人类囊胚活检和细胞化

摘要

需要进行胚泡活检和保并口授,以便有效地进行植入前基因检测。一种方法,导致在授精后的第5-7天连续打开区域细胞和检索7-8个营养细胞,限制了所需的操作次数和胚胎在次优环境条件下的暴露。

摘要

在IVF周期内进行胚泡活检,通过植入前基因测试获得可靠的基因诊断。然后,理想的工作流程需要一个安全有效的牙化协议,由于诊断技术的周转时间,并在下面的自然周期中在生理子宫内膜上移植选定的胚胎。活检方法包括连续打开区域细胞和检索5-10个营养细胞(理想情况下为7-8)限制所需的操作数量和胚胎在次优环境条件下的暴露。经过适当的训练后,该技术在不同的操作者之间可重复活检的时间(±8分钟,根据每盘的胚胎数量进行活检3-22分钟),获得结论性诊断(+97.5%)和玻璃化加热的花体胚泡转移后活产率(>40%)。活检、硝化和变暖后的存活率高达99.8%。气候变暖后1.5小时的再膨胀率高达97%,主要取决于活检和抗化(理想情况下为±30分钟)、胚泡形态质量和活检日之间的时间。一般来说,最好对坍塌的胚泡进行压化;因此,在非PGT周期中,可以进行激光辅助人工收缩,以诱导胚胎在冷冻保存前崩溃。最有希望的未来观点是,在胚泡培养后对IVF培养基进行非侵入性分析,作为胚胎DNA的假定来源。然而,这种潜在的前卫仍在调查之中,还需要定义和验证一个可靠的协议。

引言

现代人类胚胎学的主要目标是使每个刺激周期的活产数量最大化,并降低成本、时间和实现怀孕的努力。为了实现这一目标,应采用经验证的胚胎选择方法,在IVF周期中获得的一组胚胎中确定具有生殖能力的胚胎。根据最新证据,胚泡培养1结合全面的染色体检测和玻璃化加热的幼倍体胚胎移植(ET)是提高IVF效率的最有效框架2。显然,非倍体试验需要胚胎标本,目前主要代表从营养素(TE)中检索到的细胞,即囊胚中给予妊娠期间胚胎附件(例如胎盘)来源的部分.除了核类型分析,还可以从TE活检中评估单个基因突变,作为称为植入前基因测试的临床策略的一部分(PGT;-A用于非倍体,-SR用于结构染色体重组,-M用于单源性疾病)。其他卵母细胞/胚胎活检方法在过去几十年中已被进行解剖和临床采用,即极性身体活检和卵波粒活检。然而,现在减少了它们的使用,因为它们的程序性缺陷(例如,更高的工作量和生殖影响的风险)和诊断限制(例如单细胞分析问题)隐含地阻碍了成本、风险和好处(有关审查,请参阅³)。

在本文中,对TE活检的主要方案之一以及随后所需的保质化、加热和转移程序进行了详尽描述。此处概述的工作流非常适合繁忙的 PGT 单元。

如我们组4,5前面所述,该过程涉及完全扩张的胚泡的分子的连续打开和去除少数TE细胞(平均7-8)。与第3天激光辅助孵化为基础的胚泡活检^方法6相比,这个程序可以简化IVF单元的日常时间表,其中必须及时执行诸如胚泡活检和葡萄光化等精细程序。一旦胚泡达到其完全膨胀,活检可以通过选择TE细胞进行去除,从而防止内细胞质量(ICM)的增生风险,否则会使手术具有挑战性。在文献中,也描述了胚泡活检的第三个方案,即一旦胚胎到达胚泡阶段,在手术5、7前几个小时进行激光辅助孵化。然而,这种方法更耗时,主要适合在经验有限的操作员手中实施TE活检的IVF单元,并且考虑到日工作量适中。

如果旨在进行IVF中的遗传分析,则细胞内体精子注射(ICSI)8应该是一种综合技术。同样,一个适当的培养系统,安全地将胚胎收获到胚泡阶段,对于实施TE活检策略也至关重要。足够数量的培养箱,以及使用低氧张力是这个目的的关键先决条件,不损害胚泡率9。同时,需要一个有效的冷冻保存程序来安全地管理PGT周期。在过去的十年中,牙化的实施提高了胚胎的存活率,甚至高达>99%10,11。这提供了足够的时间进行基因测试,并将胚胎移植推迟到下面的月经周期,在非刺激和可能更容易接受的子宫^内膜12。

