成可吸收的维克里尔缝合在一个连续的模式。用5-0 尼龙缝合在中断的图案关闭皮肤层。
    请注意:对于步骤 4.7-4.8, 或者, 在供者的门静脉和接受者的 IVC 第一步 (步骤 4.8) 之间进行吻合 (步骤 4.8);然后在供者的主动脉袖口和受者主动脉切开术后壁之间进行吻合, 在主动脉内侧使用2至3个连续缝合线, 并关闭主动脉外部的缝合线。

4. 动物恢复

1. 关闭腹部后, 通过4个不同的位置 (0.25 mll 位置), 在皮下注入1毫升的温盐。
2. 手术后的头几个小时, 将鼠标放在温控孵化器 (30°C) 中, 监控鼠标, 直到它恢复了足够的意识, 然后将鼠标转移到一个新的清洁笼子, 有一个定期的食物和水, 并有一个加热垫 (30°C)) 在笼子下面。将小鼠手术后关在一个单独的笼子里。

5. 手术后疼痛管理

1. 术后注射 0.05 mg/kg 丁丙诺非24小时和 48小时, 以维持镇痛方案。

结果

有经验的显微外科医生可以在90分钟内完成小鼠脾脏移植的整个过程。我们的实验室已经在小鼠身上进行了100多次脾脏移植。成功率超过 90%, 定义为受者小鼠和脾脏移植到术后日 (POD) 1 或 POD 7 (我们的研究终点) 的生存率。脾脏移植的存活得到了脾脏细胞宏观外观和流式细胞仪分析的证实。根据我们的经验, 流式细胞仪分析 (liveydead 细胞活力检测) 是非常敏感的, 以确定脾脏?...

讨论

令人信服的证据表明, 脾衍生单核细胞在无菌炎症过程中发挥着重要作用, 如动脉粥样硬化¹⁹、急性缺血性脑20或肺损伤¹⁸, 以及心肌 isr 损伤和改造^21,22,23。这些报告突出表明, 脾脏在许多慢性病中的作用被低估, 其中心血管疾病是重要的 (特别是考虑到它是全球头号杀手)。脾?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ketamine	Wyeth	206205-01
Xylazine	Lloyd Laboratories	139-236
Heparin solution	Abraxis Pharmaceutical Products	504031
Injection grade normal saline	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-20
70% Ethanol	Pharmco Products Inc.	111000140
ThermoCare Small Animal ICU System	Thermocare, Inc.
Adson Forceps	Roboz Surgical Instruments	RS-5230
Derf Needle Holder	Roboz Surgical Instruments	RS-7822
Extra Fine Micro Dissecting Scissors	Roboz Surgical Instruments	RS-5881
Micro-clip	Roboz Surgical Instruments	RS-5420
7-0 silk	Braintree Scientific	SUT-S 103
11-0 nylon on 4 mm (3/8) needle	Sharpoint DR4	AK-2119
Ms CD45.2 antibody	BD Bioscience	553772
Ms CD45.1 antibody	BD Bioscience	553776
Ms CD11b antibody	BD Bioscience	557657
Ms B220 antibody	BD Bioscience	553089
Ms Ly6C antibody	eBioscience	48-5932-80
Ms Ly6G antibody	BD Bioscience	561236
Ms F4/80 antibody	BD Bioscience	565614
Ms CD11c antibody	BD Bioscience	558079
Ms CD3 antibody	eBioscience	48-0032-82
Ms CD4 antibody	BD Bioscience	552051
Ms CD8 antibody	BD Bioscience	563786
LIVE/DEAD™ Fixable Violet Dead Cell Stain Kit	Thermo Fisher	L34955