Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

الخزعة الكيسية الكيسية والتزجيج مطلوبان لإجراء اختبارات جينية قبل الزرع بكفاءة. نهج ينطوي على فتح تسلسلي للpellucida المنطقة واسترجاع 7-8 خلايا التروبسيتوديرم في اليوم 5-7 بعد التلقيح يحد من كل من عدد التلاعبات المطلوبة والتعرض للجنين لظروف بيئية دون الأمثل.

Abstract

يتم إجراء خزعة الكيسة الكيسية للحصول على تشخيص وراثي موثوق به خلال دورات التلقيح الاصطناعي مع الاختبار الوراثي قبل الزرع. ثم، فإن سير العمل المثالي ينطوي على بروتوكول التزجيج آمنة وفعالة، وذلك بسبب الوقت التحول من تقنيات التشخيص ونقل الجنين (الأجنة) المختارة على بطانة الرحم الفسيولوجية في دورة طبيعية التالية. نهج خزعة يشمل فتح تسلسلي للpellucida المنطقة واسترجاع 5-10 خلايا التروبسيتوديرم (من الناحية المثالية 7-8) يحد من كل من عدد التلاعبات المطلوبة والتعرض للجنين لظروف بيئية دون المستوى الأمثل. بعد التدريب المناسب، تم استنساخ هذه التقنية عبر مشغلين مختلفين من حيث توقيت الخزعة (حوالي 8 دقائق، تتراوح 3-22 دقيقة استناداً إلى عدد الأجنة إلى خزعة لكل طبق)، والتشخيصات القاطعة التي تم الحصول عليها (حوالي 97.5٪) ومعدلات المواليد الحية بعد نقل الكيسة الكيسية النيولويدية الدافئة (> 40٪). وكان معدل البقاء على قيد الحياة بعد خزعة، والتزجيج والاحترار يصل إلى 99.8٪. وكان معدل إعادة التوسع في 1.5 ساعة من الاحترار يصل إلى 97٪، ويعتمد إلى حد كبير على التوقيت بين خزعة والتزجيج (من الناحية المثالية ≤ 30 دقيقة)، ونوعية الكيسة الكيسية المورفولوجية ويوم الخزعة. بشكل عام، فمن الأفضل لvitrify الكيسة الكيسية المنهارة. ولذلك، في دورات غير PGT، يمكن إجراء انكماش اصطناعي بمساعدة الليزر للحث على انهيار الجنين قبل الحفظ بالتبريد. المنظور المستقبلي الواعد هو التحليل غير الغازي لوسائل الإعلام الثقافية التلقيح الاصطناعي بعد ثقافة الكيسة الكيسية كمصدر مفترض للحمض النووي الجنيني. ومع ذلك، لا تزال هذه الطليعة المحتملة قيد التحقيق، ومع ذلك لا بد من تحديد بروتوكول موثوق به والتحقق من صحته.

Introduction

والهدف الرئيسي لعلم الأجنة البشرية الحديثة هو زيادة عدد المواليد الأحياء في كل دورة محفزة إلى أقصى حد وخفض التكاليف والوقت والجهود المبذولة لتحقيق الحمل. ولتحقيق هذا الهدف، ينبغي استخدام نُهُج معتمدة لاختيار الأجنة لتحديد الأجنة المختصة بالإنجاب ضمن مجموعة تم الحصول عليها خلال دورة التلقيح الاصطناعي. وفقا لأحدث الأدلة، ثقافة الكيسة الكيسية1 جنبا إلى جنب مع اختبار الكروموسومات الشاملة ونقل الأجنة euploid المزجج (ET) هو الإطار الأكثر كفاءة لزيادة كفاءة التلقيح الاصطناعي2. ومن الواضح أن اختبار الأنوبلويدي يتطلب عينة جنينية، والتي تمثل في الوقت الحاضر في الغالب من عدد قليل من الخلايا المستردة من التروبسيتوديرم (TE)، أي الجزء من الكيسة الكيسية التي تعطي الأصل لمرفقات الجنين (على سبيل المثال، المشيمة) أثناء الحمل . وإلى جانب تحليل النمط الكاريوبي، يمكن أيضاً تقييم طفرات جينية واحدة من خزعة TE كجزء من استراتيجية سريرية تعرف باسم الاختبارات الجينية قبل الزرع (PGT; -A لداء الأويوبلويدات، -SR لإعادة ترتيب الكروموسومات الهيكلية، -M للأمراض المونوجينية). وقد تم التصورة عن طرق خزعة البويضة/الأجنة الأخرى واعتمدت سريرياً على مدى العقود الماضية، وهي خزعة الأجسام القطبية وخزعة البلابومير. ومع ذلك، فإن استخدامها ينخفض في الوقت الحاضر لأن عيوبها الإجرائية (مثل زيادة عبء العمل وخطر التأثير الإنجابي) والقيود التشخيصية (مثل قضايا تحليل الخلايا الواحدة) تعوق ضمناً تحقيق توازن كاف بين التكاليف والمخاطر و الفوائد (للاطلاع على مراجعة انظر3).

