ヒト胚盤胞生検とガラス化

要約

胚盤胞生検およびガラス化は、移植前遺伝子検査を効率的に行うために必要とされる。5-7日目のゾナ・ペルシダの順次開きと7-8型栄養細胞の検索を伴うアプローチは、必要な操作の数と、最適でない環境条件への胚の暴露の両方を制限する。

要約

胚盤胞生検は、移植前遺伝子検査を伴うIVFサイクル中に信頼性の高い遺伝子診断を得るために行われる。次に、理想的なワークフローは、診断技術のターンアラウンドタイムに起因する安全で効率的なガラス化プロトコルを伴い、選択した胚を以下の自然サイクルで生理学的子宮内膜上に移す。ゾーナ・ペルシダの順次開きと5-10型血球細胞の検索(理想的には7-8)を包含する生検アプローチは、必要な操作の数と胚の暴露の両方を最適でない環境条件に制限する。適切なトレーニングの後、この技術は、生検のタイミング(約8分、1皿当たりの生検に基づく胚数に基づく3〜22分の範囲)、決定的な診断(約97.5%)の点で、異なるオペレータ間で再現可能であった。ガラス化された温められたユープロイド胚盤胞転移後の出生率(>40%)。生検、ガラス化および温暖化後の生存率は99.8%と高かった。温暖化から1.5時間での再膨張率は97%と高く、生検とガラス化(理想的には≤30分)、胚盤胞形態の質および生検の日の間のタイミングに大きく依存した。一般に、崩壊した胚盤胞を活性化する方が良い。したがって、非PGTサイクルでは、レーザー支援人工収縮が凍結保存前に胚の崩壊を誘発するために行われる可能性がある。最も有望な将来の視点は、胚性DNAの移植源としての胚盤胞培養後のIVF培養培地の非侵襲的分析である。しかし、この潜在的な前衛的な可能性はまだ調査中であり、信頼性の高いプロトコルを定義し、検証する必要があります。

概要

現代の人間発生学の主な目標は、刺激されたサイクルあたりの出生数を最大化し、妊娠を達成するためのコスト、時間、努力を削減することです。この目標を達成するためには、IVFサイクル中に得られたコホート内の生殖能力のある胚を同定するために、胚選択のための検証されたアプローチを採用すべきである。最新の証拠によると、胚盤胞培養1は、包括的な染色体試験およびガラス化温温化胚移植(ET)と組み合わされ、IVF効率を高めるための最も効率的な^{フレームワーク2}である。明らかに、無気力検査は胚標本を必要とし、現在のところ、現在は、妊娠中に胚附属書(例えば、胎盤)に起源を与える胚盤胞のセクションから取り出される少数の細胞から主に表される。.核型解析を超えて、単一遺伝子変異も、移植前遺伝子検査(PGT;-A、構造染色体再配列のための-SR、単原性疾患の-M)として知られている臨床戦略の一部としてTE生検から評価される可能性があります。他の卵母細胞/胚生検法は、過去数十年にわたって理論的に採用され、すなわち極性体生検および胚盤胞生検を採用している。しかし、その手続き上の欠点(例えば、より高いワークロードと生殖への影響のリスク)と診断の制限(例えば、単一細胞分析の問題)が暗黙的にコスト、リスクとリスクの間の十分なバランスを妨げるので、その使用は、今日では減少しています。利点 (レビュー^{については、3}を参照してください)。

本論文では、TE生検の主なプロトコルの1つを、その後のガラス化、温暖化および転送手順と共に徹底的に説明する。ここで概説されているワークフローは、ビジーな PGT ユニットに最適です。

