Biopsie et vitrification humaines de Blastocyst

Résumé

La biopsie et la vitrification de Blastocyst sont nécessaires pour mener efficacement le test génétique préimplantatoire. Une approche impliquant l'ouverture séquentielle de la pellucida de zona et la récupération de 7-8 cellules de trophectoderm dans le jour 5-7 post-insémination limite le nombre de manipulations exigées et l'exposition de l'embryon aux conditions environnementales sous-optimales.

Résumé

La biopsie de Blastocyst est effectuée pour obtenir un diagnostic génétique fiable pendant des cycles de FIV avec l'essai génétique préimplantatoire. Ensuite, le flux de travail idéal implique un protocole de vitrification sûr et efficace, en raison du délai d'exécution des techniques de diagnostic et de transférer l'embryon sélectionné sur un endomètre physiologique dans un cycle naturel suivant. Une approche de biopsie englobant l'ouverture séquentielle de la zona pellucida et la récupération de 5-10 cellules de trophectoderm (idéalement 7-8) limite le nombre de manipulations exigées et l'exposition de l'embryon aux conditions environnementales sous-optimales. Après une formation adéquate, la technique a été reproductible entre différents opérateurs en termes de synchronisation de la biopsie (8 min, allant de 3 à 22 min en fonction du nombre d'embryons à la biopsie par plat), diagnostics concluants obtenus (97,5%) et les taux de natalité vivante après le transfert de blastocyste euploïde vitrifié (40 %). Le taux de survie après biopsie, vitrification et réchauffement était aussi élevé que 99,8%. Le taux de réexpansion à 1,5 h du réchauffement était aussi élevé que 97%, en grande partie dépendant du moment entre la biopsie et la vitrification (idéalement 30 min), la qualité morphologique blastocyste et le jour de la biopsie. En général, il est préférable de vitrifier un blastocyste effondré; par conséquent, dans les cycles non-PGT, le rétrécissement artificiel laser-assisté pourrait être exécuté pour induire l'effondrement d'embryon avant la cryoconservation. La perspective future la plus prometteuse est l'analyse non invasive des médias de culture de FIV après la culture blastocyste comme source putative de l'ADN embryonnaire. Toutefois, cette avant-garde potentielle est toujours à l'étude et un protocole fiable doit encore être défini et validé.

Introduction

L'objectif principal de l'embryologie humaine moderne est de maximiser le nombre de naissances vivantes par cycle stimulé et de réduire les coûts, le temps et les efforts pour atteindre une grossesse. Pour atteindre cet objectif, des approches validées pour la sélection des embryons devraient être utilisées pour identifier les embryons compétents en matière de reproduction au sein d'une cohorte obtenue au cours d'un cycle de FIV. Selon les dernières preuves, la culture blastocyste¹ combinée à des tests chromosomiques complets et au transfert d'embryons euploïdes vitrifiés (ET) est le cadre le plus efficace pour augmenter l'efficacité de la FIV². De toute évidence, le dépistage de l'anéuploïde nécessite un spécimen embryonnaire, qui est actuellement principalement représenté à partir de quelques cellules extraites du trophectoderm (TE), c'est-à-dire la section du blastocyste qui donne naissance aux annexes embryonnaires (par exemple, le placenta) pendant la grossesse . Au-delà de l'analyse karyotype, des mutations génétiques uniques pourraient également être évaluées à partir d'une biopsie TE dans le cadre d'une stratégie clinique connue sous le nom de test génétique préimplantatoire (PGT; -A pour les anéuploidies, -SR pour les réarrangements chromosomiques structurels, -M pour les maladies monogéniques). D'autres méthodes de biopsie d'ovocyte/embryon ont été théorisées et adoptées cliniquement au cours des dernières décennies, à savoir la biopsie des corps polaires et la biopsie blastomere. Cependant, leur utilisation est réduite de nos jours puisque leurs inconvénients procéduraux (p. ex., charge de travail et risque accrus d'impact sur la reproduction) et leurs limitations diagnostiques (p. ex., problèmes d'analyse cellulaire unique) entravent implicitement un équilibre suffisant entre les coûts, les risques et les avantages (pour un examen voir³).