في هذه الورقة، يتم وصف أحد البروتوكولات الرئيسية لخزعة TE بدقة جنبا إلى جنب مع إجراءات التزجيج والاحترار والنقل اللاحقة المطلوبة. سير العمل هنا الموضح مثالي لوحدة PGT مشغول.

كما سبق وصفه من قبل مجموعتنا4،5، ينطوي الإجراء على فتح تسلسلي للبيلوسيدا زونا من الكيسات الكيسية الموسعة بالكامل وإزالة عدد قليل من خلايا TE (في المتوسط 7-8). بالمقارنة مع اليوم 3 بمساعدة الليزر الفقس القائم على الكيسة الكيسية خزعة الأسلوب6، وهذا الإجراء قد يخفف الجدول اليومي لوحدة التلقيح الاصطناعي حيث يجب تنفيذ الإجراءات الدقيقة ، مثل خزعة الكيسة الكيسية والتزجيج ، في الوقت المناسب. بمجرد أن تصل الكيسة الكيسية إلى توسعها الكامل، يمكن إجراء الخزعة عن طريق اختيار خلايا TE لإزالتها، وبالتالي منع خطر فتق كتلة الخلية الداخلية (ICM)، مما يجعل الإجراء صعباً. في الأدب ، تم وصف بروتوكول ثالث من خزعة الكيسة الكيسية أيضا ، والذي ينطوي على إجراء الفقس بمساعدة الليزر بمجرد أن يصل الجنين بالفعل إلى مرحلة الكيسة الكيسية ، قبل ساعات قليلة من الإجراء5،7. ومع ذلك، فإن هذا النهج هو أكثر استهلاكا للوقت ويناسب أساسا وحدات التلقيح الاصطناعي التي تقوم بتنفيذ خزعة TE في أيدي المشغلين ذوي الخبرة المحدودة ونظرا لعبء العمل اليومي المتوسط والمنخفض.

ينبغي أن يكون حقن الحيوانات المنوية داخل التسرّسي (ICSI)8 تقنية موحدة إذا كان الهدف من إجراء التحاليل الوراثية في التلقيح الاصطناعي. وبالمثل، فإن وجود نظام ثقافي مناسب لحصاد الأجنة بأمان إلى مرحلة الكيسة الكيسية الكيسية أمر بالغ الأهمية لتنفيذ استراتيجية خزعة TE. وهناك عدد كاف من الحاضنات، فضلا عن استخدام التوتر الأكسجين المنخفض هي الشروط الأساسية لهذه الغاية، وليس للتنازل عن معدل الكيسة الكيسية9. وفي الوقت نفسه، هناك حاجة إلى برنامج فعال للحفظ بالتبريد لإدارة دورة PGT بأمان. في العقد الماضي، أدى تنفيذ التزجيج إلى زيادة معدلات البقاء على قيد الحياة بالتبريد في الأجنة حتى تصل إلى > 99%10،11. وقد وفر ذلك وقتاً كافياً لإجراء الاختبارات الجينية وتأجيل نقل الأجنة إلى الدورة الشهرية التالية، على بطانة الرحم غير المحفزة وربما الأكثر تقبلاً12.

كل من خزعة TE والتزجيج تتطلب مهام تتطلب مهارات صارمة وفعاليتها قد تختلف عبر المشغلين عديمي الخبرة. ولذلك، يُدعى إلى فترة تدريب محددة قبل السماح لكل مشغل بإجراء هذه الإجراءات سريرياً؛ وعلاوة على ذلك، ينبغي تقييم الحفاظ على مهارات المشغلين بصورة دورية عن طريق رصد مؤشرات الأداء الرئيسية لإجراءات الحفظ بالتبريد والخزعة. وينبغي لكل عيادة من عيادات التلقيح الاصطناعي أن تضع مؤشرات الأداء الرئيسية الداخلية لهذه الغاية، التي يجب أن تُقارب تلك التي تنشرها الاتحادات الدولية و/أو النتائج التي تنشرها المختبرات المرجعية.

يتم التحقق من صحة الخزعة TE، وتسخين التزجيج، وإجراءات المشاهدة في وحدتنا، التي تم توحيدها عبر جميع المشغلين المعنيين كما ورد في ثلاثة منشورات سابقة11،13،14 .

Protocol

بروتوكول خزعة الكيسة الكيسية البشرية، هنا وصفها، يتبع المبادئ التوجيهية للجنة أخلاقيات البحوث البشرية G.EN.E.R.A.

