ביופסיה של האדם בלסטוציסטה וויטריפיקציה

Summary

ביופסיה blastocyst ו ויטריפיקציה נדרשים ביעילות לבצע בדיקה גנטית מראש השרשה. גישה הדורשת את הפתיחה הרציפה של הסונה והחזרת התאים ה7-8 של תאי העור ביום 5-7 שלאחר ההפריה מגבילה גם את מספר המניפולציות הנדרשות ואת חשיפת העובר לתנאי הסביבה האופטימליים.

Abstract

ביופסיה blastocyst מבוצעת כדי לקבל אבחנה גנטית אמינה במהלך מחזורי IVF עם השרשה גנטית בדיקות. אז, זרימת העבודה האידיאלית כרוך פרוטוקול ויטריפיקציה בטוח ויעיל, בשל זמן הטיפול של טכניקות אבחון ולהעביר את העובר הנבחר (של) על רירית המין הפיזיולוגי במחזור הטבעי הבא. גישה ביופסיה המקיף את הפתיחה רציפים של הסונה pellucida ושליפה של 5-10 תאי עור trophectoderm באופן אידיאלי 7-8) מגביל הן מספר המניפולציות הנדרשות ואת החשיפה של העובר לתנאים סביבתיים תת אופטימלית. לאחר אימון נאות, הטכניקה היתה להיות מיויית על פני מפעילי שונים במונחים של עיתוי של ביופסיה (~ 8 דקות, החל 3-22 דקות מבוסס על מספר העוברים ביופסיה לכל מנה), אבחנות מכרעת שהתקבלו (~ 97.5%) ושיעורי לידה חיים לאחר העברת-העברה שחומם-אאופואיד-בליילויד (> 40%). שיעור ההישרדות לאחר ביופסיה, ויטריפיקציה והתחממות היה גבוה כמו 99.8%. שיעור ההתרחבות מחדש ב 1.5 h מהתחממות היה גבוה כמו 97%, תלוי בעיקר בעיתוי בין ביופסיה ו ויטריפיקציה (באופן אידיאלי ≤ 30 דקות), בלסטוציסט באיכות וביום של ביופסיה. באופן כללי, עדיף להתקשות לכווץ בלסטוציסטה; לכן, במחזורים שאינם PGT, לייזר בסיוע מלאכותי הצטמקות עשוי להתבצע כדי לגרום לקריסה העובר לפני הקפאת ההזמנה. הפרספקטיבה העתידית המבטיחה ביותר היא ניתוח לא פולשני של התקשורת התרבותית IVF לאחר התרבות בלסטוציסט כמקור פיוטי של דנ א עובריים. עם זאת, האוונגרד הפוטנציאלי הזה עדיין תחת חקירה ופרוטוקול אמין עדיין צריך להיות מוגדר ומאומת.

Introduction

המטרה העיקרית של אמבריולוגיה האנושי המודרני היא למקסם את המספר לידות חי לכל מחזור מגורה ולהפחית עלויות, זמן ומאמצים כדי להשיג הריון. כדי להשיג מטרה זו, גישות מאומתות עבור בחירת העובר צריך להיות מועסק כדי לזהות עוברים מוכשרים מחדש בתוך מפרק שהושג במהלך מחזור IVF. על פי העדויות האחרונות, התרבות בלסטוציסט¹ בשילוב עם בדיקות כרומוזומלית מקיפה-העברת העובר התחמם העברה (ET) היא המסגרת היעילה ביותר כדי להגדיל את יעילות IVF². ברור, בדיקות אנאפלואידיה דורש דגימה עובריים, אשר בשלב זה מיוצג בעיקר מתאים מעטים שאוחזרו מן הטרופטועור (TE), כלומר, את הקטע של הבלסטוציסטה המעניקה מקור לספח העובר (למשל, השליה) במהלך ההריון . מעבר ניתוח קריוטיפ, גם מוטציות גן יחיד עשוי להיות מוערך מתוך ביופסיה TE כחלק אסטרטגיה קלינית המכונה השתלת מראש בדיקות גנטיות (pgt;-a עבור aneuploidies,-SR עבור הסדרים מבניים כרומוקטיביות,-M עבור מחלות מונוגניים). אחרים oocyte/העובר ביופסיה שיטות כבר תיאוריה ואימץ קלינית לאורך העשורים האחרונים, כלומר גופים קוטביים ביופסיה ו blastomere ביופסיה. עם זאת, השימוש שלהם מופחת כיום מאז החסרונות הפרוצדורליים שלהם (למשל, עומס עבודה גבוה יותר וסיכון להשפעה הרבייה) ומגבלות אבחון (g., ניתוח תא בודד בעיות) לעכב במרומז איזון מספיק בין עלויות, סיכונים יתרונות (עבור סקירה ראה³).