Dans cet article, l'un des protocoles principaux pour la biopsie de TE est soigneusement décrit avec les procédures suivantes de vitrification, de réchauffement et de transfert exigées. Le flux de travail décrit ici est idéal pour une unité DE TGP occupée.

Comme déjà décrit précédemment par notre groupe^4,5, la procédure implique l'ouverture séquentielle de la pellucida zona de blastocystes entièrement élargis et l'élimination de quelques cellules TE (en moyenne 7-8). Comparée à la méthode de biopsie blastocyste à base d'éclosion laser-assistée³6, cette procédure pourrait faciliter le programme quotidien d'une unité de FIV où les procédures délicates, telles que la biopsie blastocyste et la vitrification, doivent être exécutées en temps opportun. Dès que le blastocyste atteint sa pleine expansion, la biopsie peut être effectuée en sélectionnant les cellules TE à enlever, empêchant ainsi le risque d'hernie de la masse cellulaire interne (ICM), ce qui rendrait autrement la procédure difficile. Dans la littérature, un troisième protocole de biopsie blastocyste a également été décrit, qui implique l'éclosion au laser assistée étant effectuée une fois que l'embryon a déjà atteint le stade blastocyste, quelques heures avant la procédure^5,7. Cependant, cette approche prend plus de temps et convient principalement aux unités de FIV qui mettent en œuvre la biopsie TE entre les mains d'opérateurs peu expérimentés et en raison d'une charge de travail quotidienne modérée-faible.

L'injection de spermatozoïdes intracytoplasmatic (ICSI)⁸ devrait être une technique consolidée si l'objectif de mener des analyses génétiques dans la FIV. De même, un système de culture approprié pour récolter en toute sécurité les embryons au stade blastocyste est crucial pour la mise en œuvre de la stratégie de biopsie TE. Un nombre suffisant d'incubateurs, ainsi que l'utilisation de faible tension d'oxygène sont des conditions préalables clés à cette fin, de ne pas compromettre le taux de blastocyste⁹. En même temps, un programme de cryoconservation efficace est nécessaire pour gérer en toute sécurité un cycle pgT. Au cours de la dernière décennie, la mise en œuvre de la vitrification a augmenté les taux de cryo-survie des embryons, même jusqu'à 99 %^10,11. Cela a fourni suffisamment de temps pour effectuer des tests génétiques et reporter le transfert d'embryons au cycle menstruel suivant, sur un endomètre non stimulé et probablement plus réceptif¹².

La biopsie TE et la vitrification exigent des tâches exigeantes et leur efficacité peut varier d'un opérateur inexpérimenté à l'autre. Une période de formation spécifique est donc préconisée avant de permettre à chaque opérateur d'effectuer ces interventions cliniquement; en outre, le maintien des compétences des opérateurs devrait être évalué périodiquement en surveillant les indicateurs de performance clés (KPI) pour les procédures de cryoconservation et de biopsie. Chaque clinique de FIV doit définir les indicateurs de la santé interne à cette fin, qui doivent se rapprocher de ceux publiés par les consortiums internationaux et/ou des résultats publiés par les laboratoires de référence.

La biopsie TE, le réchauffement de la vitrification et les procédures de témoignage sont des techniques validées dans notre unité, qui ont été normalisées dans tous les opérateurs impliqués comme indiqué dans trois publications précédentes^11,13,14 .

Protocole

Le protocole pour la biopsie humaine de blastocyste, ici décrit, suit les lignes directrices du comité d'éthique de recherche humaine de G.EN.E.R.A.

