İnsan blastosist biyopsisi ve vitrifikasyon

Özet

Preimplantasyon Genetik testlerini verimli bir şekilde yürütmek için blastosist biyopsisi ve vitrifikasyon gereklidir. Zona pellucida ve 7-8 troectoderm hücrelerinin alma gün 5-7 Post-döllenme sıralı açılışı gerektiren bir yaklaşım, hem gerekli manipülasyonlar sayısını ve alt optimum çevresel koşullara embriyonun maruz kalma sınırlar.

Özet

Preimplantasyon genetik testleri ile ıVF döngüleri sırasında güvenilir bir genetik tanı elde etmek için blastosist biyopsisi gerçekleştirilir. Daha sonra, ideal iş akışı, teşhis tekniklerinin dönüş süresi nedeniyle ve seçilen embriyo (lar) ı aşağıdaki doğal döngüde fizyolojik endometriyum üzerine aktarmak için güvenli ve verimli bir vitrifikasyon Protokolü gerektirir. Zona pellucida 'nın sıralı açılmasını ve 5-10 troektoderm hücrelerinin (ideal 7-8) alınmasını kapsayan bir biyopsi yaklaşımı, hem gerekli manipülasyon sayısını hem de embriyonun alt-optimum çevresel koşullara maruz kalmasını sınırlar. Uygun eğitim sonra, teknik biyopsi zamanlaması açısından farklı operatörler arasında tekrarlanabilir oldu (~ 8 dakika, değişen 3-22 min embriyoların sayısına bağlı olarak biyopsi için tabak), kesin tanı elde (~ 97,5%) ve canlı Doğum oranları sonra vitrifiye-ısıtılmış euploid blastosist transfer (> 40%). Biyopsi sonrası hayatta kalma oranı, vitrifikasyon ve ısınma% 99,8 kadar yüksek oldu. Isınma 1,5 h yeniden genişleme oranı gibi yüksek oldu 97%, büyük ölçüde biyopsi ve vitrifikasyon arasındaki zamanlamaya bağlı (ideal ≤ 30 dk), blastosist morfolojik kalite ve biyopsi günü. Genel olarak, çökmüş bir blastokist vitrify daha iyidir; Bu nedenle, PGT olmayan döngüleri, lazerle destekli suni daralma embriyo çöküşü önce ağoprezervasyon için yapılabilir. En umut verici gelecek perspektif, blastosist kültürden sonra, embriyonik DNA 'nın bir kaynağı olarak ıVF kültür ortamının non-invaziv analizidir. Ancak, bu potansiyel Avant-garde hala soruşturma altında ve güvenilir bir protokol henüz tanımlanması ve doğrulanması gerekir.

Giriş

Modern insan EMBRİYOLOJİSİ ana amacı, uyarı döngüsü başına sayı canlı doğumları maksimize etmek ve maliyetleri azaltmak için, zaman ve çabaları bir hamilelik elde etmek. Bu hedefi başarmak için, bir IVF döngüsü sırasında elde edilen bir kohort içinde üreme yetkin embriyoları belirlemek için embriyo seçimi için onaylanmış yaklaşımlar kullanılmalıdır. Son kanıtlara göre, blastosist kültür¹ kapsamlı kromozomal test ve vitrifiye-ısıtılmış euploid embriyo transferi ile KOMBINE (et) IVF verimliliği artırmak için en verimli çerçeve². Belli ki, aneuploidyen testi, günümüzde çoğunlukla troektoderm 'den (TE) alınan birkaç hücreden temsil edilen bir embriyonik numune gerektirir, yani gebelikte embriyo eklerine (örn. plasenta) kökeni veren blastosist bölümü . Karyotip analizinin ötesinde, aynı zamanda tek gen mutasyonları, preimplantasyon genetik testleri (PGT;-aneuploidies için A-SR, yapısal kromozomal yeniden düzenlemeleri için-M monojenik hastalıklar için) olarak bilinen bir klinik strateji parçası olarak bir TE biyopsisi ile değerlendirilebilir. Diğer ooksit/embriyo biyopsisi yöntemleri teorik olarak son yıllarda klinik olarak benimsenmiştir, yani kutup organları biyopsisi ve plastomer biyopsisi. Ancak, günümüzde prosedürel dezavantajları (örn. daha yüksek iş yükü ve üreme etkisi riski) ve tanı sınırlamaları (örn. tek hücreli analiz sorunları) dolaylı olarak maliyetler, riskler ve (bir inceleme için bkz:³).