במאמר זה, אחד הפרוטוקולים העיקריים של TE ביופסיה מתוארת ביסודיות יחד עם ויטריפיקציה הבאים, מחמם והעברת הליכים נדרשים. זרימת העבודה כאן מחולקת היא אידיאלית עבור יחידת PGT עמוסה.

כפי שתואר כבר בעבר על ידי הקבוצה שלנו^4,5, ההליך כרוך פתיחה רציפה של הסונה pellucida של לחלוטין מורחב בלסטוציסטות והסרה של תאים TE מעטים (בממוצע 7-8). בהשוואה ליום 3 לייזר בסיוע בקיעה מבוסס ביופסיה שיטה⁶, הליך זה עשוי להקל על לוח הזמנים היומי של יחידת IVF שבו הליכים עדינים, כגון ביופסיה בלסטוציסט ו ויטריפיקציה, חייב להתבצע בעיתוי. ברגע שהציסטה הבלסטובה מגיעה להתרחבות המלאה שלה, הביופסיה יכולה להתבצע על ידי בחירת תאי ה-TE כדי להסיר, ובכך למנוע את הסיכון לפריצת המסה של התא הפנימי (ICM), אשר אחרת להפוך את ההליך מאתגר. בספרות, פרוטוקול שלישי של ביופסיה בלסטוציסט תוארה גם, אשר כרוכה הבקיעה בסיוע לייזר להתבצע פעם העובר כבר הגיע לשלב בלסטוציסט, כמה שעות לפני ההליך^5,7. עם זאת, גישה זו היא יותר זמן רב ובעיקר חליפות IVF כי הם ביצוע ביופסיה TE בידיים של מגבילים מנוסים מנוסה ולאור עומס עבודה יומי מתון נמוך.

הזרקת זרע תאיים (ICSI)⁸ צריכה להיות טכניקה מאוחדת אם מכוון לביצוע ניתוחים גנטיים בהפריה חוץ גופית. באופן דומה, מערכת התרבות הנכונה לקצור בבטחה עוברים לשלב בלסטוציסט הוא חיוני ליישום של האסטרטגיה ביופסיה TE. מספר הולם של אינקובטורים, כמו גם השימוש במתח חמצן נמוך הם תנאי מפתח למטרה זו, לא להתפשר על שיעור בלסטוציסטה⁹. באותו זמן, תוכנית הקריוגנית יעילה נדרשת כדי לנהל בבטחה מחזור PGT. בעשור האחרון, יישום ויטריפיקציה יש שיפרה העובר שיעורי ההישרדות אפילו עד > 99%^10,11. זה סיפק זמן מספיק כדי לבצע בדיקות גנטיות ולדחות העברת העובר אל המחזור הווסת הבא, על לא מגורה וכנראה יותר רירית האנדויום¹².

