Biopsia y vitrificación de blastocisto humano

Resumen

La biopsia de blastocisto y la vitrificación son necesarias para realizar pruebas genéticas preimplantacionales de manera eficiente. Un enfoque que implica la apertura secuencial de la zona pellucida y la recuperación de 7-8 células de trophectoderm en el día 5-7 post-inseminación limita tanto el número de manipulaciones requeridas como la exposición del embrión a condiciones ambientales subóptimas.

Resumen

La biopsia de blastocisto se realiza para obtener un diagnóstico genético fiable durante los ciclos de FIV con pruebas genéticas preimplantacionales. A continuación, el flujo de trabajo ideal implica un protocolo de vitrificación seguro y eficiente, debido al tiempo de respuesta de las técnicas de diagnóstico y para transferir el embrión o embriones seleccionados en un endometrio fisiológico en un siguiente ciclo natural. Un enfoque de biopsia que abarca la apertura secuencial de la zona pellucida y la recuperación de 5-10 células de trophectoderm (idealmente 7-8) limita tanto el número de manipulaciones requeridas como la exposición del embrión a condiciones ambientales subóptimas. Después del entrenamiento adecuado, la técnica fue reproducible entre diferentes operadores en términos de sincronización de la biopsia (8 min, que van 3-22 min en función del número de embriones a biopsia por plato), diagnósticos concluyentes obtenidos (97,5%) y las tasas de nacimientos vivos después de la transferencia de blastocisto euploide vitriloide (>40%). La tasa de supervivencia después de la biopsia, vitrificación y calentamiento fue tan alta como 99.8%. La tasa de reexpansión a 1,5 h del calentamiento fue tan alta como 97%, dependiendo en gran medida del momento entre la biopsia y la vitrificación (idealmente 30 min), la calidad morfológica del blastocisto y el día de la biopsia. En general, es mejor vitrifiar un blastocisto colapsado; por lo tanto, en ciclos no-PGT, la contracción artificial asistida por láser podría realizarse para inducir el colapso embrionario antes de la criopreservación. La perspectiva de futuro más prometedora es el análisis no invasivo de los medios de cultivo de FIV después del cultivo del blastocisto como fuente putativa de ADN embrionario. Sin embargo, esta vanguardia potencial todavía está en investigación y todavía es necesario definir y validar un protocolo fiable.

Introducción

El objetivo principal de la embriología humana moderna es maximizar el número de nacimientos vivos por ciclo estimulado y reducir los costos, el tiempo y los esfuerzos para lograr un embarazo. Para lograr este objetivo, se deben emplear enfoques validados para la selección de embriones para identificar embriones reproductivos competentes dentro de una cohorte obtenida durante un ciclo de FIV. Según las últimas pruebas, el cultivo de blastocisto¹ combinado con pruebas cromosómicas exhaustivas y transferencia de embriones euploide (ET) calentada vitrificada es el marco más eficiente para aumentar la eficiencia de la FIV^2. Claramente, las pruebas de aneuploidía requieren un espécimen embrionario, que en la actualidad se representa principalmente a partir de pocas células recuperadas del trophectoderrm (TE), es decir, la sección del blastocisto que da origen a los anexos embrionarios (por ejemplo, la placenta) durante el embarazo . Más allá del análisis del cariotipo, también se podrían evaluar mutaciones genéticas únicas a partir de una biopsia TE como parte de una estrategia clínica conocida como pruebas genéticas preimplantacionales (PGT; -A para aneuploidías, -SR para reordenamientos cromosómicos estructurales, -M para enfermedades monogénicas). Otros métodos de biopsia de ovocitos/embriones han sido teorizados y adoptados clínicamente a lo largo de las últimas décadas, a saber, biopsia de cuerpos polares y biopsia de blastomero. Sin embargo, su uso se reduce hoy en día, ya que sus inconvenientes procesales (por ejemplo, mayor carga de trabajo y riesgo de impacto reproductivo) y las limitaciones diagnósticas (por ejemplo, cuestiones de análisis de una sola célula) obstaculizan implícitamente un equilibrio suficiente entre los costos, los riesgos y beneficios (para una revisión ver³).