ملاحظة: يرجى الرجوع إلى جدول المواد للاطلاع على المواد المطلوبة. وتنطوي المواد الأخرى المطلوبة على الأحذية المختبرية والزي، وقناع الوجه الجراحي، وغطاء الشعر، والقفازات الجراحية، والعلامة الدائمة غير السامة، وملقط، ومطهر. استخدام ثوب الجراحية، والقفازات الجراحية القابل للتصرف، قناع الوجه، وغطاء الشعر إلزامي لمنع خطر التلوث. يجب تنظيف جميع مناطق العمل، وكذلك المعدات المشاركة في العملية، بشكل كامل مع مطهر المختبر (على سبيل المثال، Oosafe) قبل البدء في أي إجراء. يجب أن تكون جميع المواد الاستهلاكية ووسائل الإعلام المستخدمة معقمة ومعبأة بشكل فردي أو aliquoted. ويُقترح استخدام محطة عمل مخصصة لإجراء خزعة وأنابيب والحد من وصول المنطقة فقط إلى المشغلين المشاركين في الإجراء (أخصائي الأجنة والشاهد).

1. التحضير في اليوم السابق لإجراء خزعة

  1. إعداد طبق ثقافة الخزعة آخر.
    1. ضع 6 قطرات من 20 ميكرولتر وسط ثقافة التلقيح الاصطناعي (جدولالمواد)في طبق ثقافة التلقيح الاصطناعي وتراكب مع 6 مل من الزيوت المعدنية قبل الدافئة لثقافة الجنين (جدولالمواد).
    2. إضافة 10 ميكرولتر أخرى من التلقيح الاصطناعي وسط الثقافة إلى كل قطرة. حضانة بين عشية وضحاها في 37 درجةمئوية في جو تسيطر عليها (5٪ س 2، 6٪ CO2).
  2. إعداد طبق التلقيح الاصطناعي 4 جيدا لوحة لالرينسالكيسة بعد خزعة.
    1. ضع 600 ميكرولتر من وسط ثقافة التلقيح الاصطناعي في أول بئرين وتراكب مع 300 ميكرولتر من الزيوت المعدنية قبل تسخينها لثقافة الأجنة.
    2. حضانة بين عشية وضحاها في 37 درجةمئوية في جو تسيطر عليها (5٪ س 2، 6٪ CO2).
  3. الاستغناء عن 1.5 ميكرولتر من محلول التحميل (جدولالمواد)في كل أنبوب PCR لاستخدامها لأنابيب خلايا TE، وتدور عليه والاحتفاظ بها في 4 درجة مئوية.

2. التحضير في يوم إجراء الخزعة

  1. إعداد طبق خزعة.
    1. ضع 3 قطرات من 10 ميكرولتر HEPES-buffered المتوسطة (تستكملمع الزلال المصل البشري) (جدول المواد) في صف واحد في طبق ثقافة التلقيح الاصطناعي.
    2. كرر الخطوة 1.1.1 وفقًا لعدد الكيسات الكيسية المتوفرة (ما يصل إلى 4 أكياس كيسة واحدة لكل طبق) وتراكب مع 6 مل من الزيت المعدني المُدفأ مسبقًا لثقافة الأجنة.
    3. قم بحضانة الطبق عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل إجراء الخزعة.

3. اختيار الكيسة الكيسية والدرجات

  1. الصف الكيسة الكيسية وفقا لتوسعها والمظهر المورفولوجي من ICM وTE (الشكل1).
    ملاحظة:     تم تكييف معايير الدرجات من غاردنر ومدرسة15 ووصفها سابقا من قبل Capalbo وآخرون وCimadomo وآخرون4،11.
    1. تعريف حجم وتوسيع الصف على النحو التالي: A لكيسة الكيسة الكيسية فقست بالكامل، B لكيسة البلاسط الفقس، C لكيسة كيسة مكبرة موسعة بالكامل، وD لكيسة لا توسع (يتم biopsied هذه الأجنة فقط إذا لم تتوسع أكثر حتى اليوم 7).
    2. تعريف ICM الصف: 1 لICM ملحوظ مع العديد من الخلايا معبأة بدقة؛ 2 لتمييز مع عدة خلايا ولكن معبأة تقريبا. 3 لصعوبة التمييز مع عدد قليل جدا من الخلايا منخفضة الجودة.
    3. تعريف درجة TE على النحو التالي: 1 للظهارة منظمة تنظيما جيدا مع عدة خلايا؛ 1 للظهارة منظمة تنظيما جيدا مع عدة خلايا؛ 1 للظهارة منظمة تنظيما جيدا مع عدة خلايا؛ 1 للظهارة منظمة 2 للظهارة فضفاضة مع عدد قليل من الخلايا. 3 لخلايا قليلة و/ أو كبيرة منخفضة الجودة.