הן ביופסיה ו-ויטריפיקציה הם תובעניים משימות הדורשות מיומנויות קפדניות והאפקטיביות שלהם עשוי להשתנות בין אופרטורים לא מנוסים. תקופת הכשרה מסוימת היא לפיכך מאפשרת לכל מפעיל לבצע הליכים אלה קלינית; יתר על כן, התחזוקה של מיומנויות המפעילים צריך להיות מוערך מעת לעת על ידי ניטור מחוונים ביצועים מפתח (KPI) עבור הקפאת הזמנות ונוהלי ביופסיה. כל מרפאת IVF צריך להגדיר מחווני Kpi פנימיים למטרה זו, אשר חייב להיות מקורב אלה שפורסמו על ידי קונסורציומים הבינלאומי ו/או את התוצאות שפורסמו על ידי מעבדות התייחסות.

TE ביופסיה, הליכים ויטריפיקציה-התחממות ועדים הם טכניקות מאומת ביחידה שלנו, כי כבר מתוקננת על פני כל המפעילים מעורבים כדיווח בשלוש פרסומים קודמים^11,13,14 .

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

הפרוטוקול עבור ביופסיה של האדם בלסטוציסטה, כאן תיאר, עוקב אחר ההנחיות של הוועדה האנושית E.R.A. המחקר האנושי.

הערה: עיין בטבלת חומרים לחומרים הנדרשים. חומר נוסף נדרש כרוך הנעלה מעבדה התלבושת, מסכת מסיכה כירורגית, כיסוי שיער, כפפות כירורגי, סמן קבוע לא רעיל, מלקחיים וחיטוי. השימוש בחלוק כירורגי, כפפות ניתוח חד פעמיות, facemask, כיסוי שיער הוא הכרחי כדי למנוע סיכון של זיהום. כל תחומי העבודה, כמו גם את הציוד המעורב בתהליך, יש לנקות ביסודיות עם חיטוי מעבדה (g., Oosafe) לפני הפעלת כל הליך. כל החומרים והמדיה המשמשים צריך להיות סטרילי, ארוז או מצוטט בנפרד. הוא הציע להשתמש בתחנת עבודה ייעודית לביופסיה ואבובים ולהגביל את הגישה של האזור רק למפעילים המעורבים בהליך (embryologist ועדה).

1. הכנה ליום לפני הליך הביופסיה

1. הכינו את הצלחת תרבות פוסט ביופסיה.
   1. מקום 6 טיפות של 20 μL תרבות IVF בינונית (טבלה של חומרים) בצלחת תרבות IVF וכיסוי עם 6 מ ל של שמן מינרלים prewarmed לתרבות העובר (טבלת חומרים).
   2. הוסף עוד 10 μL של מדיום תרבות IVF לכל טיפה. המלון משלב בין לילה ב-37 ° c באווירה מבוקרת (5% O₂, 6% CO₂).
2. להכין מאכל IVF 4-צלחת לשטוף את בלסטוציסט לאחר ביופסיה.
   1. מקום 600 μL של מדיום תרבות IVF בשתי הבארות הראשונות ושכבת הכיסוי עם 300 μL של שמן מינרלים טרום שחומם לתרבות העובר.
   2. המלון משלב בין לילה ב-37 ° c באווירה מבוקרת (5% O₂, 6% CO₂).
3. לחלק 1.5 μL של טעינת פתרון (טבלת חומרים) בכל צינור PCR לשמש צינורות תאים TE, לסובב אותו ולשמור אותו ב 4 ° c.

2. הכנה ביום הליך הביופסיה

1. . הכן את צלחת הביופסיה
   1. מקום 3 טיפות של 10 μL HEPES-באגירה מדיום (שיושלם עם אלבומין סרום אנושי) (טבלת חומרים) ברציפות בצלחת תרבות IVF.
   2. חזור על השלב 1.1.1 לפי מספר בלסטוציסטות זמין (עד 4 blastocysts לכל מנה) ושכבת עם 6 מ ל של שמן מינרלים טרום מחומם לתרבות העובר.
   3. דגירה את הצלחת ב 37 ° c עבור לפחות 1 h לפני ביצוע הליך ביופסיה.