REMARQUE: Consultez le Tableau des matériaux pour les matériaux requis. D'autres matériaux requis comprennent des chaussures et des tenues de laboratoire, un masque chirurgical, un couvre-cheveux, des gants chirurgicaux, un marqueur permanent non toxique, des forceps et du désinfectant. L'utilisation d'une blouse chirurgicale, de gants chirurgicaux jetables, d'un masque facial, d'une couverture capillaire est obligatoire pour prévenir les risques de contamination. Toutes les zones de travail, ainsi que l'équipement impliqué dans le processus, doivent être nettoyés à fond avec du désinfectant de laboratoire (p. ex., Oosafe) avant de commencer toute procédure. Tous les consommables et les supports utilisés doivent être stériles et emballés individuellement ou aliquoted. Il est suggéré d'utiliser un poste de travail dédié à la biopsie et à la tuyauterie et de limiter l'accès de la zone uniquement aux opérateurs impliqués dans la procédure (embryologiste et témoin).

1. Préparation le jour avant la procédure de biopsie

1. Préparer le plat de culture post biopsie.
   1. Placer 6 gouttes de 20 l de culture FIV (Tableau des matériaux) dans un plat de culture FIV et la reposition de 6 ml d'huile minérale préchauffée pour la culture embryonnaire (Tableau des matériaux).
   2. Ajouter un autre 10 'L de milieu de culture DE FIV à chaque goutte. Incuber toute la nuit à 37 oC dans une atmosphère contrôlée (5 % O₂, 6 % CO₂).
2. Préparer un plat de FIV 4-bien assiette pour rincer le blastocyste après la biopsie.
   1. Placez 600 ll de milieu de culture de FIV dans les deux premiers puits et regroupez-vous de 300 l d'huile minérale pré-chauffée pour la culture embryonnaire.
   2. Incuber toute la nuit à 37 oC dans une atmosphère contrôlée (5 % O₂, 6 % CO₂).
3. Distribuer 1,5 L de solution de chargement (Table of Materials) dans chaque tube PCR à utiliser pour les tubes des cellules TE, le faire tourner et le garder à 4 oC.

2. Préparation le jour de la procédure de biopsie

1. Préparer le plat de biopsie.
   1. Placer 3 gouttes de 10 l hePES-tamponné milieu (complété avec l'albumine de sérum humain) (Table of Materials) dans une rangée dans un plat de culture FIV.
   2. Répétez l'étape 1.1.1 selon le nombre de blastocystes disponibles (jusqu'à 4 blastocystes par plat) et recassez avec 6 ml d'huile minérale pré-chauffée pour la culture embryonnaire.
   3. Incuber le plat à 37 oC pendant au moins 1 h avant d'effectuer la biopsie.

3. Sélection et classement Blastocyst

1. Grade le blastocyste en fonction de son expansion et l'apparence morphologique de ICM et TE (Figure 1).
   REMARQUE : Les critères de classement ont été adaptés de Gardner et Schoolcraft¹⁵ et précédemment décrits par Capalbo et coll. et Cimadomo et al.^4,11.
   1. Définissez la taille et la teneur d'expansion comme : A pour un blastocyste entièrement éclos, B pour un blastocyste d'éclosion, C pour un blastocyste entièrement élargi, et D pour un blastocyste non étendu (ces embryons sont biopsiés seulement s'ils ne se sont pas étendus plus loin jusqu'au jour 7).
   2. Définir icM grade: 1 pour ICM notable avec plusieurs cellules strictement emballées; 2 pour discernable avec plusieurs cellules, mais grossièrement emballées; 3 pour difficile à distinguer avec très peu de cellules de mauvaise qualité.
   3. Définir la catégorie TE comme suit : 1 pour l'épithélium bien organisé avec plusieurs cellules ; 2 pour l'épithélium lâche avec peu de cellules ; 3 pour peu et/ou de grandes cellules de faible qualité.