TE 活检和 Vitaita 化都是要求严格技能的任务,其有效性可能因经验不足的操作员而异。因此,在允许每个操作员临床执行这些程序之前,提倡一个特定的培训期;此外,应定期通过监测冷冻保存和活检程序的关键绩效指标(KPI)来评估操作人员技能的维持情况。每个IVF诊所应为此设置内部KPI,其中必须近似于国际财团公布的KPI和/或参考实验室公布的结果。

TE 活检、保质化加热和见证程序是我们部门验证的技术,这些技术已在之前三份出版物 11、13、14 中报告的所有操作员中标准化.

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研究方案

这里描述的人类胚泡活检方案遵循了G.EN.E.R.A.人类研究伦理委员会的指导方针。

注:有关所需材料,请参阅材料表。所需材料包括实验室鞋类和服装、外科面罩、头发罩、手术手套、永久无毒标记物、钳子和消毒剂。使用手术服,一次性手术手套,面罩,头发盖是强制性的,以防止污染的风险。在开始任何程序之前,必须使用实验室消毒剂(例如 Oosafe)彻底清洁所有工作区域以及涉及流程的设备。使用的所有消耗品和介质应无菌,并单独包装或无损。建议使用专用工作站进行活检和管道检查,并限制仅对参与手术的操作员(胚胎学家和证人)进入该区。

1. 在活检程序前一天的准备

1. 准备活检后文化菜。
   1. 将6滴20μLIVF培养基(材料表)放入IVF培养皿中,并覆盖6 mL的预热矿物油,用于胚胎培养(材料表)。
   2. 在每个滴中再添加 10 μL IVF 培养基。在受控大气中在37°C下孵育过夜(5% O2,6% CO₂)。
2. 准备一个IVF盘4孔盘,用于活检后洗刷胚泡。
   1. 将600μL的IVF培养基放在前两口井中,并覆盖300μL的预加热矿物油,用于胚胎培养。
   2. 在受控大气中在37°C下孵育过夜(5% O2,6% CO₂)。
3. 在每个 PCR 管中分配 1.5 μL 的加载溶液 (材料表),用于 TE 细胞管,旋转,并将其保持在 4°C。

2. 活检程序日的准备工作

1. 准备活检盘。
   1. 在IVF培养盘中连续放置3滴10μL HEPES缓冲培养基(辅以人血清白蛋白)(材料表)。
   2. 根据可用的胚泡数量(每盘最多4个胚泡)重复步骤1.1.1,并覆盖6 mL的预加热矿物油,用于胚胎培养。
   3. 在进行活检手术之前,在37°C下孵育该菜至少1小时。

3. 胚泡选择和分级

1. 根据其膨胀和ICM和TE的形态外观对胚泡进行分级(图1)。
   注:评分标准改编自加德纳和学校工艺15,以前由卡帕尔博等人和西马多莫等人4,11描述。
   1. 定义大小和扩张等级为:A 表示完全孵化的胚泡,B 表示孵化胚泡,C 表示完全膨胀的胚泡,D 表示未膨胀的胚泡(这些胚胎只有在直到第 7 天未进一步扩张时才进行活检)。
   2. 定义 ICM 等级:1 表示具有多个严格包装的单元的显著 ICM;2 用于可识别多个但包装大致的细胞;3为难以区分与极少数低质量细胞。
   3. 定义 TE 等级如下:1 表示具有多个细胞的组织良好的上皮;2 用于细胞很少的松散上皮;3 用于少数和/或大型低质量细胞。