3. בחירת בלסטוציסטה וציון

1. כיתה the בלסטוציסט על פי התרחבות שלה מראה מורפולוגית של ICM ו-TE (איור 1).
   הערה: הקריטריונים לציון הותאמו מגארדנר ומכלי השיט¹⁵ ובעבר תיארו את קאלמבו ואח '. וסימדומו ואח '^4,11.
   1. להגדיר את גודל וכיתה הרחבה כמו: a עבור באופן מלא מקווקו בלסטוציסט, B עבור הבקיעה בלסטוציסט, C עבור בלסטוציסטה המורחבת במלואו, ו-D עבור מורחב לא בלסטוציסטה (העוברים האלה הם ביופסיה רק אם הם לא להרחיב יותר עד יום 7).
   2. להגדיר כיתה ICM: 1 עבור ICM בולט עם מספר תאים ארוזים בקפדנות; 2 להבחין עם מספר תאים אך בעלי ערך מלא; 3 קשה להבחין עם מעט מאוד תאים באיכות נמוכה.
   3. להגדיר כיתה TE כדלקמן: 1 עבור אפיתל מאורגן היטב עם מספר תאים; 2 עבור האפיתל רופף עם כמה תאים; 3 עבור מספר תאים ו/או גדולים באיכות נמוכה.

4. ביופסיה של הטרופטועור

1. לבצע ביופסיה על כל קיימא לחלוטין מורחבת blastocysts (רצוי C כיתה עבור גודל והרחבה).
2. הערכה החזקה וביופסיה של כל הליך ביופסיה. ההמלצות של הפיפטה ביופסיה הם הבאים: 30 יקרומטר קוטר פנימי, 35 ° זווית עיקול, 0.75 מ"מ טיפ מרחק להתכופף.
3. התווית את צלחת הביופסיה עם פרטי המטופל (שם האישה ושם המשפחה, תאריך לידה ותעודת זהות) ולאחר מכן מספר כל טיפה עם מזהי העובר ומחזור. השתמש בסמן קבוע שאינו רעיל.
4. להעביר את בלסטוציסט עם הצינורות 300 יקרומטר להתפשט לירידה הראשונה של צלחת ביופסיה ולשטוף אותו כדי להסיר את עודפי בינוני התרבות. ואז להעביר את הבלסטוציסטה בטיפה השנייה של צלחת הביופסיה.
5. הזז את הצלחת אל המיקרוסקופ הפוך, הממשלה את הפיפטה ביופסיה משכילות כמה בינוני מהטיפה השלישית של צלחת הביופסיה.
6. בהגדלה של 20x, האוריינט הבלסטוציסטה כדי לקבל תצוגה ברורה של ICM. כאשר הוא מדמיין בשעה 7 (מול האזור שיהיה מיועד להסיר את התאים TE), לאבטח את העובר על הצנרת האוחזת (איור 2a).
7. להתמקד על הסונה pellucida ולוודא כי הן הפיפטות ואת הבלסטוציסטה נמצאים על אותו מטוס מוקד.
8. לעבור למטרת לייזר (זמן הדופק 0.3 ms, 6.5 μm) ולמקם את מצביע הלייזר על הסונה pellucida בצד הנגדי של ICM. לקדוח את הסונה באמצעות 2 ל 3 פולסים בלייזר (איור 2b).
9. לחץ בעדינות על הפיפטה ביופסיה נגד הסונה pellucida ולפוצץ כמה בינוני באמצעות הפרה לנתק את התאים TE מהמשטח הפנימי שלה ולזרז התמוטטות בלסטוציסט (איור 2 ג).
10. לאחר TE מנותקת (איור 2d), להיכנס דרך החור (אם נדרש, לעשות את זה רחב יותר עם פולס לייזר האחרון) ומרוקן כמה תאים TE (באופן אידיאלי 7 על 8 שמונה^13,16) לתוך הפיפטה ביופסיה עם יניקה עדינה (איור 2d).
11. הזיזו מעט את הפיפטה ביופסיה לאחור תוך החלת יניקה מתונה כדי למתוח את תאי היעד (איור 2f).
12. לכוון את הלייזר לעבר החלק הדק של התאים מתים ולירות 2-5 פולסים לייזר בצמתים בין התאים כדי להפריד את תאי היעד מהגוף של העובר (איור 2g). העיתוי של פולסים בלייזר ואת מספר פולסים ניתן לכוונן בהתאם לאיכות של הבלסטוציסטה; עם זאת, נסה למזער אותם כדי להימנע מפירוק תאים.
13. לאחר ההפרדה של קטע TE מן הבלסטוציסטה (איור 2h), לשחרר אותו לתוך ביופסיה באותו טיפה הרחק מתוך בלסטוציסט. זה נחוץ כדי למנוע מהם להישאב שוב לתוך הפיפטה ביופסיה (איור 2i).
14. שחררו את בלסטוציסטה מהפיפטה האוחז והרימו מיד את שני הפיפטות כדי למנוע מרסיס לדבוק בהם.
15. צלם תמונה של קטע הביוביופסיה למטרת בקרת איכות (איור 3).
    הערה: אם יותר מאשר בלורית אחת היא להיות ביופסיה לכל הליך (עד ארבע לכל צלחת ביופסיה), לשנות את הפיפטה ביופסיה עם אחד חדש כדי למנוע זיהום צולב בין העוברים.
16. חזור על שלבים 4.1 ל4.13.
17. להעביר את צלחת הביופסיה. חזרה למכסה הזרימה
18. תייג את קערת התרבות שלאחר הביופסיה עם מזהה הזוג, וכל טיפה עם העובר ומזהה המחזור.
19. בנוכחות של עד, לשטוף את בלסטוציסטה נקי IVF בינוני, ולבסוף להעביר אותו לירידה המקבילה שלה לאחר הביופסיה צלחת.
20. להעביר את הצלחת פוסט ביופסיה לחממה באווירה מבוקרת (37 ° c, 6% CO₂, 5% O₂) עד ויטריפיקציה. מומלץ לבצע ויטריפיקציה בתוך 30 דקות מהליך הביופסיה, כדי למנוע התרחבות מחדש בלסטוציסט.