Bu yazıda, TE biyopsisi için ana protokollerden biri, sonraki vitrifikasyon, ısınma ve Transfer prosedürleri ile birlikte iyice tarif edilir. Burada özetlenen iş akışı, yoğun bir PGT ünitesi için idealdir.

Zaten bizim grup^4,5tarafından önceden açıklanan, prosedür tam genişletilmiş blastosist ve birkaç te hücrelerinin kaldırılması zona pellucida sıralı açılış içerir (ortalama 7-8). Günde 3 lazer destekli hatching tabanlı blastosist biyopsi yöntemi⁶ile karşılaştırıldığında, bu prosedür blastosist biyopsisi ve vitrifikasyon gibi hassas prosedürlerin zamanında gerçekleştirilmesi gereken bir IVF biriminin günlük zamanlamasını kolaylaştırabilir. Blastokist tam genişlemesine ulaştığında biyopsi, kaldırmak için TE hücrelerini seçerek, böylece iç hücre kütlesinin (ICM) herniasyon riskini önleyerek, aksi takdirde prosedürü zorlu hale getiren bir şekilde yapılabilir. Literatürde, embriyo zaten blastosist aşamaya ulaştığında, prosedür^5,7' den birkaç saat önce, lazer destekli hatching gerçekleştirilmesini içeren, Blastokist biyopsinin üçüncü bir protokolü de tanımlanmıştır. Bununla birlikte, bu yaklaşım daha zaman alıcı ve ağırlıklı olarak deneyimli operatörler ve orta-düşük günlük iş yükü görünümünde TE biyopsisi uygulayan ıVF ünitelerinde kullanılır.

Intrakyasmatik sperm enjeksiyonu (ıCSı)⁸ , IVF 'de genetik analizler yapmaya nişan alırsanız konsolide bir teknik olmalıdır. Benzer şekilde, blastosist aşamaya güvenli bir şekilde embriyolar toplamak için uygun bir kültür sistemi, TE biyopsi stratejisinin uygulanması için çok önemlidir. Düşük oksijen geriliminin kullanımı, yeterli sayıda kulkısım, Blastokist oranını tehlikeye atmayın, bu amaçla anahtar önkoşullardır⁹. Aynı zamanda, bir PGT döngüsünü güvenli bir şekilde yönetmek için etkili bir ağoprezervasyon programı gereklidir. Son on yılda, vitrifikasyon uygulanması embriyo Cryo-hayatta kalma oranları bile > 99%^10,11artırdı. Bu, genetik testler yapmak ve embriyo transferini aşağıdaki menstrüel döngüye ertelemek için yeterli zaman sağladı, uyarılamayan ve muhtemelen daha fazla reseptif endometrium¹².

Her iki TE biyopsi ve vitrifikasyon sıkı becerileri gerektiren görevleri talep ve etkinliğini olmayan operatörler arasında farklılık gösterebilir. Bu nedenle, her operatörün bu prosedürleri klinik olarak gerçekleştirmesine izin vermeden önce belirli bir eğitim süresi savunulmuş; Dahası, operatörün becerilerini bakım, ağoprezervasyon ve biyopsi prosedürleri için anahtar performans göstergelerini (KPI) izleyerek periyodik olarak değerlendirilmelidir. Her bir ıVF Kliniği, uluslararası konsorsiyum ve/veya referans laboratuvarları tarafından yayımlanan sonuçlar tarafından yayımlanan olanları yaklaşık olmalıdır bu amaçla iç KPI 'Leri ayarlamanız gerekir.

TE biopsi, vitrifikasyon-ısınma ve tanık prosedürleri bizim ünitede, bu üç önceki yayınlarda bildirilen gibi tüm operatörler arasında standardize edilmiş teknikler doğrulandı^11,13,14 .

Protokol

İnsan blastosist biyopsisi için protokol, burada açıklanan, G. EN. E.R.A. Insan araştırma etiği Komitesi yönergelerine uyur.