4. 营养学活检

1. 对所有可行的完全膨胀的胚泡(最好是尺寸和膨胀的 C 级)执行 TE 活检。
2. 为每个活检程序设置固定和活检移液器。活检移液器的建议如下:30 μm 内径、35° 弯曲角度、0.75 mm 距离尖端弯曲。
3. 用病人的详细信息(妇女的姓名、出生日期和身份证)给活检盘贴上标签,然后用胚胎和循环ID对每滴进行编号。使用永久无毒标记。
4. 用300μm剥离移液器将胚泡转移到活检盘的第一滴,并冲洗,以去除培养基的过剩。然后在活检盘的第二滴中移动胚泡。
5. 将培养皿移到倒置显微镜上,将活检移液器从活检盘的第三滴中吸出一些介质。
6. 以 20 倍的放大倍率,定向胚泡,以便清晰查看 ICM。当它在7点钟(与要移除TE细胞的区域相反)可视化时,将胚胎固定在保持移液器上(图2a)。
7. 聚焦在zona的盆腔上,确定移液器和胚泡都在同一个焦点平面上。
8. 切换到激光目标(脉冲时间 0.3 ms,6.5 μm),并将激光笔定位在 ICM 对一侧的 zona pellucida 上。通过 2⁄3 激光脉冲钻取子状球(图2b)。
9. 轻轻地将活检移液器压在 zona pelucida 上,并吹一些介质穿过断裂,将 TE 细胞从内部表面分离,并加速胚泡崩溃(图 2c)。
10. 一旦TE分离(图2d),通过孔进入(如果需要,用最后一个激光脉冲使其更宽),并吸出少数TE细胞(理想情况下为7+813,16)进入活检移液器与温和的吸力(图2e)。
11. 在施加适度吸力以拉伸目标细胞时,稍微向后移动活检移液器(图2f)。
12. 将激光定向到吸气细胞最薄的部分,并在细胞之间的结处发射2+5个激光脉冲,将目标细胞与胚胎体分离(图2g)。激光脉冲的时序和脉冲数可根据胚泡的质量进行调整;然而,尽量减少它们,以避免细胞外小孔。
13. 在TE片段从胚泡中分离出来(图2h)后,将其释放到远离胚泡的相同活检滴中。这是需要防止他们再次被吸入活检移液器(图2i)。
14. 从保持移液器中释放胚泡,并迅速升起两个移液器,以防止碎片粘附在液器上。
15. 为质量控制目的拍摄活检片段的图片(图3)。
    注:如果每个程序要活检一个以上,每个活检盘最多4个,用新活检移液器更换,以防止胚胎之间的交叉污染。
16. 重复步骤 4.1_4.13。
17. 将活检盘移回层流罩。
18. 用夫妇ID标记活检后培养皿,每滴都带有胚胎和周期ID。
19. 在证人在场的情况下,用干净的IVF介质冲洗胚泡,最后将其移动到活检后盘的相应滴。
20. 在受控环境中(37°C,6% CO 2,5% O₂₎将活检后培养皿移到培养箱,直至进行硝化。建议在活检程序后 30 分钟内进行葡萄化,以防止胚泡重新膨胀。

5. 管状

注:整个过程必须在证人在场的情况下进行,并在室温下在层流罩内进行。在此过程中,将 PCR 管放在冰上的冷管架上(补充图 1)。

1. 用永久无毒标记标记 PCR 管。
   注:标签应按照基因实验室的要求进行。一般来说,患者的姓名和姓氏(首字母缩写)、夫妇ID、胚胎和周期ID(例如:JD 12345 1.2,用于属于Jane Doe的二周期胚胎N.1,其夫妇ID为12345)。胚胎 ID 也应在管体上用字母报告。
2. 将60 mm x 15 mm培养皿(管盘)的盖子与活检胚胎的标识(补充图1)贴上标签,并在其中制备两滴10μL的活检洗涤液(材料表)。
3. 用一些活检洗涤液从管盘的第二滴中给140μm剥离移液器充油(补充图1)。
4. 将活检盘置于立体显微镜下,轻松可视化 TE 片段。
5. 在TE片段上轻轻释放一些活检洗涤溶液;然后,将其加载到剥离移液器中。
6. 将 TE 片段移到管盘中第二滴活检洗涤溶液,并仔细冲洗 2⁄3 次。
7. 使用装载溶液将 TE 片段转移到 PCR 管的底部(之前标记后),注意避免用剥离移液器的尖端接触其墙壁。
8. 对每个 TE 片段重复步骤 5.3 到步骤 5.7 的过程,注意为每个 TE 片段使用新的毛细管。
9. 在管道程序结束时,将所有 PCR 管放入小型离心机中,然后旋转几秒钟。
10. 将样品储存在-20°C,直到将它们运送到转诊基因实验室进行检测。