5. אבובים

הערה: כל ההליך חייב להתבצע בנוכחות עד ובתוך כיסוי הזרימה הבינארי בטמפרטורת החדר. במהלך התהליך, שמרו את צינורות ה-PCR במתלה שפופרת קר על הקרח (איור משלים 1).

1. תייג את צינורות ה-PCR. עם סמן קבוע שאינו רעיל
   הערה: יש לבצע את התיוג כפי שהתבקש על ידי המעבדה הגנטית. באופן כללי, שם החולה ומשם המשפחה (ראשי תיבות), מזהה הזוג, מזהה העובר ומחזור (למשל: JD 12345 1.2 עבור העובר N .1 של מחזור 2 שייך לפלונית אלמונית שמספר הזיהוי שלהם הוא 12345). מזהה העובר יש לדווח גם באותיות על גוף השפופרת.
2. התווית את המכסה של 60 מ"מ x 15 מ"מ ממנה התרבות (צלחת אבובים) עם מזהי ביופסיה (איור המשלים 1) ולהכין 2 10 μl טיפות של פתרון כביסה הביופסיה (טבלת חומרים) בו.
3. הממשלה 140 יקרומטר בנוכחות הפיפטה (איור משלים 1) עם פתרון כביסה כמה ביופסיה מן הטיפה השנייה של צלחת אבובים.
4. מניחים את הצלחת ביופסיה תחת stereomicroscope כדי להמחיש בקלות את הרסיס TE (s).
5. שחררו בעדינות את הפתרון לשטיפת ביופסיה על מקטע ה-TE; אז, לטעון אותו לתוך הפיפטה החשפנות.
6. הזז את קטע ה-TE לירידה השנייה של פתרון כביסה ביופסיה בצלחת אבובים ושטוף בזהירות את זה 2-3 פעמים.
7. העבר את מקטע ה-TE לחלק התחתון של צינור ה-PCR (המסומן בעבר לאחר מכן) עם פתרון העמסה, שים לב כדי להימנע מלגעת בקירותיו בקצה של הפיפטה ההתפשט.
8. חזור על ההליך משלב 5.3 לשלב 5.7 עבור כל מקטע TE, שם לב להשתמש בקפילר חדש עבור כל מקטע TE.
9. בסוף ההליך אבובים, לשים את כל צינורות ה-PCR בצנטריפוגה מיני, ולסובב אותם כמה שניות.
10. אחסן את הדגימות ב-20 ° c עד שילוח המעבדה הגנטית המפנה לבדיקות.