Not: Gerekli malzemeler için malzeme tablosuna bakın. Daha fazla malzeme gerekli laboratuvar Ayakkabı ve kıyafet, cerrahi facemask, saç örtüsü, cerrahi eldiven, kalıcı olmayan toksik Marker, forseps ve dezenfektan gerektirir. Cerrahi elbisesi, tek kullanımlık cerrahi eldiven, facemask, saç örtüsü kullanımı kontaminasyon riskini önlemek için zorunludur. Tüm çalışma alanlarının yanı sıra, işlemde yer alan ekipman, herhangi bir prosedür başlatmadan önce laboratuvar dezenfektan (örn., Oosafe) ile iyice temizlenmelidir. Kullanılan tüm sarf malzemeleri ve ortamlar steril ve ayrı olarak paketlenmiş veya alaşağı edilmelidir. Bu biyopsi ve boru için adanmış bir iş istasyonu kullanmak ve yalnızca prosedüre katılan operatörler (embriyolog ve tanık) için bölgenin erişimini sınırlamak için önerilmektedir.

1. biyopsi Işleminden önceki gün hazırlığı

1. Biyopsi kültürü yemeği hazırlayın.
   1. Bir ıVF kültür çanak içinde 20 μL ıVF kültür orta (malzeme tablosu) 6 damla yerleştirin ve embriyo kültürü Için 6 ml prewarmed mineral yağı ile bindirme (malzeme tablosu).
   2. Her damla için başka bir 10 μL ıVF kültür ortamı ekleyin. Bir gecede 37 °C ' de kontrollü bir atmosferde (% 5 O₂, 6% Co₂) inküye yapın.
2. Biyopsi sonrası blastosist durulama için bir ıVF çanak 4-kuyu plakası hazırlayın.
   1. İlk iki Kuyudaki ıVF kültür ortamının 600 μL 'yi ve embriyo kültürü için 300 μL ön ısıtılmış mineral yağıyla bindirmeyi yerleştirin.
   2. Bir gecede 37 °C ' de kontrollü bir atmosferde (% 5 O₂, 6% Co₂) inküye yapın.
3. TE hücre boruları için kullanılmak üzere her PCR tüpünde yükleme çözeltisi (malzeme tablosu) μl 1,5 dispense, döndürme ve 4 °c ' de tutun.

2. biyopsi prosedürü gününde hazırlık

1. Biyopsi tabağı hazırlayın.
   1. 3 damla 10 μL HEPES-tamponlu Orta (insan serum albümin ile tamamlayıcı) (malzeme tablosu) BIR IVF kültür çanak satırda yerleştirin.
   2. (Çanak başına 4 blastosist kadar) ve embriyo kültürü için 6 ml önceden ısıtılmış mineral yağı ile bindirme-mevcut blastosist sayısına göre 1.1.1 adımı tekrarlayın.
   3. Biyopsi prosedürünü yapmadan önce 37 °C ' de en az 1 saat boyunca çanak inküye yapın.

3. Blastokist seçimi ve sınıflandırma

1. Blastosist 'in genişlemesine ve ICM ve TE 'nin morfolojik görünümüne göre Not (Şekil 1).
   Not: notlama kriterleri Gardner ve Schoolcraft¹⁵ ve daha önce capalbo et al. ve cimadomo ve al.^4,11tarafından açıklanan uyarlanmıştır.
   1. Boyut ve genişleme notu olarak tanımlayın: a tam hatlı blastosist için, B bir hatching blastosist için, C tam genişletilmiş blastosist için, ve D genişletilmiş olmayan bir blastosist için (Bu embriyolar sadece onlar gün kadar daha fazla genişleme vermedi biyopsi 7).
   2. ICM notu tanımla: 1 belirgin ICM için birkaç kesinlikle paketlenmiş hücreler; birkaç ancak kabaca paketlenmiş hücreler ile ayırt edilebilir için 2; 3 çok az düşük kaliteli hücreler ile ayırt etmek zor.
   3. TE notu aşağıdaki gibi tanımlayın: 1 çeşitli hücrelerle iyi organize epitelyum için; birkaç hücreli gevşek epitelyum için 2; birkaç ve/veya büyük düşük kaliteli hücreler için 3.