4. Biopsie de trophectoderm

1. Effectuez une biopsie TE sur tous les blastocystes viables entièrement élargis (de préférence de catégorie C pour la taille et l'expansion).
2. Définir les pipettes de fixation et de biopsie pour chaque procédure de biopsie. Les recommandations pour la pipette de biopsie sont les suivantes : 30 m de diamètre interne, angle de courbure de 35 degrés, pointe de distance de 0,75 mm à plier.
3. Étiquetez le plat de biopsie avec les détails du patient (nom et prénom de la femme, date de naissance et iD) et faites ensuite le numéro de chaque goutte avec des iD d'embryon et de cycle. Utilisez un marqueur permanent non toxique.
4. Transférer le blastocyste à l'arme de 300 m pour décaper la première goutte du plat de biopsie et le rincer afin d'éliminer l'excès de milieu de culture. Déplacez ensuite le blastocyste dans la deuxième goutte du plat de biopsie.
5. Déplacer le plat au microscope inversé et amorcer la pipette de biopsie en apitant un milieu à partir de la troisième goutte du plat de biopsie.
6. À 20x grossissement, orienter le blastocyste pour avoir une vue claire de l'ICM. Lorsqu'il est visualisé à 7 heures (en face de la zone qui sera ciblée pour enlever les cellules TE), fixez l'embryon sur la pipette de retenue (figure 2a).
7. Concentrez-vous sur la zona pellucida et s'assurer que les pipettes et le blastocyste sont sur le même plan focal.
8. Passez à l'objectif laser (temps d'impulsion 0,3 ms, 6,5 m) et placez le pointeur laser sur la zona pellucida du côté opposé de l'ICM. Percer la zona pellucida à travers 2 3 impulsions laser (Figure 2b).
9. Appuyez doucement sur la pipette de biopsie contre la zona pellucida et soufflez un peu de milieu à travers la brèche pour détacher les cellules TE de sa surface interne et accélérer l'effondrement du blastocyste (Figure 2c).
10. Une fois que le TE est détaché (Figure 2d), entrez par le trou (si nécessaire, le rendre plus large avec une dernière impulsion laser) et aspirez peu de cellules TE (idéalement 7-8^13,16) dans la pipette de biopsie avec une aspiration douce (Figure 2e).
11. Déplacez légèrement la pipette de biopsie vers l'arrière tout en appliquant une aspiration modérée pour étirer les cellules cibles (Figure 2f).
12. Dirigez le laser vers la partie la plus mince des cellules aspirées et tirez des impulsions laser de 2 à 5 aux jonctions entre les cellules pour séparer les cellules cibles du corps de l'embryon (Figure 2g). Le moment des impulsions laser et le nombre d'impulsions peuvent être ajustés en fonction de la qualité du blastocyste; cependant, essayez de les minimiser pour éviter la lyse cellulaire.
13. Après la séparation du fragment te du blastocyste (Figure 2h), relâchez-le dans la même goutte de biopsie loin du blastocyste. Ceci est nécessaire pour éviter qu'ils ne soient à nouveau aspirés dans la pipette de biopsie (figure 2i).
14. Relâchez le blastocyste de la pipette de retenue et soulevez rapidement les deux pipettes pour empêcher le fragment de s'y coller.
15. Prenez une photo du fragment biopsié à des fins de contrôle de la qualité (figure 3).
    REMARQUE : Si plus d'un seul blastocyste doit être biopsié par procédure (jusqu'à quatre par plat de biopsie), changez la pipette de biopsie avec une nouvelle pour empêcher la contamination croisée entre les embryons.
16. Répétez les étapes 4.1-4.13.
17. Déplacez le plat de biopsie vers le capuchon à débit laminaire.
18. Étiquetez le plat de culture post-biopsie avec l'ID du couple, et chaque goutte avec l'embryon et l'ID du cycle.
19. En présence d'un témoin, rincez le blastocyste dans un milieu de FIV propre, et enfin déplacez-le à sa goutte correspondante du plat post-biopsie.
20. Déplacer le plat post-biopsie à l'incubateur dans une atmosphère contrôlée (37 oC, 6 % CO₂, 5 % O₂) jusqu'à la vitrification. Il est conseillé d'effectuer la vitrification dans les 30 minutes de la procédure de biopsie, pour empêcher la ré-expansion blastocyste.

5. Tubing

REMARQUE: L'ensemble de la procédure doit être effectué en présence d'un témoin et à l'intérieur du capot à débit laminaire à température ambiante. Pendant la procédure, garder les tubes PCR dans un support à tube froid sur la glace (Figure supplémentaire 1).