En este artículo, uno de los principales protocolos para la biopsia de TE se describe a fondo junto con los procedimientos posteriores de vitrificación, calentamiento y transferencia requeridos. El flujo de trabajo aquí descrito es ideal para una unidad PGT ocupada.

Como ya ha descrito anteriormente nuestro grupo^4,5, el procedimiento implica la apertura secuencial de la zona pellucida de blastocistos completamente expandidos y la eliminación de pocas células TE (en promedio 7-8). En comparación con el método de biopsia de blastocisto basada en el sombreado asistida por láser^deldía 3, este procedimiento podría facilitar el horario diario de una unidad de FIV donde se deben realizar oportunamente procedimientos delicados, como la biopsia de blastocisto y la vitrificación. Tan pronto como el blastocisto alcanza su expansión completa, la biopsia se puede llevar a cabo seleccionando las células TE para extraer, evitando así el riesgo de hernia de la masa celular interna (ICM), lo que de otra manera haría que el procedimiento fuera un reto. En la literatura, también se ha descrito un tercer protocolo de biopsia de blastocisto, que implica la eclosión asistida por láser que se realiza una vez que el embrión ya ha alcanzado la etapa de blastocisto, pocas horas antes del procedimiento^5,7. Sin embargo, este enfoque consume más tiempo y se adapta principalmente a las unidades de FIV que están implementando la biopsia TE en manos de operadores con experiencia limitada y en vista de una carga de trabajo diaria moderada-baja.

La inyección intracitoplasmática de espermatozoides (ICSI)⁸ debe ser una técnica consolidada si se trata de realizar análisis genéticos en ficticia. Del mismo modo, un sistema de cultivo adecuado para cosechar embriones de forma segura en la etapa de blastocisto es crucial para la implementación de la estrategia de biopsia TE. Un número adecuado de incubadoras, así como el uso de baja tensión de oxígeno son requisitos previos clave para este fin, no comprometer la tasa de blastocisto⁹. Al mismo tiempo, se necesita un programa de criopreservación eficiente para gestionar de forma segura un ciclo de PGT. En la última década, la implementación de la vitrificación ha impulsado las tasas de criosupervivencia embrionaria hasta >99%^10,11. Esto proporcionó tiempo suficiente para realizar pruebas genéticas y posponer la transferencia de embriones al siguiente ciclo menstrual, en un endometrio no estimulado y probablemente más receptivo^12.

Tanto la biopsia de TE como la vitrificación son tareas exigentes que requieren habilidades estrictas y su eficacia puede variar entre operadores sin experiencia. Por lo tanto, se aboga un período de formación específico antes de permitir que cada operador realice estos procedimientos clínicamente; además, el mantenimiento de las habilidades de los operadores debe evaluarse periódicamente mediante el seguimiento de indicadores clave de rendimiento (KPI) para los procedimientos de criopreservación y biopsia. Cada clínica de FIV debe establecer KPI internos para este fin, que deben aproximarse a los publicados por consorcios internacionales y/o los resultados publicados por los laboratorios de referencia.

La biopsia TE, el calentamiento de la vitrificación y los procedimientos de testimonio son técnicas validadas en nuestra unidad, que se han estandarizado en todos los operadores involucrados según se informó en tres publicaciones anteriores^11,13,14 .

Protocolo

El protocolo para la biopsia de blastocisto humano, aquí descrito, sigue las directrices del Comité Ético de Investigación Humana de G.EN.E.R.A.