4. خزعة التروبيتودرم

  1. إجراء خزعة TE على جميع الكيسات الكيسية القابلة للحياة الموسعة بالكامل (ويفضل أن يكون C درجة للحجم والتوسع).
  2. تعيين عقد وخزعة ماصات لكل إجراء خزعة. توصيات ماصة خزعة هي التالية: 30 ميكرومتر القطر الداخلي، 35 درجة زاوية الانحناء، 0.75 مم طرف المسافة لثني.
  3. تسمية طبق خزعة مع تفاصيل المريض (اسم المرأة واللقب، وتاريخ الميلاد والهوية) ومن ثم ترقيم كل قطرة مع الجنين ودورة الهويات. استخدام علامة دائمة غير سامة.
  4. نقل الكيسة الكيسية مع 300 م تجريد ماصة إلى أول قطرة من طبق خزعة وشطفه من أجل إزالة الزائدة من وسط الثقافة. ثم حرك الكيسة الكيسية في القطرة الثانية من طبق الخزعة.
  5. نقل الطبق إلى المجهر المقلوب ورئيس خزعة ماصة aspirating بعض المتوسطة من القطرة الثالثة من طبق خزعة.
  6. في التكبير 20x، توجيه الكيسة الكيسية للحصول على رؤية واضحة من ICM. عندما يتم تصورها في الساعة 7 (مقابل المنطقة التي سيتم استهدافها لإزالة خلايا TE)، وتأمين الجنين على ماصة عقد (الشكل2a).
  7. التركيز على pellucida المنطقة والتأكد من أن كل من الماصات والكيسة الكيسية هي على نفس المستوى البؤري.
  8. التبديل إلى هدف الليزر (نبض الوقت 0.3 مللي ثانية، 6.5 م) ووضع مؤشر الليزر على pellucida المنطقة في الجانب الآخر من ICM. حفر pellucida المنطقة من خلال 2-3 نبضات الليزر (الشكل2ب).
  9. اضغط بلطف على ماصة خزعة ضد pellucida المنطقة وضربة بعض المتوسطة من خلال خرق لفصل خلايا TE من سطحها الداخلي وتسريع انهيار الكيسة الكيسية (الشكل2ج).
  10. بمجرد فصل TE (الشكل2D)،أدخل من خلال ثقب (إذا لزم الأمر، وجعلها أوسع مع نبض الليزر الأخير) واستنشاق عدد قليل من خلايا TE (من الناحية المثالية 7−813،16) في ماصة خزعة مع شفط لطيف (الشكل2e).
  11. تحريك قليلا ماصة خزعة إلى الوراء أثناء تطبيق شفط معتدلة لتمتد الخلايا المستهدفة (الشكل2f).
  12. توجيه الليزر نحو أنحف جزء من الخلايا المستنشقة وإشعال نبضات الليزر 2−5 عند التقاطعات بين الخلايا لفصل الخلايا المستهدفة عن جسم الجنين (الشكل2g). يمكن تعديل توقيت نبضات الليزر وعدد النبضات وفقا لنوعية الكيسة الكيسية. ومع ذلك، حاول التقليل منها لتجنب lysis الخلية.
  13. بعد فصل جزء TE من الكيسة الكيسية (الشكل2H)،الإفراج عنه في نفس قطرة خزعة بعيدا عن الكيسة الكيسية. وهذا ضروري لمنعهم من أن يتم امتص مرة أخرى في ماصة خزعة (الشكل2i).
  14. الإفراج عن الكيسة الكيسية من ماصة عقد ورفع على الفور كل من الماصات لمنع جزء من التمسك بها.
  15. التقاط صورة للجزء biopsied لغرض مراقبةالجودة (الشكل 3).
    ملاحظة: إذا كان أكثر من كيسة واحدة أن يكون biopsied لكل إجراء (ما يصل إلى أربعة لكل طبق خزعة)، تغيير ماصة خزعة مع واحد جديد لمنع التلوث المتبادل بين الأجنة.
  16. كرر الخطوات 4.1-4.13.
  17. نقل طبق خزعة مرة أخرى إلى غطاء محرك السيارة تدفق laminar.
  18. وضع علامة على طبق ثقافة ما بعد الخزعة مع هوية الزوجين، وكل قطرة مع الجنين وهوية الدورة.
  19. في حضور شاهد، شطف الكيسة الكيسية في وسط التلقيح الاصطناعي نظيفة، وأخيرا نقله إلى قطرة المقابلة لها من طبق ما بعد خزعة.
  20. نقل طبق ما بعد خزعة إلى الحاضنة في جو تسيطرعليها (37 درجة مئوية، 6٪ CO 2، 5٪ O2)حتى التزجيج. من المستحسن إجراء التزجيج في غضون 30 دقيقة من إجراء خزعة، لمنع إعادة توسيع الكيسة الكيسية.

5. الأنابيب

ملاحظة: يجب أن يتم الإجراء بأكمله في حضور شاهد وداخل غطاء تدفق laminar في درجة حرارة الغرفة. أثناء الإجراء، والحفاظ على أنابيب PCR في رف أنبوب الباردة على الجليد (الشكلالتكميلي1).