6. בלסטוציסטה ויטריפיקציה

1. Vitrify התמוטט blastocysts בתוך 30 דקות מ-TE ביופסיה כדי למנוע התרחבות מחדש שלהם.
2. סמן את הלוחית הויטריפיקציה עם פרטי האישה ואת המזהים של הבלסטיציסטות שחייבות להיות מיושמות.
3. סמן את התמיכה הויטריפיקציה (ים) עם שם האישה ושם המשפחה, מזהה הזוג, מזהה העובר שייטען על זה, כמו גם תאריך של ההליך. הקריואלים מיוחדים משמשים אשר שומרים על שלמות שלהם גם בטמפרטורה נמוכה מאוד (-196 ° c).
4. בטמפרטורת החדר, לחלק 0.3 מ ל של פתרון שיווציה (ES) (טבלת חומרים) עבור כל בלסטוציסטה כי יהיה מתכלה.
5. בנוכחות של עד, להזיז את הבלסטוציסטה ES באמצעות הפיפטה 300 יקרומטר להתפשט.
6. להשאיר את הבלסטוציסטה ב-ES במשך 13-15 דקות. לאחר הצטמקות הראשונית של הכרך, התרחבות מחדש הדרגתית תהיה נצפתה.
7. ממלאים ארון קירור קטן עם חנקן נוזלי (LN₂) ומניחים אותו מתחת למכסה הזרימה הבינארי.
8. לוותר 300 μL של פתרון ויטריפיקציה (VS) (טבלת חומרים) בבאר השנייה. לאחר התפשטות בלסטוציסט להשלים הרחבה מחדש, להעביר אותו בפתרון VS עבור 1 דקות ולשטוף אותו כדי לדלל את ES.
9. בנוכחות של עד, לטעון את בלסטוציסטה על התמיכה ויטריפיקציה ולטפל הסרת עודף של VS. סרט עדין של הפתרון צריך להקיף את הבלסטוציסטה.
10. לצלול את התמיכה ויטריפיקציה לתוך LN₂ ולהעביר אותו במרץ כדי להפחית את הסיכון של היווצרות בועה קרוב הדגימה.
11. הניחו את כובע המגן תוך שמירה על התמיכה הויטריפיקציה הנמצאת מתחת ל_{-LN 2.}
12. בנוכחות עד, הזיזו את התמיכה הויטריפיקציה במיכל אחסון בטווח הארוך LN₂ .

7. הצטמקות מלאכותית של הביו-ביוסטוציסטות

1. אם לא מתנהל ביופסיה TE, לכווץ באופן מלאכותי את blastocysts מיד לפני ויטריפיקציה (איור 4).
   1. הזיזו את המנה התרבותית מהאינקובטור למיקרוסקופ ההפוך והתרכזו בעובר הנבחר.
   2. מעבר למטרת לייזר (פולס טרום להגדיר: 0.3 ms, 6.5 μm), המטרה את הסונה pellucida בצד הנגדי של ICM, ואז ישיר 1 – 2 פולסים לייזר לצמתים בין תאים TE במרחק בטוח מ-ICM. הציסטות הבלסטוכי אמורות להתמוטט בתוך פחות מ -5 דקות.
2. המשך עם הויטריפיקציה של בלסטוציסטה המכווצת כמתואר בסעיף 6.