NOTA: Consulte la Tabla de materiales para conocer los materiales necesarios. El material adicional requerido incluye calzado y atuendo de laboratorio, mascarilla quirúrgica, cubierta capilar, guantes quirúrgicos, un marcador permanente no tóxico, fórceps y desinfectante. El uso de bata quirúrgica, guantes quirúrgicos desechables, máscara facial, cubierta del cabello es obligatorio para prevenir el riesgo de contaminación. Todas las áreas de trabajo, así como el equipo involucrado en el proceso, deben limpiarse a fondo con desinfectante de laboratorio (por ejemplo, Oosafe) antes de iniciar cualquier procedimiento. Todos los consumibles y medios utilizados deben ser estériles y envasados o alícuotas individualmente. Se sugiere utilizar una estación de trabajo dedicada para biopsia y tubos y limitar el acceso de la zona sólo a los operadores involucrados en el procedimiento (embriólogo y testigo).

1. Preparación el día antes del procedimiento de biopsia

1. Prepare el plato de cultivo posterior a la biopsia.
   1. Colocar 6 gotas de medio de cultivo de FIV de 20 l (Tablade materiales)en un plato de cultivo de FIV y superponer con 6 ml de aceite mineral precalentado para el cultivo embrionario (Tablade materiales).
   2. Agregue otros 10 l de medio de cultivo de FIV a cada gota. Incubar durante la noche a 37oC en una atmósfera controlada (5% O₂, 6% CO₂).
2. Prepare una placa de 4 pocillos de FIV para enrredar el blastocisto después de la biopsia.
   1. Colocar 600 l de medio de cultivo de FIV en los dos primeros pozos y superponer con 300 l de aceite mineral precalentado para el cultivo embrionario.
   2. Incubar durante la noche a 37oC en una atmósfera controlada (5% O₂, 6% CO₂).
3. Dispensar 1,5 l de solución de carga (Tablade materiales)en cada tubo de PCR que se utilizará para tubos de células TE, girarlo y mantenerlo a 4 oC.

2. Preparación el día del procedimiento de biopsia

1. Prepare el plato de la biopsia.
   1. Colocar 3 gotas de medio tampón HEPES de 10 ol (complementado con albúmina sérica humana) (Tablade materiales)en una fila en un plato de cultivo de FIV.
   2. Repita el paso 1.1.1 según el número de blastocistos disponibles (hasta 4 blastocistos por plato) y superponga con 6 ml de aceite mineral precalentado para el cultivo embrionario.
   3. Incubar el plato a 37 oC durante al menos 1 h antes de realizar el procedimiento de biopsia.

3. Selección y calificación de blastocistos

1. Calificar el blastocisto según su expansión y la apariencia morfológica de ICM y TE (Figura1).
   NOTA: Los criterios de calificación han sido adaptados de Gardner y Schoolcraft¹⁵ y descritos previamente por Capalbo et al. y Cimadomo et al.^4,11.
   1. Defina el tamaño y el grado de expansión como: A para un blastocisto completamente rayado, B para un blastocisto de eclosión, C para un blastocisto completamente expandido y D para un blastocisto no expandido (estos embriones se biopsian solo si no se expandieron más hasta el día 7).
   2. Definir grado ICM: 1 para ICM notable con varias células estrictamente empaquetadas; 2 para discernible con varias células pero aproximadamente embaladas; 3 para difícil de distinguir con muy pocas células de baja calidad.
   3. Definir el grado TE de la siguiente manera: 1 para epitelio bien organizado con varias células; 2 para epitelio suelto con pocas células; 3 para pocas y/o grandes células de baja calidad.