4. troektoderm biyopsisi

1. Tüm uygulanabilir tam genişletilmiş blastosist üzerinde te biyopsi gerçekleştirin (boyut ve genişleme için tercihen C Grade).
2. Her biyopsi prosedürü için tutma ve biyopsi pipetleri ayarlayın. Biyopsi pipet için öneriler şunlardır: 30 μm iç çapı, 35 ° büküm açısı, 0,75 mm mesafe ucu bend.
3. Biyopsi tabağını hastanın detayları ile etiketleyin (kadının adı ve soyadı, Doğum tarihi ve KIMLIĞI) ve sonra her damla embriyo ve döngü kimlikleri ile sayı yapın. Kalıcı toksik olmayan Marker kullanın.
4. Biyopsi çanağın ilk damlası için 300 μm sıyırma pipet ile blastosist transfer ve kültür orta aşan kaldırmak için durulayın. Sonra biyopsi çanak ikinci damla Blastokist taşıyın.
5. Tabak ters mikroskopla taşıyın ve biyopsi tabak üçüncü damla bazı orta duman çekiş biyopsi pipet Prime.
6. 20X büyütme, Blastokist yönlendirmek ICM net bir görünüme sahip. Saat 7 ' de (TE hücrelerini çıkarmak için hedeflenen alanın tersi) görselleştirildiğinde, embriyonun tutan pipet üzerine sabitlenmelidir (Şekil 2a).
7. Zona pellucida odaklanmak ve hem Pipetler ve blastosist aynı odak düzleminde olduğunu tespit.
8. Lazer hedefe geçiş (darbe süresi 0,3 MS, 6,5 μm) ve lazer işaretçisini ICM 'nin karşı tarafındaki zona pellucida üzerine konumlandırın. Zona pellucida 2 − 3 lazer darbeleri ile matkap (Şekil 2B).
9. Biyopsi pipetine yavaşça zona pellucida 'ya basın ve TE hücrelerini iç yüzeyinden ayırın ve blastosist çöküşü hızlandırın (Şekil 2C).
10. TE ayrıldıktan sonra (Şekil 2D), delik üzerinden girin (gerekirse, son bir lazer nabız ile daha geniş yapmak) ve birkaç te hücreleri Aspire (ideal 7 − 8^13,16) yumuşak emiş biyopsi pipet içine (Şekil 2e).
11. Hedef hücreleri uzatmak için ılımlı bir emiş uygularken biyopsi Pipeti biraz geriye doğru hareket ettirin (Şekil 2F).
12. Lazeri, emişli hücrelerin en ince kısmına doğru yönlendirin ve hücre arasındaki kavşada 2 − 5 lazer darbeleri ateş ederek, hedef hücreleri embriyonun gövdesine ayırın (Şekil 2G). Lazer darbeleri ve darbe sayısı zamanlaması blastosist kalitesine göre ayarlanabilir; Ancak, hücre liziz önlemek için onları en aza indirmek deneyin.
13. TE parçasının Blastokist 'den ayrılması (Şekil 2H) sonra, Blastokist 'den çok uzağa aynı biyopsi düşüşü içine bırakın. Bu, biyopsi pipet içine tekrar sucked önlemek için gereklidir (Şekil 2i).
14. Blastokist 'i tutma pipetinden bırakın ve parçanın onlara yapışmasını önlemek için her iki pipeti hemen kaldırın.
15. Kalite kontrol amacı için biyopsi parçanın bir resmini çekin (Şekil 3).
    Not: tek bir blastosist daha fazla prosedür başına biyopsi (biyopsi çanak başına en fazla dört) ise, embriyo arasında çapraz kontaminasyonu önlemek için yeni bir ile biyopsi pipet değiştirin.
16. 4.1 − 4.13 arasındaki adımları yineleyin.
17. Biyopsi tabağı laminar akış kaputu geri taşıyın.
18. Çift KIMLIĞI ile biyopsi sonrası kültür çanak etiket ve embriyo ve döngü KIMLIĞI ile her damla.
19. Bir tanık varlığı, temiz ıVF ortamında Blastokist durulayın ve son olarak post-biopsi çanak karşılık gelen damla taşıyın.
20. Biyopsi sonrası tabağı kontrollü bir atmosferde (37 °C,% 6 CO₂, 5% O₂) vitrifikasyon kadar kuluçta taşıyın. Blastokist yeniden genişlemeyi önlemek için biyopsi işleminden 30 dakika içinde vitrifikasyon yapılması tavsiye edilir.

5. boru borusu

Not: Tüm prosedür, bir tanık ve oda sıcaklığında laminar akış kaput içinde bulunması gerekir. Prosedür sırasında, PCR tüpleri buz üzerinde soğuk bir tüp raf içinde tutun (Tamamlayıcı Şekil 1).