1. Étiqueter les tubes PCR avec un marqueur permanent non toxique.
   REMARQUE: L'étiquetage doit être effectué à la demande du laboratoire génétique. En général, le nom et le nom de famille du patient (initiales), l'iD de couple, l'embryon et l'iD de cycle (par exemple : JD 12345 1.2 pour l'embryon N.1 du 2ème cycle appartenant à Jane Doe dont l'ID de couple est 12345). L'ID d'embryon devrait également être rapporté dans les lettres sur le corps du tube.
2. Étiquetez le couvercle d'un plat de culture de 60 mm x 15 mm (plat de tube) avec les iD des embryons biopsiés (figuresupplémentaire 1) et préparez-y deux gouttes de 10 l de solution de lavage de biopsie (Tableaudes matériaux).
3. Premier la pipette de décapage de 140 m (figuresupplémentaire 1) avec une solution de lavage de biopsie de la deuxième goutte du plat de tuyauterie.
4. Placez le plat de biopsie sous le stéréomicroscope pour visualiser facilement le fragment TE(s).
5. Libérez doucement une solution de lavage de biopsie sur le fragment te ; puis, chargez-le dans la pipette de décapage.
6. Déplacez le fragment te à la deuxième goutte de la solution de lavage de biopsie dans le plat de tuyauterie et rincez-le soigneusement 2/3 fois.
7. Transférer le fragment TE au fond du tube PCR (précédemment étiqueté après lui) avec la solution de chargement, en prêtant attention pour éviter de toucher ses parois avec la pointe de la pipette de décapage.
8. Répétez la procédure de l'étape 5.3 à l'étape 5.7 pour chaque fragment TE, en prêtant attention à l'utilisation d'un nouveau capillaire pour chaque fragment TE.
9. À la fin de la procédure de tuyauterie, mettre tous les tubes PCR dans une mini centrifugeuse, et les faire tourner pendant quelques secondes.
10. Entreposer les échantillons à -20 oC jusqu'à ce qu'ils les expédient au laboratoire génétique référé pour les tester.

6. Vitrification blastocyste

1. Vitrify s'est effondré blastocystes dans les 30 min de la biopsie TE pour empêcher leur ré-expansion.
2. Étiquetez la plaque de vitrification avec les détails de la femme et les iD des blastocystes qui doivent être vitrifiés.
3. Étiquetez le support de vitrification (s) avec le nom et le nom de famille de la femme, l'ID de couple, l'iD de l'embryon qui sera chargé sur elle, aussi bien que la date de la procédure. Des cryolabels spéciaux sont utilisés qui préservent leur intégrité même à très basse température (-196 oC).
4. À température ambiante, distribuer 0,3 ml de solution d'équilibre (ES) (tableaudes matériaux)pour chaque blastocyste qui sera vitrifié.
5. En présence d'un témoin, déplacez le blastocyste en ES à l'aide de la pipette de décapage de 300 m.
6. Laisser le blastocyste dans l'ES pendant 13 à 15 min. Après un premier rétrécissement du volume, une réexpansion graduelle sera observée.
7. Remplissez une petite grille de refroidissement d'azote liquide (LN₂) et placez-la sous le capot d'écoulement laminaire.
8. Dispense 300 L de solution de vitrification (VS) (Tableau des Matériaux) dans le deuxième puits. Après la réexpansion complète du blastocyste, transférez-le dans la solution VS pendant 1 min et rincez-le pour diluer l'ES.
9. En présence d'un témoin, chargez le blastocyste sur le support de vitrification et prenez soin d'enlever l'excès de VS. Un film subtil de solution devrait entourer le blastocyste.
10. Plongez le support de vitrification dans Le LN₂ et déplacez-le énergiquement afin de réduire le risque de formation de bulles près du spécimen.
11. Placez le bouchon de protection tout en gardant le support de vitrification immergé dans le LN_2.
12. En présence d'un témoin, déplacez le support de vitrification dans un réservoir de stockage LN₂ à long terme.