4. Biopsia de trofhectoderm

1. Realizar una biopsia de TE en todos los blastocistos completamente expandidos viables (preferiblemente grado C para el tamaño y la expansión).
2. Establezca pipetas de sujeción y biopsia para cada procedimiento de biopsia. Las recomendaciones para la pipeta de biopsia son las siguientes: diámetro interno de 30 m, ángulo de curvatura de 35o, punta de distancia de 0,75 mm para doblar.
3. Etiquete el plato de biopsia con los detalles del paciente (nombre y apellidos de la mujer, fecha de nacimiento e identificación) y luego numera cada gota con embriones e identificaciones de ciclo. Utilice un marcador permanente no tóxico.
4. Transfiera el blastocisto con una pipeta de decapado de 300 m a la primera gota de la placa de biopsia y enjuáguelo para eliminar el exceso de medio de cultivo. A continuación, mueva el blastocisto en la segunda gota de la placa de biopsia.
5. Mueva el plato al microscopio invertido y prepare la pipeta de biopsia que aspira algún medio de la tercera gota de la placa de biopsia.
6. Con aumento 20x, oriente el blastocisto para tener una visión clara del MIC. Cuando se visualice a las 7 en punto (frente al área que se dirigirá para eliminar las células TE), fije el embrión en la pipeta de retención (Figura2a).
7. Concéntrese en la zona pellucida y compruebe que tanto las pipetas como el blastocisto están en el mismo plano focal.
8. Cambie al objetivo láser (tiempo de pulso 0,3 ms, 6,5 m) y coloque el puntero láser en la zona pellucida en el lado opuesto de ICM. Taladre la zona pellucida a través de 2 x 3 pulsos láser (Figura2b).
9. Presione suavemente la pipeta de biopsia contra la zona pellucida y sople algún medio a través de la brecha para separar las células TE de su superficie interna y acelerar el colapso del blastocisto (Figura2c).
10. Una vez que el TE se separa (Figura2d), entrar a través del agujero (si es necesario, hacerlo más ancho con un último pulso láser) y aspirar algunas células TE (idealmente 7-8^13,16) en la pipeta con succión suave (Figura2e).
11. Mueva ligeramente la pipeta de biopsia hacia atrás mientras aplica una succión moderada para estirar las células diana (Figura2f).
12. Dirija el láser hacia la parte más delgada de las células aspiradas y dispare 2 x 5 pulsos láser en las uniones entre las células para separar las células diana del cuerpo del embrión (Figura2g). El tiempo de los pulsos láser y el número de pulsos se pueden ajustar de acuerdo con la calidad del blastocisto; sin embargo, trate de minimizarlos para evitar la lisis celular.
13. Después de la separación del fragmento de TE del blastocisto (Figura2h),suéltelo en la misma caída de biopsia lejos del blastocisto. Esto es necesario para evitar que se succionen de nuevo en la pipeta de biopsia (Figura2i).
14. Suelte el blastocisto de la pipeta de sujeción y levante rápidamente ambas pipetas para evitar que el fragmento se pegue a ellas.
15. Tome una foto del fragmento biopsiado para el control de calidad (Figura 3).
    NOTA: Si se va a biopsiar más de un blastocisto por procedimiento (hasta cuatro por plato de biopsia), cambie la pipeta de biopsia por una nueva para evitar la contaminación cruzada entre embriones.
16. Repita los pasos 4.1 a 4.13.
17. Mueva la antena de biopsia de nuevo a la capucha de flujo laminar.
18. Etiquete el plato de cultivo post-biopsia con la identificación de la pareja, y cada gota con el embrión y la identificación del ciclo.
19. En presencia de un testigo, enjuague el blastocisto en un medio limpio de FIV y, por último, muévalo a su correspondiente gota de la placa post-biopsia.
20. Mover la placa post-biopsia a la incubadora en una atmósfera controlada(37 oC, 6% CO 2, 5% O₂) hasta la vitrificación. Es aconsejable realizar vitrificación dentro de los 30 minutos del procedimiento de biopsia, para evitar la reexpansión del blastocisto.

5. Tubos

NOTA: Todo el procedimiento debe llevarse a cabo en presencia de un testigo y en el interior de la campana de flujo laminar a temperatura ambiente. Durante el procedimiento, mantenga los tubos PCR en un estante de tubo frío sobre hielo (Figurasuplementaria 1).