1. PCR tüpleri kalıcı toksik olmayan Marker ile etiketleyin.
   Not: Etiketleme, genetik laboratuar tarafından istendiği şekilde yapılmalıdır. Genel olarak, hastanın adı ve Soyadı (baş harfleri), Çift KIMLIĞI, embriyo ve döngü KIMLIĞI (örneğin: JD 12345, 2. döngüsünün, Çift KIMLIĞI 12345 olan Jane Doe 'ya ait olan embriyo N. 1 için 1,2). Embriyo KIMLIĞI de tüpün gövdesinde mektuplarda rapor edilmelidir.
2. Bir 60 mm x 15 mm Kültür çanak (boru çanak), biyopsi embriyo kimlikleri (Tamamlayıcı Şekil 1) ile kapak etiket ve içinde 2 10 μL biyopsi yıkama solüsyonu (tablo) damla hazırlayın.
3. 140 μm sıyırma pipet (Tamamlayıcı Şekil 1) ile bazı biyopsi yıkama çözeltisi ile boru çanağın ikinci damlası.
4. Kolayca TE parça (ler) görselleştirmek için stereomikoskop altında biyopsi çanak yerleştirin.
5. TE parçası üzerine hafifçe biyopsi yıkama çözeltisi bırakın; sonra, onu sıyırma pipet içine yükleyin.
6. TE parçasını, biyopsi yıkama çözeltisinin ikinci damlasında boru çanağına taşıyın ve 2 − 3 kez dikkatle durulayın.
7. Ten parçasını PCR tüpünün altına (daha önce etiketlendikten sonra) yükleme çözümüyle aktarın, duvarları sıyırma pipetin ucunu ile dokunmamak için dikkat edin.
8. Her te parçası için yeni bir kapiller kullanmak için dikkat, her TE parçası için 5,7 adım 5,3 adım yordamı yineleyin.
9. Boru prosedürü sonunda, bir mini santrifüjte tüm PCR tüpler koymak ve birkaç saniye onları spin.
10. Örnekleri, test için başvuran genetik laboratuvara gönderene kadar-20 °C ' de saklayın.

6. Blastokist vitrifikasyon

1. Vitrify yeniden genişleme önlemek için te biyopsi 30 dakika içinde blastosist çöktü.
2. Vitrifikasyon plakasını kadın detayları ve vitrifiye edilmelidir blastosist kimlikleri ile etiketleyin.
3. Etiket vitrifikasyon destek (ler) kadın adı ve soyadı ile, Çift KIMLIĞI, üzerinde yüklenecek embriyonun KIMLIĞI yanı sıra prosedür tarihi. Çok düşük sıcaklıklarda bile bütünlüğünü koruyan özel cryolabels kullanılır (-196 °C).
4. Oda sıcaklığında, vitrifiye edilecek her blastosist için 0,3 ml dengelemesinden solüsyonu (es) (malzeme tablosu) dağıtır.
5. Bir tanık varlığında, 300 μm sıyırma pipet kullanarak ES 'de blastosist taşıyın.
6. Blastokist 'i 13 − 15 dakika boyunca ES 'de bırakın. Hacminin ilk daralması sonra, kademeli bir yeniden genişleme gözlenir.
7. Küçük bir soğutma rafı sıvı nitrojen (LN₂) ile doldurun ve laminar akış kaputu altına yerleştirin.
8. İkinci kuyunda 300 μL vitrifikasyon çözeltisi (VS) (malzeme tablosu) dispense. Blastokist tam yeniden genişleme sonra, 1 dakika için VS çözüm aktarmak ve ES seyreltilmesi için durulayın.
9. Bir tanık varlığında, vitrifikasyon desteği üzerinde blastosist yükleyin ve VS fazlalığının kaldırılması dikkat. Çözüm ince bir film Blastokist çevreleyen gerekir.
10. Vitrifikasyon desteğini LN₂ ' ye dalın ve numuneye yakın kabarcık oluşumu riskini azaltmak için enerjik bir şekilde taşıyın.
11. LN 2 ' de vitrifikasyon desteğini tutarken koruyucu kapağı yerleştirin_.
12. Bir tanık huzurunda, uzun süreli LN₂ depolama tankında vitrifikasyon desteğini taşıyın.