  1. تسمية أنابيب PCR مع علامة غير سامة دائمة.
    ملاحظة: وينبغي أن يتم وضع العلامات على النحو الذي يطلبه المختبر الوراثي. عموما، اسم المريض ولقبه (الأحرف الأولى)، هوية الزوجين، الجنين ومعرف الدورة (على سبيل المثال: 12345 دينار أردني 1.2 للجنين N.1 من الدورة الثانية التي تنتمي إلى جين دو الذي هو هوية الزوجين هو 12345). وينبغي الإبلاغ عن هوية الجنين أيضا في رسائل على جسم الأنبوب.
  2. وضع علامة على غطاء طبق ثقافة 60 مم × 15 مم (طبق أنابيب) مع هويات الأجنة biopsied (الشكلالتكميلي1) وإعداد قطرتين 10 ميكرولتر من محلول غسل خزعة (جدولالمواد)فيه.
  3. قم بتعبئة ماصة تجريد 140 م (الشكلالتكميلي1) مع بعض محلول غسيل خزعة من القطرة الثانية من طبق الأنابيب.
  4. ضع طبق الخزعة تحت المجهر المجسم لتصور جزء (أجزاء) TE بسهولة.
  5. الإفراج بلطف بعض محلول غسل خزعة على جزء TE. ثم، تحميلها في ماصة تجريد.
  6. حرّك جزء TE إلى القطرة الثانية من محلول غسيل الخزعة في طبق الأنابيب واشطفه بعناية 2-3 مرات.
  7. نقل جزء TE إلى الجزء السفلي من أنبوب PCR (وصفت سابقا بعد ذلك) مع حل التحميل، مع إيلاء الاهتمام لتجنب لمس جدرانها مع غيض من ماصة تجريد.
  8. كرر الإجراء من الخطوة 5.3 إلى الخطوة 5.7 لكل جزء TE، مع إيلاء الاهتمام لاستخدام الشعرية الجديدة لكل جزء TE.
  9. في نهاية إجراء الأنابيب، ووضع جميع أنابيب PCR في جهاز طرد مركزي صغير، وتدور لهم لبضع ثوان.
  10. تخزين العينات في -20 درجة مئوية حتى شحنها إلى المختبر الوراثي ة المرجعية للاختبار.

6. الكيسة الكيسية التزجيج

  1. انهار الكيسات الكيسية في فيتريفي في غضون 30 دقيقة من خزعة TE لمنع إعادة توسيعها.
  2. تسمية لوحة التزجيج مع تفاصيل المرأة وبطاقات الأيّيل من الكيسات الكيسية التي يجب أن تكون زجاجية.
  3. تسمية دعم (دعم) التزجيج مع اسم المرأة ولقبها، وهوية الزوجين، وهوية الجنين التي سيتم تحميلها عليها، وكذلك تاريخ الإجراء. وتستخدم التسميات الجليدية الخاصة التي تحافظ على سلامتها حتى في درجة حرارة منخفضة جدا (-196 درجة مئوية).
  4. في درجة حرارة الغرفة، الاستغناء عن 0.3 ملمن محلول التوازن (ES) (جدول المواد) لكل كيسة الكيسة التي سيتم مزجها.
  5. في حضور شاهد، نقل الكيسة الكيسية في ES باستخدام ماصة تجريد 300 م.
  6. اترك الكيسة الكيسية في ES لمدة 13-15 دقيقة. وبعد انكماش أولي في الحجم، سيلاحظ إعادة توسع تدريجية.
  7. ملء رف التبريد الصغيرة معالنيتروجين السائل (LN 2) ووضعها تحت غطاء محرك السيارة تدفق laminar.
  8. الاستغناء عن 300 ميكرولتر منمحلول التزجيج (VS) (جدول المواد) في البئر الثاني. بعد إعادة توسيع الكيسة الكيسية الكاملة، قم بنقله في محلول VS لمدة دقيقة واحدة واشطفه لتخفيف ES.
  9. في حضور شاهد، تحميل الكيسة الكيسية على دعم التزجيج ورعاية إزالة الزائدة من VS. فيلم دقيق من الحل يجب أن تحيط الكيسة الكيسية.
  10. يغرق دعم التزجيج في LN2 ونقله بنشاط من أجل الحد من خطر تشكيل فقاعة قريبة من العينة.
  11. ضع الغطاء الواقي مع الحفاظ على دعم التزجيج المغمور في LN2.
  12. في حضور شاهد، نقل دعم التزجيج في خزان LN2 على المدى الطويل.