1. Etiquete los tubos PCR con un marcador permanente no tóxico.
   NOTA: El etiquetado debe realizarse según lo solicitado por el laboratorio genético. Generalmente, el nombre y apellidodel del paciente (iniciales), la identificación de pareja, el embrión y la identificación del ciclo (por ejemplo: JD 12345 1.2 para el embrión N.1 del 2o ciclo perteneciente a Jane Doe cuya identificación de pareja es 12345). La identificación del embrión debe notificarse también en letras en el cuerpo del tubo.
2. Etiquete la tapa de un plato de cultivo de 60 mm x 15 mm (plato de tubo) con los ID de los embriones biopsiados (Figurasuplementaria 1) y prepare dos gotas de 10 ol de solución de lavado de biopsia (Tablade materiales)en ella.
3. Prepara la pipeta de desmontaje de 140 m (FiguraSuplementaria 1) con una solución de lavado de biopsia de la segunda gota de la placa de tubo.
4. Coloque la antena de biopsia debajo del estereomicroscopio para visualizar fácilmente los fragmentos de TE.
5. Suelte suavemente alguna solución de lavado de biopsia sobre el fragmento de TE; luego, cárguelo en la pipeta de desmontaje.
6. Mueva el fragmento de TE a la segunda gota de solución de lavado de biopsia en la placa de tubo y enjuáguelo cuidadosamente de 2 a 3 veces.
7. Transfiera el fragmento de TE a la parte inferior del tubo PCR (previamente etiquetado después de él) con solución de carga, prestando atención para evitar tocar sus paredes con la punta de la pipeta de desmontaje.
8. Repita el procedimiento del paso 5.3 al paso 5.7 para cada fragmento de TE, prestando atención a utilizar un nuevo capilar para cada fragmento de TE.
9. Al final del procedimiento de tubería, poner todos los tubos PCR en una mini centrífuga, y girarlos durante unos segundos.
10. Almacene las muestras a -20 oC hasta que las envíe al laboratorio genético de referencia para su análisis.

6. Vitrificación de Blastoquistes

1. Vitrify congeló blastocistos en un radio de 30 minutos de la biopsia de TE para evitar su reexpansión.
2. Etiquete la placa de vitrificación con los detalles de la mujer y los documentos de identificación de los blastocistos que deben ser vitrificados.
3. Etiquetar los soportes de vitrificación con el nombre y apellidos de la mujer, el documento de identidad de pareja, el documento de identidad del embrión que se cargará en él, así como la fecha del procedimiento. Se utilizan crioetiquetas especiales que preservan su integridad incluso a muy baja temperatura (-196 oC).
4. A temperatura ambiente, dispensar 0,3 ml de solución de equilibrio (ES) (Tablade materiales)para cada blastocisto que se vitrifique.
5. En presencia de un testigo, mueva el blastocisto en ES utilizando la pipeta de desmontaje de 300 m.
6. Deje el blastocisto en el ES durante 13-15 min. Después de una contracción inicial del volumen, se observará una re-expansión gradual.
7. Llene un pequeño estante de enfriamientocon nitrógeno líquido (LN 2) y colóquelo debajo de la campana de flujo laminar.
8. Dispensar 300 l de solución de vitrificación (VS) (Tablade materiales)en el segundo pozo. Después de la reexpansión completa del blastocisto, transfiéralo en la solución VS durante 1 min y enjuáguelo para diluir el ES.
9. En presencia de un testigo, cargue el blastocisto en el soporte de vitrificación y encárguese de eliminar el exceso de VS. Una película sutil de solución debe rodear el blastocisto.
10. Sumergir el soporte de vitrificación en LN₂ y moverlo enérgicamente con el fin de reducir el riesgo de formación de burbujas cerca de la muestra.
11. Coloque la tapa protectora mientras mantiene el soporte de vitrificación sumergido en el LN_2.
12. En presencia de un testigo, mueva el soporte de vitrificación en un tanque de almacenamiento LN₂ a largo plazo.