7. Non-biopsied Blastocysts suni daralma

1. Herhangi bir TE biyopsisi yapılırsa, vitrifikasyon öncesinde hemen blastositleri yapay olarak daraltabilirsiniz (Şekil 4).
   1. Kültür çanak kuluçkenden ters mikroskop için hareket ettirin ve seçilen embriyo odaklanmak.
   2. Lazer hedefe geçiş (Pre-set Nabız: 0,3 MS, 6,5 μm), ICM karşı tarafında zona pellucida hedef, daha sonra doğrudan 1 – 2 lazer darbeleri TE hücreler arasındaki kavşak için ICM güvenli bir mesafede. Blastositler 5 dakikadan kısa sürede çökmelidir.
2. Bölüm 6 ' da açıklandığı gibi çökmüş Blastokist vitrifikasyonu ile devam edin.

8. devredilebilir Blastokist ısınma

1. ET günü, her bir kuyu için 600 μL ön equilibrated ıVF kültür ortamını yerleştirerek ET 4-Well plakasını hazırlayın. 37 °C ' de kontrollü bir atmosferde (% 5 O₂, 6% Co₂), Blastokist ısınma yapılırken inküye yapın.
2. Kadın adı ve soyadı, Çift KIMLIĞI, içinde ısınacak embriyonun KIMLIĞI ile ısınma çanak etiket.
3. 1 mL çözme çözeltisi (TS) (malzeme tablosu) BIR IVF tek kuyu tabağı (Tamamlayıcı Şekil 1) ve 37 °c ' ye sıcak bir TERMOSTATIN en az 1 saat önce prosedüre başlanması için ısıtın.
4. LN₂ ile küçük bir soğutma desteğini doldurun ve çalışma alanının yakınında laminar akış kaputu içine yerleştirin.
5. Prosedüre başlamadan önce, vitrifikasyon desteğiyle bildirilen Blastokist bilgileri kontrol edin. Tüm kimlikleri genetik rapor ile eşleşmelidir ve sıcak için blastosist devredilebilir olanlar arasında seçilmelidir. Prosedür sırasında bir tanık gereklidir.
6. TERMOSTATIN dışında ısıtılan TS 'i içeren tek kuyun tabağı alın ve stereomicroscope altında ısıtmalı bir aşamaya yerleştirin.
7. LN₂ içindeki koruyucu kapağı forseps kullanarak çekin.
8. 37 °C TS içine vitrifikasyon desteğinin ucunu hızla Dalma.
9. Mikroskobik gözlem altında, Blastokist ucdan serbest bırakılıncaya kadar vitrifikasyon desteğini yavaşça hareket ettirin.
10. Blastokist 'i TS 'deki toplam 1 dakika boyunca bırakın, TS 'in altında tutmak için dikkat edin.
11. Oda sıcaklığında 200 μL seyreltme çözeltisi (DS) (malzeme tablosu) vitrifikasyon plakasının ilk kuyusu üzerinde dağıtılır.
12. DS için Blastokist transfer ve gradyan bir tür oluşturmak için onun üstünde bazı TS bırakmadan iyi altına yerleştirin. 3 dakika bırak.
13. 2 farklı kuyularda (WS1 ve WS2) 200 μL yıkama çözeltisi (WS) dispense.
14. WS1 için Blastokist transfer ve onun üstünde bazı DS orta bırakmadan iyi altına yerleştirin. Sonra WS2 için Blastokist transfer ve 1 dakika boyunca bozulmamış bırakın.
15. Kadın adı ve soyadı, Çift KIMLIĞI, içinde kültürlü olacak embriyonun KIMLIĞI ile sonrası ısınma ET plaka etiket.
16. Bir tanığın varlığında, ısıtılmış blastosist 'i, ısınma sonrası ET plakasında önceden eşitlenebilir kültür ortamına aktarın.
17. ET plakasının ilk kuyusu içinde Blastokist durulayın ve ikinci kuyu yerleştirin.
18. Isınma sonrası kültür çanağını kontrollü bir atmosferde (37 °C,% 6 CO₂, 5% O₂) ve kültür için blastosist en az 1,5 h, hayatta kalma ve yeniden genişleme kontrol etmeden önce aktarın.
    Not: Şekil 5 dejenere örnekleri gösterir, Cryo-hayatta ama yeniden genişletilmiş ve Cryo-hayatta ve tam genişletilmiş blastocysts.