7. Rétrécissement artificiel des blastocystes non biopsiés

1. Si aucune biopsie TE n'est effectuée, effondrez artificiellement les blastocystes immédiatement avant la vitrification (Figure 4).
   1. Déplacez le plat de culture de l'incubateur au microscope inversé et concentrez-vous sur l'embryon sélectionné.
   2. Passez à l'objectif laser (impulsion pré-fixée : 0,3 ms, 6,5 m), ciblez la zona pellucida du côté opposé de l'ICM, puis dirigez des impulsions laser de 1 à 2 vers les jonctions entre les cellules TE à une distance sécuritaire de l'ICM. Les blastocystes devraient s'effondrer en moins de 5 min.
2. Procéder à la vitrification du blastocyste effondré tel que décrit dans la section 6.

8. Réchauffement de Blastocysttransférable

1. Le jour de l'ET, préparez la plaque ET 4-puits en plaçant 600 L de milieu de culture de FIV pré-équilibré pour chaque puits. Incuber à 37 oC dans une atmosphère contrôlée (5 % O₂, 6 % CO₂), tout en effectuant un réchauffement blastocyste.
2. Étiquetez le plat chauffant avec le nom et le nom de famille de la femme, l'ID de couple, l'iD de l'embryon qui sera réchauffé en lui.
3. Distribuer 1 ml de la solution de décongélation (TS) (tableaudes matériaux)dans un plat iVF d'un puits (figuresupplémentaire 1) et le réchauffer à 37 oC dans un thermostat pendant au moins 1 h avant de commencer la procédure.
4. Remplissez un petit support de refroidissement avec LN₂ et placez-le dans le capot d'écoulement laminaire à proximité de la zone de travail.
5. Avant de commencer la procédure, vérifiez les informations blastocystes rapportées sur le soutien de vitrification. Toutes les pièces d'intention doivent correspondre au rapport génétique et le blastocyste au chaud doit être choisi parmi les plus transférables. Un témoin est requis pendant l'intervention.
6. Sortez le plat d'un puits contenant de la TS réchauffée du thermostat et placez-le sur une scène chauffée sous le stéréomicroscope.
7. Tirez sur le bouchon de protection dans le LN₂ à l'aide de forceps.
8. Plongez rapidement la pointe du support de vitrification dans le TS de 37 oC.
9. Sous observation microscopique, déplacez doucement le support de vitrification jusqu'à ce que le blastocyste soit libéré de la pointe.
10. Laissez le blastocyste pendant un total de 1 min dans le TS, en faisant attention pour le garder au fond de la TS.
11. À température ambiante, distribuez 200 l de solution de dilution (DS) (Tableaudes matériaux)sur le premier puits de la plaque de vitrification.
12. Transférer le blastocyste à DS et le placer au fond du puits tout en libérant un peu de TS sur le dessus de celui-ci pour créer une sorte de gradient. Laisser agir 3 min.
13. Distribuer 200 l de solution de lavage (WS) dans 2 puits différents (WS1 et WS2).
14. Transférer le blastocyste à WS1 et le placer sur le fond du puits tout en libérant un peu de milieu DS sur le dessus de celui-ci. Ensuite, transférer le blastocyste à WS2 et le laisser intact pendant 1 min.
15. Étiquetez la plaque ET post-réchauffement avec le nom et le nom de la femme, l'ID de couple, l'iD de l'embryon qui sera cultivé en elle.
16. En présence d'un témoin, transférez le blastocyste réchauffé au milieu de culture pré-équilibré dans la plaque ET post-réchauffement.
17. Rincer le blastocyste dans le premier puits de la plaque ET et le placer dans le deuxième puits.
18. Transférer le plat de culture post-réchauffement à l'incubateur dans une atmosphère contrôlée (37 oC, 6 % CO₂, 5 % O₂) et culture du blastocyste pendant au moins 1,5 h avant de vérifier sa survie et sa réexpansion.
    REMARQUE: La figure 5 montre des exemples de blastocystes dégénérés, cryo-survivants, mais non réexpansés et cryo-survivants et entièrement expansés.