7. Contracción artificial de blastocistos no biopsiados

1. Si no se realiza ninguna biopsia te, colapse artificialmente los blastocistos inmediatamente antes de la vitrificación (Figura4).
   1. Mueva el plato de cultivo de la incubadora al microscopio invertido y concéntrese en el embrión seleccionado.
   2. Cambie al objetivo láser (pulso preconfigurado: 0,3 ms, 6,5 m), apunte a la zona pellucida en el lado opuesto del MIC y, a continuación, dirija 1–2 pulsos láser a las uniones entre las células TE a una distancia segura del MIC. Los blastocistos deben colapsar en menos de 5 min.
2. Proceda con la vitrificación del blastocisto colapsado como se describe en la sección 6.

8. Calentamiento transferible de blastocisto

1. El día del ET, prepare la placa ET de 4 pocillos colocando 600 ml de medio de cultivo de FIV preequilibrado para cada pocal. Incubar a 37oC en una atmósfera controlada (5% O₂, 6% CO₂), mientras se realiza el calentamiento del blastocisto.
2. Etiqueta el plato de calentamiento con el nombre y apellido de la mujer, identificación de pareja, identificación del embrión que se calentará en él.
3. Dispensar 1 ml de la solución de descongelación (TS) (Tablade materiales)en un plato de un solo pozo de FIV (Figurasuplementaria 1) y calentarla a 37 oC en un termostato durante al menos 1 h antes de iniciar el procedimiento.
4. Llene un pequeño soporte de refrigeración con LN₂ y colóquelo en la campana de flujo laminar cerca del área de trabajo.
5. Antes de iniciar el procedimiento, compruebe la información de blastocisto que se indica en el soporte de vitrificación. Todos los ID deben coincidir con el informe genético y el blastocisto para calentar debe ser elegido entre los transferibles. Se requiere un testigo durante el procedimiento.
6. Saque el plato de un solo pozo que contiene TS caliente del termostato y colóquelo en un escenario calentado bajo el estereomicroscopio.
7. Tire de la tapa protectora dentro del LN₂ usando fórceps.
8. Sumérgete rápidamente en la punta del soporte de vitrificación en el TS de 37oC.
9. Bajo observación microscópica, mueva suavemente el soporte de vitrificación hasta que el blastocisto se libere de la punta.
10. Deje el blastocisto durante un total de 1 min en el TS, prestando atención para mantenerlo en la parte inferior del TS.
11. A temperatura ambiente dispensa 200 l de solución de dilución (DS) (Tablade materiales)en el primer pozo de la placa de vitrificación.
12. Transfiera el blastocisto a DS y colóquelo en la parte inferior del pozo mientras libera un poco de TS en la parte superior del mismo para crear una especie de gradiente. Déjalo durante 3 min.
13. Dispensar 200 l de solución de lavado (WS) en 2 pozos diferentes (WS1 y WS2).
14. Transfiera el blastocisto a WS1 y colóquelo en la parte inferior del pozo mientras libera algún medio DS en la parte superior del mismo. A continuación, transfiera el blastocisto a WS2 y déjelo sin perturbaciones durante 1 min.
15. Etiquetar la placa ET post-calentamiento con el nombre y apellido de la mujer, identificación de pareja, identificación del embrión que se cultivará en ella.
16. En presencia de un testigo, transfiera el blastocisto calentado al medio de cultivo preequilibrado en la placa ET post-calentamiento.
17. Enjuague el blastocisto en el primer poceto de la placa ET y colóquelo en el segundo pozo.
18. Transfiera el plato de cultivo post-calentamiento a la incubadora en una atmósfera controlada (37 oC, 6% CO₂, 5% O₂) y escene el blastocisto durante al menos 1,5 horas antes de comprobar su supervivencia y reexpansión.
    NOTA: La Figura 5 muestra ejemplos de blastocistos degenerados, crio-sobrevividos pero no re-expandidos y crio-sobrevividos y completamente expandidos.