7. انكماش اصطناعي من الكيسات الكيسية غير biopsied

  1. إذا لم يتم إجراء خزعة TE، انهيار مصطنع الكيساتالكيسية مباشرة قبل التزجيج (الشكل 4).
    1. نقل طبق الثقافة من الحاضنة إلى المجهر المقلوب والتركيز على الجنين المحدد.
    2. قم بالتبديل إلى هدف الليزر (نبض محدد مسبقًا: 0.3 مللي ثانية، 6.5 ميكرومتر)، استهداف المنطقة pellucida على الجانب الآخر من ICM، ثم توجيه نبضات الليزر 1-2 إلى التقاطعات بين خلايا TE على مسافة آمنة من ICM. يجب أن تنهار الكيسات الكيسية في أقل من 5 دقائق.
  2. المضي قدما في التزجيج من الكيسة الكيسية المنهارة كما هو موضح في القسم 6.

8. القابلة للتحويل الكيسة النارية الاحترار

  1. في يوم ET، قم بإعداد لوحة ET 4-well عن طريق وضع 600 ميكرولتر من متوسط ثقافة التلقيح الاصطناعي قبل الاعتدال لكل بئر. حضانة في 37 درجة مئوية في الغلاف الجويالخاضعة للرقابة (5٪ س 2، 6٪ CO2)،في حين إجراء ارتفاع درجة حرارة الكيسة الكيسية.
  2. تسمية طبق الاحترار مع اسم المرأة واللقب، هوية الزوجين، هوية الجنين التي سيتم تسخينها في ذلك.
  3. الاستغناء عن 1 مل من محلول الذوبان (TS) (جدول المواد) في طبق التلقيح الاصطناعي بئر واحد (الشكلالتكميلي 1)وتسخينه إلى 37 درجة مئوية في ترموستات لمدة ساعة واحدة على الأقل قبل بدء الإجراء.
  4. ملء دعم التبريد الصغيرة مع LN2 ووضعها في غطاء محرك السيارة تدفق laminar على مقربة من منطقة العمل.
  5. قبل بدء الإجراء، تحقق من معلومات الكيسة الكيسية التي تم الإبلاغ عنها على دعم التزجيج. يجب أن تتطابق جميع البطاقات المعتمة مع التقرير الوراثي ويجب اختيار الكيسة الكيسية للتدفئة من بين البطاقات القابلة للتحويل. يجب على الشاهد أثناء الإجراء.
  6. خذ طبق واحد جيدا يحتوي على TS الدافئة من الحرارة ووضعها على مرحلة ساخنة تحت المجهر المجسم.
  7. اسحب الغطاء الواقي داخل LN2 باستخدام ملقط.
  8. يغرق بسرعة غيض من دعم التزجيج في 37 درجة مئوية TS.
  9. تحت المراقبة المجهرية، نقل بلطف دعم التزجيج حتى يتم تحرير الكيسة الكيسية من طرف.
  10. ترك الكيسة الكيسية لما مجموعه 1 دقيقة في TS، مع إيلاء الاهتمام للحفاظ عليه في الجزء السفلي من TS.
  11. في درجة حرارة الغرفة الاستغناء 200 درجة مئويةمن محلول التخفيف (DS) (جدول المواد) على البئر الأول من لوحة التزجيج.
  12. نقل الكيسة الكيسية إلى DS ووضعها في الجزء السفلي من البئر في حين الإفراج عن بعض TS على الجزء العلوي منه لخلق نوع من التدرج. اتركها لمدة 3 دقائق.
  13. الاستغناء عن 200 درجة مئوية من محلول الغسيل (WS) في بئرين مختلفين (WS1 و WS2).
  14. نقل الكيسة الكيسية إلى WS1 ووضعها في الجزء السفلي من البئر في حين الإفراج عن بعض DS المتوسطة على الجزء العلوي منه. ثم نقل الكيسة الكيسية إلى WS2 وتركها دون عائق لمدة دقيقة واحدة.
  15. تسمية لوحة ET ما بعد الاحترار مع اسم المرأة واللقب، هوية الزوجين، هوية الجنين الذي سيتم المستزرع في ذلك.
  16. في حضور شاهد، نقل الكيسة الكيسية الدافئة إلى وسط الثقافة قبل الاعتدال في لوحة ET ما بعد الاحترار.
  17. شطف الكيسة الكيسية في البئر الأول من لوحة ET ووضعها في البئر الثاني.
  18. نقل طبق الثقافة ما بعد الاحترار إلى الحاضنة في جو تسيطرعليها (37 درجة مئوية، 6٪ CO 2، 5٪ O2)وثقافة الكيسة الكيسية لمدة 1.5 ساعة على الأقل قبل التحقق من بقائها وإعادة التوسع.
    ملاحظة: ويبين الشكل 5 أمثلة على الكيسات الكيسية الكيسية التي تم المنحطّمة والمنحلة بالتبريد ولكنها لم تُوسع من حيث التبريد والبقاء على قيد الحياة وتوسعت بالكامل.