6. 胚泡式化

1. 在TE活检30分钟内,Vitrify崩塌的胚泡,以防止其再次扩张。
2. 用女性的细节和必须玻璃化的胚泡的识别标记玻璃化板。
3. 用妇女的姓名、夫妻身份证、将加载在它的胚胎的身份证以及手术日期,标记牙化支持。使用特殊的低温标签,即使在极低的温度下(-196 °C),也能保持其完整性。
4. 在室温下,为每个将玻璃化的胚泡分配0.3 mL的平衡溶液(ES)(材料表)。
5. 在证人在场的情况下,使用 300 μm 剥离移液器在 ES 中移动胚泡。
6. 将胚泡留在 ES 中 13-15 分钟。在体积初始收缩后,将观察到逐渐的再膨胀。
7. 用液氮 (LN₂) 填充小型冷却架,并将其置于层流罩下。
8. 在第二口井中分配300 μL的硝化溶液(VS)(材料表)。胚泡完全重新膨胀后,将其在VS溶液中转移1分钟,并冲洗以稀释ES。
9. 在证人在场的情况下,将胚泡加载到硝化支架上,并注意去除 VS 的过剩。一个微妙的解决方案膜应该包围胚泡。
10. 将硝化支撑插入 LN₂并大力移动,以降低靠近试样气泡形成的风险。
11. 放置保护盖,同时保持在 LN₂中浸入的硝化支架。
12. 在见证人在场的情况下,在长期 LN₂储罐中移动保化支架。

7. 非活检的人工收缩

1. 如果未进行 TE 活检,则在化化前立即人工折叠胚泡(图 4)。
   1. 将培养皿从培养箱移到倒置显微镜上,并聚焦在选定的胚胎上。
   2. 切换到激光目标(预设脉冲:0.3 ms,6.5 μm),将区域球位对准ICM的另一侧,然后将1⁄2激光脉冲定向到与ICM安全距离处的TE细胞之间的结处。胚泡应在5分钟内坍塌。
2. 继续按照第 6 节所述对折叠的胚泡进行压化。

8. 可转移的胚泡加热

1. 在 ET 当天,通过为每个孔放置 600 μL 的预平衡 IVF 培养基,准备 ET 4 孔板。在受控大气中(5%O 2,CO₂₎在37°C孵育,同时进行胚泡加热。
2. 用妇女的名字和姓氏,夫妇ID,胚胎的ID,将加热在其中标记加热的加热菜。
3. 在IVF单井盘中分配1mL的解冻溶液(TS)(材料表),在开始手术前在恒温器中加热至37°C至少1小时。
4. 用 LN₂填充小型冷却支架,并将其放置在靠近工作区的层流罩中。
5. 在开始手术之前,请检查有关硝化支架报告的胚泡信息。所有的D应该匹配遗传报告和胚泡加热必须选择在可转移的。在手术过程中需要证人。
6. 从恒温器中拿出含有加热TS的单井盘,放在立体显微镜下的加热舞台上。
7. 使用钳子将保护盖拉过 LN₂内。
8. 快速将硝化支架的尖端插入 37 °C TS。
9. 在微观观察下,轻轻移动葡萄光支撑,直到胚泡从尖端释放出来。
10. 在 TS 中总共离开胚泡 1 分钟,注意将其保持在 TS 底部。
11. 在室温下,在硝化板的第一口井上分配200 μL的稀释溶液(DS)(材料表)。
12. 将胚泡转移到DS,并将其放置在井底,同时在井顶部释放一些TS,以创建一种梯度。保留 3 分钟。
13. 在 2 个不同的井(WS1 和 WS2)中分配 200 μL 的洗涤溶液 (WS)。
14. 将胚泡转移到 WS1 并将其放在井底,同时在井顶部释放一些 DS 介质。然后将胚泡转移到 WS2,使其不受干扰 1 分钟。
15. 用女性的姓名、夫妻身份证、胚胎的身份证在加热后ET牌上贴上标签。
16. 在证人在场的情况下,将加热的胚泡转移到加热后ET板中的预平衡培养基。
17. 在 ET 板的第一个孔中冲洗胚泡并将其放在第二孔中。
18. 在受控环境中(37°C,6% CO 2,5% O₂₎将加热后培养皿转移到培养箱,并在检查其存活和再膨胀之前将胚泡培养至少1.5小时。
    注:图 5显示了退化、低温生存但不重新膨胀和低温生存和完全膨胀的胚泡的示例。