9. Embriyotransfer

1. ET yapmak için, laminar akış kaput ısıtmalı aşamasında çanak yerleştirin, böylece embriyo düşük büyütme mikroskop altında görünür.
2. Yaklaşık 0,4 mL ıVF kültür ortamı alın. Şırınga ucunu iç kateterin alıcı ucuna sıkıca sabitleyin ve sonra orta 0,1 mL 'ye kadar bırakın.
3. Katetere giren embriyoları gözlemlemeye kadar, kültür ortamını aspirate (minimum miktarda medya: 10 − 15 μL).
4. Kateteri plastik kasa içine yerleştirin ve ameliyathane gidin ve dahili kateteri harici kılavuza yerleştirin.
5. Bir kez rahim ulaştı, embriyo (s) serbest bırakmak için şırınga pistonu itin. Pistonlu 0,1 mL okuma kadar çok yavaş orta bırakın.
6. Kateteri laboratuara geri götürün ve embriyonun aktarıldığı mikroskop altında kontrol edin.

Sonuçlar

Şekil 6 , protokol standartlaştırılması ve her operatörün performansını izlemek için kabul edilebilir bir biyopsi prosedürün tüm sonuçlarının bir düzenini temsil eder. Ana prosedür sonucu biyopsi/biopsilerin tamamlanması için zamanlamadır; Ana teknik sonuç, son olarak tanısı konulmamış blastosist bir yeniden biyopsi gerektiren ya bir kesin veya belirsiz tanı neden olabilir genetik test sonrası üretilen Arsa kalitesidir; Ana biyolo...

Tartışmalar

Sadece iyi tecrübeli embriyologlar, eğitim süresini tamamlamış ve hem biyopsi hem de blastosist vitrifikasyonu gerçekleştirmelidir. Ayrıca, bir tanık, prosedürleri izlemek ve i sırasında etkili bir izlenebilirliği garanti etmek için gereklidir) biyopsi blastosist biyopsi çanak (Tamamlayıcı Şekil 1) sonrası biyopsi çanak (ek Şekil 1) hareketlerini ), ardından vitrifikasyon plakasına (Tamamlayıcı Şekil 1) ve son olarak vitrifikasyon desteğine (

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Cold tube rack	Biocision	XTPCR96
Electronic pipette controller	Fisher Scientific	710931
Flexipet adjustable handle set	Cook	G18674	Stripper holder
Gilson Pipetman	Gilson	66003	p20
IVF Electronic Witness System	CooperSurgical Fertility & Genomic Solutions		RI Witness ART Management System
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TE2000-U
Laminar Flow Hood	IVF TECH		Grade A air flow
Laser objective	RI	Saturn 5
Microinjectors	Nikon Narishige	NT-88-V3
Mini centrifuge for PCR tubes	Eppendorf	CSLQSPIN	for 0.2ml PCR tubes
Stereomicroscope	Leica	Leica M80
Thermostat	Panasonic	MCO-5AC-PE
Tri-gas incubator	Panasonic	MCO-5M-PE	02/CO2
Consumables
Biopsy pipette	RI	7-71-30FB35720	30µm ID, flat 35°C
Cryolock	Cryolock	CL-R-CT
CSCM complete	Irvine Scientific	90165	IVF culture medium supplemented with HSA
Embryo Transfer Catheter	Cook	G17934
Flexipet pipette	Cook	G26712	140µm stripping pipette tip
Flexipet pipette	Cook	G46020	300µm stripping pipette tips
Holding pipette	RI	7-71-IH35/20	30µm ID, flat 35°C
Human Serum Albumin	Irvine Scientific	9988
IVF One well dish	Falcon	353653
Mineral Oil for embryo culture	Irvine Scientific	9305
Modified HTF Medium	Irvine Scientific	90126	Hepes-Buffered medium
Nuclon Delta Surface	Thermofisher scientific	176740	IVF dish 4-well plate with sliding lid
Primaria Cell culture dish	Corning	353802	60x15mm
Reproplate	Kitazato	83016
Serological pipette	Falcon	357551	10ml
Sterile disposable Gilson tips	Eppendorf	0030 075.021	200µl
Tubing Kit	Provided by the genetic lab		PCR tubes (0.2mL), loading solution, biopsy washing solution
Vitrification media	Kitazato	VT801	Equilibration and vitrification solutions
Warming media	Kitazato	VT802	Thawing and dilution solutions