我々のグループ4、5によって既に述べたように、手順は完全に膨張した胚盤胞のゾナ・ペルシダの逐次開きおよび少数のTE細胞の除去を含む(平均7-8)。3日目のレーザーアシストハッチングベースの胚盤胞生検法6と比較して、この手順は、胚盤胞生検やガラス化などの繊細な手順をタイムリーに行わなければならないIVFユニットの毎日のスケジュールを容易にする可能性があります。胚盤胞が完全な拡張に達するとすぐに、生検は除去するTE細胞を選択することによって行うことができ、それによって内細胞塊(ICM)のヘルニアのリスクを防ぎ、それ以外の場合は手順を困難にするであろう。文献では、胚盤胞生検の第3のプロトコルも記載されており、これは、胚が既に胚盤胞期に達した後に行われるレーザー支援孵化を伴い、手順5、7の数時間前に行われる。しかし、このアプローチはより時間がかかり、主に経験豊富なオペレータの手にTE生検を実装しているIVFユニットに適しており、適度に低い毎日のワークロードを考慮しています。

細胞内血漿中精子注射(ICSI)8は、IVFで遺伝子解析を行うことを目指す場合の統合技術であるべきである。同様に、胚盤胞段階に胚を安全に収穫するための適切な培養システムは、TE生検戦略の実施にとって極めて重要である。十分な数のインキュベーター、ならびに低酸素張力の使用は、この目的のために重要な前提条件であり、胚盤胞率9を損なわない。同時に、PGTサイクルを安全に管理するためには、効率的な凍結保存プログラムが必要です。過去10年間で、ガラス化の実施は、胚の凍結生存率を最大>99%10、11まで高めました。これは、遺伝子検査を行い、次の月経周期への胚移植を延期するのに十分な時間を提供し、非刺激的でおそらくより受容性の子宮内^膜12に。

TE生検とガラス化の両方が厳しいスキルを必要とするタスクを要求しており、その有効性は経験の浅いオペレータによって異なる可能性があります。したがって、特定のトレーニング期間は、各オペレータが臨床的にこれらの手順を実行できるようにする前に提唱されます。さらに、凍結保存および生検手順の主要業績評価指標(KPI)を監視することにより、オペレータのスキルの維持を定期的に評価する必要があります。各IVFクリニックは、この目的に内部KPIを設定する必要があり、これは国際コンソーシアムによって公開されたものや参照ラボによって発表された結果を概算する必要があります。

TE生検、ガラス化温暖化および目撃手順は、3つの以前の出版物11、13、14で報告されているように関与するすべてのオペレータ間で標準化された私達の単位で検証された技術である。.

プロトコル

ここで説明するヒト胚盤胞生検のプロトコルは、G.EN.E.R.A. 人間研究倫理委員会のガイドラインに従う。

注:必要な材料については、材料の表を参照してください。さらに必要な材料は、実験室の履物および衣装、外科フェイスマスク、ヘアカバー、外科手袋、永久的な非毒性マーカー、鉗子および消毒剤を伴う。外科ガウン、使い捨て外科手袋、フェイスマスク、ヘアカバーの使用は汚染の危険を防ぐために必須である。すべての作業領域、およびプロセスに関与する機器は、任意の手順を開始する前に、実験室の消毒剤(例えば、Oosafe)で徹底的に洗浄する必要があります。使用されるすべての消耗品および媒体は無菌で、個別に包装されるか、または引用符で囲まれるべきである。生検およびチューブ用の専用ワークステーションを使用し、手順に関与するオペレータ(胚学者および目撃者)にのみエリアへのアクセスを制限することが示唆されています。

1. 生検手順前日の準備

1. 生検後の培養皿を準備します。
   1. IVF培養皿に20μL IVF培養培地(材料表)の6滴を置き、胚培養用の予め温められた鉱物油を6mLでオーバーレイする(材料の表)。
   2. 各滴にさらに10μLのIVF培養培地を加えます。制御された雰囲気で37°Cで一晩インキュベートする(5%O 2、6%CO2)。
2. 生検後に胚盤胞をすすいで用するIVF皿4ウェルプレートを調製する。
   1. 最初の2つのウェルに600 μLのIVF培養培地を配置し、胚培養用の予め温められた鉱物油を300μLでオーバーレイします。
   2. 制御された雰囲気で37°Cで一晩インキュベートする(5%O 2、6%CO2)。
3. TEセルチューブに使用する各PCRチューブに1.5 μLのローディング溶液(材料の表)を分配し、それを回転させ、4°Cに保ちます。

2. 生検手術当日の準備

1. 生検皿を準備します。
   1. IVF培養皿に10μL HEPESバッファー培地(ヒト血清アルブミンを補充)(材料の表)を3滴を連続して置きます。
   2. 利用可能な胚盤胞の数に応じてステップ1.1.1を繰り返し(1皿あたり最大4回の胚盤胞)、胚培養用の予め温められた鉱物油の6 mLでオーバーレイする。
   3. 生検手順を行う前に、少なくとも1時間37°Cで皿をインキュベートします。

3. 胚盤胞の選択とグレーディング

1. その拡張とICMおよびTEの形態学的外観に従って胚盤胞を等級付けする(図1)。
   注:採点基準はガードナーとスクール^{クラフト15}から適応されており、以前にCapalboらとCimadomoら4,11によって説明されています。
   1. サイズと拡張グレードを定義します:完全に孵化した胚盤胞の場合はA、ハッチング胚盤胞の場合はB、完全に膨張した胚盤胞の場合はC、拡張されていない胚盤胞の場合はD(これらの胚は7日目までさらに拡張しなかった場合にのみ生検されます)。
   2. ICM グレードを定義する: いくつかの厳密にパックされたセルを持つ顕著な ICM の場合は 1。2 は、いくつかのが、大まかにパックされたセルで識別可能です。3 非常に少数の低品質の細胞と区別するのが難しい場合。
   3. TE グレードを次のように定義します: 1 複数の細胞を持つ適切に組織化された上皮;少数の細胞を持つ緩い上皮のための2;少数および/または大きい低品質の細胞のための3。

4. トロフェクトーダーム生検

1. すべての実行可能な完全に拡張された胚盤胞(好ましくはサイズおよび拡張のためのC等級)にTE生検を行う。
2. 各生検手順の保持と生検ピペットを設定します。生検ピペットのための推薦は次のとおりです:30 μmの内部直径、35°曲がる角度、曲がる0.75 mmの間隔の先端。
3. 患者の詳細(女性の名前と姓、生年月日とID)で生検皿にラベルを付け、胚とサイクルIDで各ドロップに番号を付けます。永久的な非毒性マーカーを使用してください。
4. 300 μmストリッピングピペットで胚盤胞を生検皿の最初の滴に移し、培養培地の過剰を除去するためにそれをすすいでください。その後、生検皿の2番目の滴で胚盤胞を動かす。
5. 皿を反転顕微鏡に移動し、生検皿の3番目の滴からいくつかの媒体を吸引する生検ピペットをプライム。
6. 20倍の倍率で、胚盤胞を向いてICMを明確に見る。7時に可視化すると(TE細胞を除去する対象となる領域とは反対)、保持ピペット上の胚を固定する(図2a)。
7. ゾーナ・ペルシダに焦点を当て、ピペットと胚盤胞の両方が同じ焦点面上にあることを確認します。
8. レーザーの目的(パルス時間0.3ミリ秒、6.5 μm)に切り替え、レーザーポインタをICMの反対側のゾーナ・ペルシダに置きます。2-3レーザーパルス(図2b)を通してゾーナペルシダをドリルします。
9. 生検ピペットをゾナ・ペルシダに対して静かに押し、TE細胞を内部表面から切り離し、胚盤胞崩壊を促進するために、違反を通していくつかの媒体を吹き飛ばす(図2c)。
10. TE が取り外されると(図 2d)、穴を通して入力し(必要に応じて、最後のレーザーパルスで広くする)、少数のTE細胞(理想的には7−8 13、16)を穏やかな吸引で生検ピペットに吸引する(図2e)。
11. 標的細胞を伸ばすために適度な吸引を加えながら、生検ピペットを後方に少し動かす(図2f)。
12. 吸引細胞の最も薄い部分にレーザーを向け、細胞間の接合部で2-5レーザーパルスを発射し、標的細胞を胚の体内から分離する(図2g)。レーザーパルスのタイミングとパルス数は、胚盤胞の品質に応じて調整することができます。しかし、細胞のリシスを避けるためにそれらを最小限に抑えるようにしてください。
13. 胚盤胞からTE断片を分離した後(図2h)、胚盤胞から遠く離れた同じ生検滴に放出する。これは、生検ピペットに再び吸い込まれるのを防ぐために必要です(図2i)。
14. 保持ピペットから胚盤胞を解放し、フラグメントがそれらに付着するのを防ぐために、速やかに両方のピペットを上げます。
15. 品質管理を目的とした生検断片の写真を撮る(図3)。
    注:単一の胚盤胞が手順ごとに生検される場合(生検皿ごとに4つまで)、胚間のクロスコンタミネーションを防ぐために新しいピペットで生検ピペットを変更します。
16. 手順 4.1−4.13を繰り返します。
17. 生検皿を層状の流れフードに戻します。
18. 生検後の培養皿にカップルIDを付け、各ドロップに胚とサイクルIDを付けます。
19. 目撃者の存在下で、きれいなIVF培地で胚盤胞をすすいで、最後に生検後の皿の対応する滴に移動します。
20. 生検後の皿を制御された雰囲気(37°C、6%CO2、5%O2)でガラス化するまでインキュベーターに移動します。胚盤胞の再膨張を防ぐために、生検手順から30分以内にガラス化を行うことをお勧めします。

5. チューブ

注:全体の手順は、目撃者の存在下で、室温で層流フード内で行う必要があります。手順中は、PCRチューブを氷上の冷たいチューブラックに保管してください(補足図1)。

1. PCRチューブに永久的な非毒性マーカーを貼ります。
   注:ラベリングは、遺伝実験室の要求に応じて行われるべきである。一般に、患者の名前と姓(イニシャル)、カップルID、胚およびサイクルID(例えば、JD 12345 1.2の2番目のサイクルの胚N.1の場合、そのカップルIDは12345である)。胚IDは、チューブの本体上の文字でも報告されるべきです。
2. 60mm x 15mm培養皿(チューブ皿)の蓋に生検胚の本状(補足図1)を貼り付け、生検洗浄液(材料表)を2回2回用意します。
3. 140 μm ストリッピングピペット(補足図1)を、チューブ皿の2滴目から生検洗浄液でプライムする。
4. TE 断片を簡単に視覚化するために、立体顕微鏡の下に生検皿を置きます。
5. TE フラグメント上のいくつかの生検洗浄溶液を穏やかに放出します。その後、ストリッピングピペットにロードします。
6. TE フラグメントをチューブ皿の生検洗浄液の 2 滴目に移動し、慎重に 2~3 回すすいでください。
7. TE フラグメントを PCR チューブの底部 (以前は後にラベル付け) にローディング ソリューションで転送し、ストリッピング ピペットの先端で壁に触れないように注意してください。
8. TE フラグメントごとにステップ 5.3 からステップ 5.7 までの手順を繰り返し、TE フラグメントごとに新しい毛細血管を使用するように注意してください。
9. チューブ手順の最後に、すべてのPCRチューブをミニ遠心分離機に入れ、数秒間回転させます。
10. 検体を-20°Cで保管し、検査のために参照遺伝子実験室に出荷します。

6. 胚盤胞ガラス化

1. TE生検から30分以内に破傷球体を破壊し、再膨張を防ぐ。
2. ガラス化プレートに女性の詳細とガラス化する必要がある胚盤胞の本証をラベル付けします。
3. 女性の名前と姓、カップルID、それにロードされる胚のID、および手順の日付とガラス化サポートにラベルを付けます。非常に低い温度(-196 °C)でも完全性を維持する特別な凍結ラベルが使用されます。
4. 室温で、ガラス化される各胚盤胞に対して0.3mLの平衡溶液(ES)(材料表)を分配する。
5. 証人の存在下で、300 μmストリッピングピペットを使用してESで胚盤胞を動かします。
6. 胚盤胞をESに13~15分間放置します。ボリュームの最初の収縮後、徐々に再膨張が観察されます。
7. 液体窒素(LN2)で小さな冷却ラックを充填し、層流フードの下に置きます。
8. 第2井戸に300μLのガラス化溶液(VS)(材料表)を分配する。胚盤胞が完全に再膨張した後、VS溶液中に1分間移し、ESを希釈するためにそれをすすいで下す。
9. 証人の存在下で、ガラス化支持体に胚盤胞をロードし、VSの過剰を除去する世話をする。溶液の微妙なフィルムは、胚盤胞を囲む必要があります。
10. LN₂にガラス化支持体を突入させ、試料に近い気泡形成のリスクを低減するために精力的に動かします。
11. ガラス化支持体をLN₂に沈めたまま保護キャップを置き、保護キャップを設置します。
12. 目撃者の存在下で、長期LN2貯蔵タンクでガラス化支持体を移動する。

7. 非生検胚盤胞の人工収縮

1. TE生検が行われなかった場合は、ガラス化の直前に胚盤胞を人工的に崩壊する(図4)。
   1. 培養皿をインキュベーターから反転顕微鏡に移動し、選択した胚に焦点を当てます。
   2. レーザー目的(あらかじめ設定されたパルス:0.3ミリ秒、6.5 μm)に切り替え、ICMの反対側にあるゾーナ・ペルシダをターゲットにしてから、ICMから安全な距離でTE細胞間の接合部に1~2のレーザーパルスを向けます。胚盤胞は5分以内に崩壊する必要があります。
2. セクション6に記載されているように崩壊した胚盤胞のガラス化を進めます。

8. 転移性胚盤胞温暖化

1. ETの日に、各ウェルに予め平衡化されたIVF培地の600μLを配置してET4ウェルプレートを調製する。制御された雰囲気で37°Cでインキュベート(5%O 2、6%CO2)、胚盤胞の温暖化を行います。
2. 女性の名前と姓、カップルID、その中で温める胚のIDで暖かい料理にラベルを付けます。
3. IVFワンウェル皿(補助図1)に解凍液(TS)の1mLを分配し、手順を開始する前に少なくとも1時間サーモスタットで37°Cに温めます。
4. LN₂で小さな冷却サポートを充填し、作業領域の近くに層流フードに置きます。
5. 手順を開始する前に、ガラス化サポートに報告された胚盤胞情報を確認してください。すべての暗号は遺伝的報告書と一致し、温める胚盤胞は転移可能なものの中から選択されなければならない。手順中にミラーリング監視が必要です。
6. 温めたTSを含むワンウェル皿をサーモスタットから取り出し、立体顕微鏡の下で加熱されたステージに置きます。
7. 鉗子を使用してLN₂内の保護キャップを引っ張ります。
8. ガラス化サポートの先端を37°C TSに素早く突っ込む。
9. 顕微鏡観察では、胚盤胞が先端から放出されるまで、ガラス化支持体を穏やかに動かす。
10. 胚盤胞をTSで合計1分間放置し、TSの下部に保つことに注意を払います。
11. 室温でガラス化板の最初の井戸に200μLの希釈溶液(DS)(材料の表)を分配する。
12. 胚盤胞をDSに移し、ウェルの下部に置き、その上にいくつかのTSを放出してグラデーションの一種を作成します。3分間放置してください。
13. 2つの異なった井戸(WS1およびWS2)の洗浄液(WS)の200 μLを分配する。
14. 胚盤胞をWS1に移し、その上にいくつかのDS媒体を放出しながら、井戸の底に置きます。その後、胚盤胞をWS2に移し、1分間邪魔しないままにしておきます。
15. 女性の名前と姓、カップルID、その中で培養される胚のIDで、温暖化後のETプレートにラベルを付けます。
16. 証人の存在下で、温めた胚盤胞を、温暖化後ETプレートの予め平衡培養培地に移す。
17. ETプレートの最初のウェルで胚盤胞をすすいで、2番目の井戸に入れます。
18. 制御された雰囲気(37°C、6%CO 2、5%O2)で温めた後培養皿をインキュベーターに移し、その生存と再膨張を確認する前に、少なくとも1.5時間胚盤胞を培養する。
    注:図5は、退化した、クライオが生き残ったが、再膨張および凍結生き残った、完全に拡張された胚盤胞の例を示す。

9. 胚移植

1. ETを実行するには、層流フードの加熱された段階に皿を置き、胚が低倍率で顕微鏡の下に見えるようにする。
2. IVF培養培地の約0.4mLを取る。シリンジ先端を内部カテーテルの受け入れ側にしっかりと固定し、0.1 mLまで培地を放出します。
3. カテーテルに入る胚を観察するまで培養培地を吸引する(培地の最小量:10−15μL)。
4. カテーテルをプラスチックケースに入れ、手術室に行き、内部カテーテルを外部ガイドに入します。
5. 子宮に達したら、注射器プランジャーを押して胚を放出します。プランジャーが0.1 mLを読み取るまで、培地を非常にゆっくりと放出します。
6. カテーテルを研究室に持ち帰り、胚が移されたことを顕微鏡で確認します。

結果

図6は、プロトコルを標準化し、各オペレータのパフォーマンスを監視するために採用することができる生検手順のすべての結果のスキームを表す。主な手続き上の結果は、生検/生検を完了するタイミングです。主な技術的結果は、決定的または決定的な診断をもたらす可能性のある遺伝子検査後に生成されたプロットの品質であり、後者は未?...

ディスカッション

訓練期間を修了した経験豊富な熟練した胚学者のみが、TE生検と胚盤胞ガラス化の両方を行う必要があります。さらに、生検皿(補助図1)から生検後皿への生検胚盤胞の動き(補足図1)の手順を監視し、効率的なトレーサビリティを保証するために証人が必要です(補足図1))、次にガラス化プレート(補足図1)に、最後にガラス化支持体(補足図1)へ?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Cold tube rack	Biocision	XTPCR96
Electronic pipette controller	Fisher Scientific	710931
Flexipet adjustable handle set	Cook	G18674	Stripper holder
Gilson Pipetman	Gilson	66003	p20
IVF Electronic Witness System	CooperSurgical Fertility & Genomic Solutions		RI Witness ART Management System
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TE2000-U
Laminar Flow Hood	IVF TECH		Grade A air flow
Laser objective	RI	Saturn 5
Microinjectors	Nikon Narishige	NT-88-V3
Mini centrifuge for PCR tubes	Eppendorf	CSLQSPIN	for 0.2ml PCR tubes
Stereomicroscope	Leica	Leica M80
Thermostat	Panasonic	MCO-5AC-PE
Tri-gas incubator	Panasonic	MCO-5M-PE	02/CO2
Consumables
Biopsy pipette	RI	7-71-30FB35720	30µm ID, flat 35°C
Cryolock	Cryolock	CL-R-CT
CSCM complete	Irvine Scientific	90165	IVF culture medium supplemented with HSA
Embryo Transfer Catheter	Cook	G17934
Flexipet pipette	Cook	G26712	140µm stripping pipette tip
Flexipet pipette	Cook	G46020	300µm stripping pipette tips
Holding pipette	RI	7-71-IH35/20	30µm ID, flat 35°C
Human Serum Albumin	Irvine Scientific	9988
IVF One well dish	Falcon	353653
Mineral Oil for embryo culture	Irvine Scientific	9305
Modified HTF Medium	Irvine Scientific	90126	Hepes-Buffered medium
Nuclon Delta Surface	Thermofisher scientific	176740	IVF dish 4-well plate with sliding lid
Primaria Cell culture dish	Corning	353802	60x15mm
Reproplate	Kitazato	83016
Serological pipette	Falcon	357551	10ml
Sterile disposable Gilson tips	Eppendorf	0030 075.021	200µl
Tubing Kit	Provided by the genetic lab		PCR tubes (0.2mL), loading solution, biopsy washing solution
Vitrification media	Kitazato	VT801	Equilibration and vitrification solutions
Warming media	Kitazato	VT802	Thawing and dilution solutions