9. 胚胎移植

1. 要执行 ET,将培养皿放在层流罩的加热台上,这样胚胎在显微镜下以较低的放大倍率可见。
2. 服用约0.4 mL的IVF培养基。将注射器尖端牢固地固定到内部导管的接收端,然后释放介质,至 0.1 mL。
3. 吸气培养基,直到观察进入导管的胚胎(最小量的介质:10~15 μL)。
4. 将导管放入塑料盒中,然后进入手术室,并将内部导管放入外部导轨中。
5. 到达子宫后,推动注射器柱塞释放胚胎。非常缓慢地释放介质,直到柱塞读数为 0.1 mL。
6. 把导管带回实验室,在显微镜下检查胚胎已经转移。

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结果

图 6显示了活检程序的所有结果方案,可用于标准化协议并监控每个操作员的性能。主要程序结果是完成活检/活检的时间;主要技术结果是基因测试后产生的图的质量,可能导致结论性或无结论性诊断,后者要求对未诊断的胚泡进行重新活检;主要生物结果是变暖后的低温生存率和再膨胀率与退化率;最后,主要临床结果为玻璃化加热胚泡转移后的活产率。在...

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讨论

只有经验丰富的熟练胚胎学家谁完成了他们的训练期应进行TE活检和胚泡性牙菌。此外,需要证人监测程序,并保证在i期间有效追踪活检胚泡从活检盘(补充图1)到活检后盘的移动(补充图1)(补充图1)),然后到化板(补充图1),最后到硝化支持(补充图1);ii) 活检TE细胞从活检盘转移到PCR管(补充图1);iii) 诊断后的加热和转移步骤。有关所有见证步骤...

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材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Cold tube rack	Biocision	XTPCR96
Electronic pipette controller	Fisher Scientific	710931
Flexipet adjustable handle set	Cook	G18674	Stripper holder
Gilson Pipetman	Gilson	66003	p20
IVF Electronic Witness System	CooperSurgical Fertility & Genomic Solutions		RI Witness ART Management System
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TE2000-U
Laminar Flow Hood	IVF TECH		Grade A air flow
Laser objective	RI	Saturn 5
Microinjectors	Nikon Narishige	NT-88-V3
Mini centrifuge for PCR tubes	Eppendorf	CSLQSPIN	for 0.2 mLl PCR tubes
Stereomicroscope	Leica	Leica M80
Thermostat	Panasonic	MCO-5AC-PE
Tri-gas incubator	Panasonic	MCO-5M-PE	02/CO2
Consumables
Biopsy pipette	RI	7-71-30FB35720	30 µm ID, flat 35 °C
Cryolock	Cryolock	CL-R-CT
CSCM complete	Irvine Scientific	90165	IVF culture medium supplemented with HSA
Embryo Transfer Catheter	Cook	G17934
Flexipet pipette	Cook	G26712	140µm stripping pipette tip
Flexipet pipette	Cook	G46020	300µm stripping pipette tips
Holding pipette	RI	7-71-IH35/20	30 µm ID, flat 35 °C
Human Serum Albumin	Irvine Scientific	9988
IVF One well dish	Falcon	353653
Mineral Oil for embryo culture	Irvine Scientific	9305
Modified HTF Medium	Irvine Scientific	90126	Hepes-Buffered medium
Nuclon Delta Surface	Thermofisher scientific	176740	IVF dish 4-well plate with sliding lid
Primaria Cell culture dish	Corning	353802	60 mm x15 mm
Reproplate	Kitazato	83016
Serological pipette	Falcon	357551	10ml
Sterile disposable Gilson tips	Eppendorf	0030 075.021	200 µL
Tubing Kit	Provided by the genetic lab		PCR tubes (0.2 mL), loading solution, biopsy washing solution
Vitrification media	Kitazato	VT801	Equilibration and vitrification solutions
Warming media	Kitazato	VT802	Thawing and dilution solutions