9. EmbryoTransfer

1. Para realizar ET, coloque el plato en la etapa calentada de la campana de flujo laminar, para que el embrión sea visible bajo el microscopio con un aumento bajo.
2. Tome aproximadamente 0,4 ml de medio de cultivo de FIV. Fije firmemente la punta de la jeringa en el extremo receptor del catéter interno y luego suelte el medio hasta 0,1 ml.
3. Aspirar el medio de cultivo hasta observar los embriones que entran en el catéter (cantidad mínima de medios: 10-15 l).
4. Coloque el catéter en la caja de plástico y vaya al quirófano y coloque el catéter interno en la guía externa.
5. Una vez que haya llegado al útero, empuje el émbolo de la jeringa para liberar el embrión. Suelte muy lentamente el medio hasta que el émbolo esté leyendo 0,1 ml.
6. Lleve el catéter de vuelta al laboratorio y compruebe bajo el microscopio que el embrión ha sido transferido.

Resultados

La Figura 6 representa un esquema de todos los resultados de un procedimiento de biopsia que se puede adoptar para estandarizar el protocolo y monitorear el rendimiento de cada operador. El principal resultado procedimental es el momento para completar la biopsia/biopsias; el principal resultado técnico es la calidad de la trama producida después de pruebas genéticas que podrían resultar en un diagnóstico concluyente o no concluyente, el último de los c...

Discusión

Sólo los embriólogos experimentados que hayan completado su período de entrenamiento deben realizar tanto la biopsia TE como la vitrificación del blastocisto. Además, se requiere un testigo para monitorear los procedimientos y garantizar una trazabilidad eficiente durante i) los movimientos del blastocisto biopsiado desde la antena de biopsia (FiguraSuplementaria 1) a la antena post-biopsia (FiguraSuplementaria 1 ), a continuación a la placa de vitrificación (Figurasupleme...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Cold tube rack	Biocision	XTPCR96
Electronic pipette controller	Fisher Scientific	710931
Flexipet adjustable handle set	Cook	G18674	Stripper holder
Gilson Pipetman	Gilson	66003	p20
IVF Electronic Witness System	CooperSurgical Fertility & Genomic Solutions		RI Witness ART Management System
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TE2000-U
Laminar Flow Hood	IVF TECH		Grade A air flow
Laser objective	RI	Saturn 5
Microinjectors	Nikon Narishige	NT-88-V3
Mini centrifuge for PCR tubes	Eppendorf	CSLQSPIN	for 0.2ml PCR tubes
Stereomicroscope	Leica	Leica M80
Thermostat	Panasonic	MCO-5AC-PE
Tri-gas incubator	Panasonic	MCO-5M-PE	02/CO2
Consumables
Biopsy pipette	RI	7-71-30FB35720	30µm ID, flat 35°C
Cryolock	Cryolock	CL-R-CT
CSCM complete	Irvine Scientific	90165	IVF culture medium supplemented with HSA
Embryo Transfer Catheter	Cook	G17934
Flexipet pipette	Cook	G26712	140µm stripping pipette tip
Flexipet pipette	Cook	G46020	300µm stripping pipette tips
Holding pipette	RI	7-71-IH35/20	30µm ID, flat 35°C
Human Serum Albumin	Irvine Scientific	9988
IVF One well dish	Falcon	353653
Mineral Oil for embryo culture	Irvine Scientific	9305
Modified HTF Medium	Irvine Scientific	90126	Hepes-Buffered medium
Nuclon Delta Surface	Thermofisher scientific	176740	IVF dish 4-well plate with sliding lid
Primaria Cell culture dish	Corning	353802	60x15mm
Reproplate	Kitazato	83016
Serological pipette	Falcon	357551	10ml
Sterile disposable Gilson tips	Eppendorf	0030 075.021	200µl
Tubing Kit	Provided by the genetic lab		PCR tubes (0.2mL), loading solution, biopsy washing solution
Vitrification media	Kitazato	VT801	Equilibration and vitrification solutions
Warming media	Kitazato	VT802	Thawing and dilution solutions