9. نقل الأجنة

  1. لأداء ET، ضع الطبق على مرحلة ساخنة من غطاء محرك السيارة تدفق اللامينار، وبالتالي فإن الجنين مرئية تحت المجهر في التكبير منخفضة.
  2. خذ حوالي 0.4 مل من متوسط ثقافة التلقيح الاصطناعي. تأمين تلميح الحقنة بحزم في الطرف المتلقي للقسطرة الداخلية ومن ثم الإفراج عن المتوسطة تصل إلى 0.1 مل.
  3. يستنشق وسط الثقافة حتى مراقبة الأجنة التي تدخل القسطرة (الحد الأدنى من وسائل الإعلام: 10-15 درجة مئوية).
  4. ضع القسطرة في العلبة البلاستيكية واذهب إلى غرفة العمليات وضع القسطرة الداخلية في الدليل الخارجي.
  5. بمجرد الوصول إلى الرحم، دفع الغطاس حقنة لإطلاق سراح الجنين (الأجنة). الافراج ببطء شديد المتوسطة حتى الغطاس هو قراءة 0.1 مل.
  6. خذ القسطرة إلى المختبر وتحقق تحت المجهر من أن الجنين قد تم نقله.

النتائج

يمثل الشكل 6 مخططًا لجميع نتائج إجراء الخزعة الذي يمكن اعتماده لتوحيد البروتوكول ورصد أداء كل مشغل. والنتيجة الإجرائية الرئيسية هي توقيت إكمال الخزعة/الخزعات؛ النتيجة التقنية الرئيسية هي نوعية المؤامرة التي تنتج بعد الاختبارات الجينية التي قد تؤدي إما ?...

Discussion

فقط علماء الأجنة المهرة ذوي الخبرة الذين أكملوا فترة تدريبهم يجب أن يقوموا بكل من خزعة TE واستئصال الكيسة الكيسية. وعلاوة على ذلك، يطلب من الشاهد رصد الإجراءات وضمان تتبع فعال خلال i) حركات الكيسة الكيسية الخزعية من طبق الخزعة (الشكلالتكميلي1) إلى طبق ما بعد الخزعة (الشكلالتكمي...

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

وقامت شركة AG وRM بجمع البيانات وصياغة المخطوطة. وقامت العاصمة بتحليل البيانات، وصياغة النتائج التمثيلية، وإجراء الإحصاءات، وتنقيح المخطوطة. وقدمت جامعة فمو وLR مناقشة نقدية للنتائج وللمخطوطة بأكملها.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Equipment
Cold tube rackBiocisionXTPCR96
Electronic pipette controllerFisher Scientific710931
Flexipet adjustable handle setCookG18674Stripper holder
Gilson PipetmanGilson66003p20
IVF Electronic Witness SystemCooperSurgical Fertility & Genomic SolutionsRI Witness ART Management System
Inverted microscopeNikonEclipse TE2000-U
Laminar Flow HoodIVF TECHGrade A air flow
Laser objectiveRISaturn 5
MicroinjectorsNikon NarishigeNT-88-V3
Mini centrifuge for PCR tubesEppendorfCSLQSPINfor 0.2ml PCR tubes
StereomicroscopeLeicaLeica M80
ThermostatPanasonicMCO-5AC-PE
Tri-gas incubatorPanasonicMCO-5M-PE02/CO2
Consumables
Biopsy pipetteRI7-71-30FB3572030µm ID, flat 35°C
CryolockCryolockCL-R-CT
CSCM completeIrvine Scientific90165IVF culture medium supplemented with HSA
Embryo Transfer CatheterCookG17934
Flexipet pipetteCookG26712140µm stripping pipette tip
Flexipet pipetteCookG46020300µm stripping pipette tips
Holding pipetteRI7-71-IH35/2030µm ID, flat 35°C
Human Serum AlbuminIrvine Scientific9988
IVF One well dishFalcon353653
Mineral Oil for embryo cultureIrvine Scientific9305
Modified HTF MediumIrvine Scientific90126Hepes-Buffered medium
Nuclon Delta SurfaceThermofisher scientific176740IVF dish 4-well plate with sliding lid
Primaria Cell culture dishCorning35380260x15mm
ReproplateKitazato83016
Serological pipetteFalcon35755110ml
Sterile disposable Gilson tipsEppendorf0030 075.021200µl
Tubing KitProvided by the genetic labPCR tubes (0.2mL), loading solution, biopsy washing solution
Vitrification mediaKitazatoVT801Equilibration and vitrification solutions
Warming mediaKitazatoVT802Thawing and dilution solutions