9. EmbryoTransfert

1. Pour effectuer ET, placez le plat sur la scène chauffée de la hotte à débit laminaire, de sorte que l'embryon est visible sous le microscope à un faible grossissement.
2. Prenez environ 0,4 ml de milieu de culture FIV. Fixez fermement la pointe de la seringue dans l'extrémité de réception du cathéter interne, puis relâchez le milieu jusqu'à 0,1 ml.
3. Aspirez le milieu de culture jusqu'à ce qu'ils observent les embryons entrant dans le cathéter (quantité minimale de milieux : 10 à 15 l).
4. Placez le cathéter dans le boîtier en plastique et allez à la salle d'opération et placez le cathéter interne dans le guide externe.
5. Une fois atteint l'utérus, poussez le piston de seringue pour libérer l'embryon. Relâchez très lentement le milieu jusqu'à ce que le piston lisse 0,1 ml.
6. Aprenez le cathéter au laboratoire et vérifiez au microscope que l'embryon a été transféré.

Résultats

La figure 6 représente un schéma de tous les résultats d'une procédure de biopsie qui peut être adoptée pour normaliser le protocole et surveiller le rendement de chaque opérateur. Le principal résultat procédural est le moment pour terminer la biopsie/biopsies; le principal résultat technique est la qualité de l'intrigue produite après des tests génétiques qui pourraient entraîner un diagnostic concluant ou non concluant, ce dernier qui néces...

Discussion

Seuls les embryologistes qualifiés expérimentés qui ont terminé leur période de formation devraient effectuer la biopsie TE et la vitrification blastocyste. De plus, un témoin est tenu de surveiller les procédures et de garantir une traçabilité efficace pendant i) les mouvements du blastocyste biopsié du plat de biopsie (figure supplémentaire 1) au plat post-biopsie (figure supplémentaire1 ), puis à la plaque de vitrification (figure supplémentaire 1) et en...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Cold tube rack	Biocision	XTPCR96
Electronic pipette controller	Fisher Scientific	710931
Flexipet adjustable handle set	Cook	G18674	Stripper holder
Gilson Pipetman	Gilson	66003	p20
IVF Electronic Witness System	CooperSurgical Fertility & Genomic Solutions		RI Witness ART Management System
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TE2000-U
Laminar Flow Hood	IVF TECH		Grade A air flow
Laser objective	RI	Saturn 5
Microinjectors	Nikon Narishige	NT-88-V3
Mini centrifuge for PCR tubes	Eppendorf	CSLQSPIN	for 0.2ml PCR tubes
Stereomicroscope	Leica	Leica M80
Thermostat	Panasonic	MCO-5AC-PE
Tri-gas incubator	Panasonic	MCO-5M-PE	02/CO2
Consumables
Biopsy pipette	RI	7-71-30FB35720	30µm ID, flat 35°C
Cryolock	Cryolock	CL-R-CT
CSCM complete	Irvine Scientific	90165	IVF culture medium supplemented with HSA
Embryo Transfer Catheter	Cook	G17934
Flexipet pipette	Cook	G26712	140µm stripping pipette tip
Flexipet pipette	Cook	G46020	300µm stripping pipette tips
Holding pipette	RI	7-71-IH35/20	30µm ID, flat 35°C
Human Serum Albumin	Irvine Scientific	9988
IVF One well dish	Falcon	353653
Mineral Oil for embryo culture	Irvine Scientific	9305
Modified HTF Medium	Irvine Scientific	90126	Hepes-Buffered medium
Nuclon Delta Surface	Thermofisher scientific	176740	IVF dish 4-well plate with sliding lid
Primaria Cell culture dish	Corning	353802	60x15mm
Reproplate	Kitazato	83016
Serological pipette	Falcon	357551	10ml
Sterile disposable Gilson tips	Eppendorf	0030 075.021	200µl
Tubing Kit	Provided by the genetic lab		PCR tubes (0.2mL), loading solution, biopsy washing solution
Vitrification media	Kitazato	VT801	Equilibration and vitrification solutions
Warming media	Kitazato	VT802	Thawing and dilution solutions