8. להעברה בלסטוציסטה התחממות

1. ביום של ET, להכין את הצלחת ET 4-הבאר על ידי הצבת 600 μL של מדיום בינוני התרבות IVF עבור כל טוב. מודטה ב 37 ° c באווירה מבוקרת (5% O₂, 6% CO₂), תוך ביצוע התחממות בלסטוציסטה.
2. סמן את המנה המחמם עם שם האישה ושם המשפחה, מזהה הזוג, מזהה העובר שיהיה מחומם בו.
3. חלק 1 מ ל של הפתרון הפשרה (TS) (טבלה של חומרים) בתבשיל IVF-באר אחת (איור משלים 1) ולחמם אותו 37 ° c בתרמוסטט עבור לפחות 1 h לפני תחילת ההליך.
4. ממלאים תמיכה בצינון קטן עם LN₂ ומניחים אותו במכסה הזרימה הלבינארי בקרבת אזור העבודה.
5. לפני תחילת השגרה, בדוק את מידע הבלסטוציסטה המדווח בתמיכה הויטריפיקציה. כל המזהים צריך להתאים את הדוח הגנטי ואת בלסטוציסט להתחמם חייב להיבחר בין אלה הניתנים להעברה. . העד נדרש במהלך הניתוח
6. קח את המנה האחת המכילה TS מחומם מתוך התרמוסטט ומניחים אותו על הבמה מחומם תחת stereomicroscope.
7. משוך מעל כובע מגן בתוך LN₂ באמצעות מלקחיים.
8. לצלול במהירות את קצה התמיכה הויטריפיקציה לתוך 37 TS מעלות צלזיוס.
9. תחת התבוננות מיקרוסקופית, להעביר בעדינות את התמיכה ויטריפיקציה עד הבלסטוציסטה שוחרר מהקצה.
10. להשאיר את הבלסטוציסטה עבור סך של 1 דקות ב-TS, לשים לב כדי לשמור אותו בתחתית של TS.
11. בטמפרטורת החדר לוותר 200 μL של תמיסת דילול (DS) (טבלת חומרים) על הבאר הראשונה של צלחת ויטריפיקציה.
12. להעביר את בלסטוציסט ל DS ולמקם אותו בתחתית הבאר תוך שחרור כמה TS על החלק העליון של זה כדי ליצור מעין הדרגתי. . תשאיר את זה למשך 3 דקות
13. לחלק 200 μL של פתרון כביסה (WS) ב 2 בארות שונות (WS1 ו WS2).
14. להעביר את בלסטוציסט כדי WS1 ולמקם אותו על החלק התחתון של הבאר תוך שחרור כמה מדיום DS על החלק העליון של זה. ואז להעביר את הבלסטוציסטה כדי WS2 ולהשאיר אותו ללא הפרעה עבור 1 דקות.
15. התווית את הצלחת לאחר ההתחממות עם שם האישה ושם המשפחה, מזהה הזוג, מזהה העובר כי יהיה תרבותי בו.
16. בנוכחות עד, להעביר את בלסטוציסטה החמם למדיום התרבות הקדם ביותר בלוח ET שלאחר ההתחממות.
17. לשטוף את בלסטוציסטה בבאר הראשונה של הצלחת ET ומניחים אותו בבאר השנייה.
18. העבר את קערת התרבות שלאחר ההתחממות לחממה באווירה מבוקרת (37 ° c, 6% CO₂, 5% O₂) ואת התרבות הבלסטוציסטה עבור לפחות 1.5 h לפני בדיקת ההישרדות שלה מחדש התרחבות.
    הערה: איור 5 מראה דוגמאות של מנוונת, ששרדו, אך לא מורחב מחדש, שרדו לגמרי והתרחבה במלואה.

9. EmbryoTransfer

1. כדי לבצע ET, הניחו את המנה על הבמה המחוממת של כיסוי הזרימה המבינארי, כך שהעובר גלוי מתחת למיקרוסקופ בהגדלה נמוכה.
2. קח כ 0.4 מ ל של מדיום תרבות הפריה חוץ גופית. אבטח את קצה המזרק בחוזקה לתוך הקצה המקבל של הצנתר הפנימי ולאחר מכן שחרר את המדיום עד 0.1 mL.
3. כמות מזערית של התרבות עד שהוא צופה בעוברים הנכנסים לצנתר (סכום מינימלי של מדיה: 10 עד 15 μL).
4. מניחים את הקטטר לתוך אריזת פלסטיק וללכת לחדר הניתוח ומניחים את הקטטר הפנימי לתוך המדריך החיצוני.
5. פעם הגיע הרחם, לדחוף את המזרק כדי לשחרר את העובר (ים). שחררו לאט מאוד את המדיום עד שהמבוכנה קוראת 0.1 mL.
6. קח את הקטטר חזרה למעבדה ותבדוק. מתחת למיקרוסקופ שהעובר הועבר

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

איור 6 מייצג ערכה של כל התוצאות של הליך ביופסיה שניתן לאמץ כדי לתקנן את הפרוטוקול ולנטר את הביצועים של כל אופרטור. התוצאה הפרוצדורלית העיקרית היא העיתוי להשלמת ביופסיה/ביופסיות; התוצאה הטכנית העיקרית היא האיכות של העלילה המיוצר לאחר בדיקות גנטיות שעשוי ל...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

רק embryologists מיומנים מנוסים שסיימו את תקופת ההכשרה שלהם צריך לבצע הן TE ביופסיה ו בלסטוציסט ויטריפיקציה. יתרה מזאת, על העד לפקח על ההליכים ולהבטיח שעקיבות יעילה במהלך הזמן שאני מבצע את התנועות של ביופסיה מצלחת הביופסיה (איור משלים 1) לצלחת הפוסט-ביופסיה (איור משלים 1) ), ואז לצ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Cold tube rack	Biocision	XTPCR96
Electronic pipette controller	Fisher Scientific	710931
Flexipet adjustable handle set	Cook	G18674	Stripper holder
Gilson Pipetman	Gilson	66003	p20
IVF Electronic Witness System	CooperSurgical Fertility & Genomic Solutions		RI Witness ART Management System
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TE2000-U
Laminar Flow Hood	IVF TECH		Grade A air flow
Laser objective	RI	Saturn 5
Microinjectors	Nikon Narishige	NT-88-V3
Mini centrifuge for PCR tubes	Eppendorf	CSLQSPIN	for 0.2 mLl PCR tubes
Stereomicroscope	Leica	Leica M80
Thermostat	Panasonic	MCO-5AC-PE
Tri-gas incubator	Panasonic	MCO-5M-PE	02/CO2
Consumables
Biopsy pipette	RI	7-71-30FB35720	30 µm ID, flat 35 °C
Cryolock	Cryolock	CL-R-CT
CSCM complete	Irvine Scientific	90165	IVF culture medium supplemented with HSA
Embryo Transfer Catheter	Cook	G17934
Flexipet pipette	Cook	G26712	140µm stripping pipette tip
Flexipet pipette	Cook	G46020	300µm stripping pipette tips
Holding pipette	RI	7-71-IH35/20	30 µm ID, flat 35 °C
Human Serum Albumin	Irvine Scientific	9988
IVF One well dish	Falcon	353653
Mineral Oil for embryo culture	Irvine Scientific	9305
Modified HTF Medium	Irvine Scientific	90126	Hepes-Buffered medium
Nuclon Delta Surface	Thermofisher scientific	176740	IVF dish 4-well plate with sliding lid
Primaria Cell culture dish	Corning	353802	60 mm x15 mm
Reproplate	Kitazato	83016
Serological pipette	Falcon	357551	10ml
Sterile disposable Gilson tips	Eppendorf	0030 075.021	200 µL
Tubing Kit	Provided by the genetic lab		PCR tubes (0.2 mL), loading solution, biopsy washing solution
Vitrification media	Kitazato	VT801	Equilibration and vitrification solutions
Warming media	Kitazato	VT802	Thawing and dilution solutions