References

  1. Glujovsky, D., Farquhar, C., Quinteiro Retamar, A. M., Alvarez Sedo, C. R., Blake, D. Cleavage stage versus blastocyst stage embryo transfer in assisted reproductive technology. Cochrane Database of Systematic Reviews. (6), CD002118 (2016).
  2. Dahdouh, E. M., Balayla, J., Garcia-Velasco, J. A. Comprehensive chromosome screening improves embryo selection: a meta-analysis. Fertility and Sterility. 104 (6), 1503-1512 (2015).
  3. Cimadomo, D., et al. The Impact of Biopsy on Human Embryo Developmental Potential during Preimplantation Genetic Diagnosis. Biomedical Research International. 2016, 7193075 (2016).
  4. Capalbo, A., et al. Correlation between standard blastocyst morphology, euploidy and implantation: an observational study in two centers involving 956 screened blastocysts. Human Reproduction. 29 (6), 1173-1181 (2014).
  5. Capalbo, A., et al. Implementing PGD/PGD-A in IVF clinics: considerations for the best laboratory approach and management. Journal of Assisted Reproduction and Genetics. , (2016).
  6. McArthur, S. J., Leigh, D., Marshall, J. T., de Boer, K. A., Jansen, R. P. Pregnancies and live births after trophectoderm biopsy and preimplantation genetic testing of human blastocysts. Fertility and Sterility. 84 (6), 1628-1636 (2005).
  7. Kokkali, G., et al. Birth of a healthy infant following trophectoderm biopsy from blastocysts for PGD of beta-thalassaemia major. Human Reproduction. 20 (7), 1855-1859 (2005).
  8. Rienzi, L., Ubaldi, F., Anniballo, R., Cerulo, G., Greco, E. Preincubation of human oocytes may improve fertilization and embryo quality after intracytoplasmic sperm injection. Human Reproduction. 13 (4), 1014-1019 (1998).
  9. Wale, P. L., Gardner, D. K. The effects of chemical and physical factors on mammalian embryo culture and their importance for the practice of assisted human reproduction. Human Reproduction Update. 22 (1), 2-22 (2016).
  10. Rienzi, L., et al. Oocyte, embryo and blastocyst cryopreservation in ART: systematic review and meta-analysis comparing slow-freezing versus vitrification to produce evidence for the development of global guidance. Human Reproduction Update. 23 (2), 139-155 (2017).
  11. Cimadomo, D., et al. Associations of blastocyst features, trophectoderm biopsy and other laboratory practice with post-warming behavior and implantation. Human Reproduction. , (2018).
  12. Evans, J., et al. Fresh versus frozen embryo transfer: backing clinical decisions with scientific and clinical evidence. Human Reproduction Update. 20 (6), 808-821 (2014).
  13. Capalbo, A., et al. Consistent and reproducible outcomes of blastocyst biopsy and aneuploidy screening across different biopsy practitioners: a multicentre study involving 2586 embryo biopsies. Human Reproduction. 31 (1), 199-208 (2016).
  14. Cimadomo, D., et al. Failure mode and effects analysis of witnessing protocols for ensuring traceability during PGD/PGS cycles. Reproductive Biomedicine Online. 33 (3), 360-369 (2016).
  15. Gardner, D. K., Schoolcraft, B., Jansen, R., Mortimer, D. . Towards Reproductive Certainty: Infertility and Genetics Beyond 1999. , 377-388 (1999).
  16. Cimadomo, D., et al. Inconclusive chromosomal assessment after blastocyst biopsy: prevalence, causative factors and outcomes after re-biopsy and re-vitrification. A multicenter experience. Human Reproduction. , (2018).
  17. de Boer, K. A., Catt, J. W., Jansen, R. P., Leigh, D., McArthur, S. Moving to blastocyst biopsy for preimplantation genetic diagnosis and single embryo transfer at Sydney IVF. Fertility and Sterility. 82 (2), 295-298 (2004).
  18. Capalbo, A., Rienzi, L. Mosaicism between trophectoderm and inner cell mass. Fertility and Sterility. 107 (5), 1098-1106 (2017).
  19. McCoy, R. C., et al. Evidence of Selection against Complex Mitotic-Origin Aneuploidy during Preimplantation Development. PLoS Genetics. 11 (10), e1005601 (2015).
  20. Scott, R. T., Upham, K. M., Forman, E. J., Zhao, T., Treff, N. R. Cleavage-stage biopsy significantly impairs human embryonic implantation potential while blastocyst biopsy does not: a randomized and paired clinical trial. Fertility and Sterility. 100 (3), 624-630 (2013).
  21. Lee, H., et al. Live births after transfer of rebiopsy and revitrification of blastocyst that had “no diagnosis” following trophectoderm biopsy. Fertility and Sterility. 106 (3), e164 (2016).
  22. Capalbo, A., et al. Diagnostic efficacy of blastocoel fluid and spent media as sources of DNA for preimplantation genetic testing in standard clinical conditions. Fertility and Sterility. 110 (5), 870-879 (2018).
  23. Hammond, E. R., Shelling, A. N., Cree, L. M. Nuclear and mitochondrial DNA in blastocoele fluid and embryo culture medium: evidence and potential clinical use. Human Reproduction. 31 (8), 1653-1661 (2016).
  24. Vera-Rodriguez, M., et al. Origin and composition of cell-free DNA in spent medium from human embryo culture during preimplantation development. Human Reproduction. 33 (4), 745-756 (2018).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

149 PGT KPI

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved