Menschliche Blastozysten Biopsie und Vitrifikation

Zusammenfassung

Blastozystenbiopsie und Vitrifikation sind erforderlich, um Präimplantations-Gentests effizient durchzuführen. Ein Ansatz, der die sequenzielle Öffnung der Zona pellucida und die Rückgewinnung von 7-8 Trophektodermzellen in Tag 5-7 nach der Besamung einschließt, begrenzt sowohl die Anzahl der erforderlichen Manipulationen als auch die Exposition des Embryos gegenüber suboptimalen Umweltbedingungen.

Zusammenfassung

Blastozysten-Biopsie wird durchgeführt, um eine zuverlässige genetische Diagnose während IVF-Zyklen mit Präimplantations-Gentests zu erhalten. Dann beinhaltet der ideale Arbeitsablauf ein sicheres und effizientes Verglasungsprotokoll, aufgrund der Durchlaufzeit der Diagnostischen Techniken und die Übertragung der ausgewählten Embryonen auf ein physiologisches Endometrium in einem folgenden natürlichen Zyklus. Ein Biopsieansatz, der die sequenzielle Öffnung der Zona pellucida und die Rückgewinnung von 5-10 Trophektodermzellen (idealerweise 7-8) umfasst, begrenzt sowohl die Anzahl der erforderlichen Manipulationen als auch die Exposition des Embryos gegenüber suboptimalen Umgebungsbedingungen. Nach der richtigen Schulung war die Technik bei verschiedenen Bedienern reproduzierbar in Bezug auf den Zeitpunkt der Biopsie (8 min, 3-22 min basierend auf der Anzahl der Embryonen bis zur Biopsie pro Schale), schlüssige Diagnosen erhalten (97,5%) und Lebendgeburten nach verglast-gewärmerwärmener euploiden Blastozystenübertragung (>40%). Die Überlebensrate nach Biopsie, Verglasung und Erwärmung lag bei 99,8%. Die Re-Expansionsrate bei 1,5 h aus der Erwärmung betrug bis zu 97%, weitgehend abhängig vom Zeitpunkt zwischen Biopsie und Vitrifikation (idealerweise 30 min), blastozystmorphologischeR Qualität und Tag der Biopsie. Im Allgemeinen ist es besser, eine zusammengebrochene Blastozyste zu vitrify; Daher kann in Nicht-PGT-Zyklen laserunterstützte künstliche Schrumpfung durchgeführt werden, um den Embryokollaps vor der Kryokonservierung zu induzieren. Die vielversprechendste Zukunftsperspektive ist die nicht-invasive Analyse der IVF-Kulturmedien nach Blastozystenkultur als vermeintliche Quelle embryonaler DNA. Diese potenzielle Avantgarde wird jedoch noch untersucht, und ein zuverlässiges Protokoll muss noch definiert und validiert werden.

Einleitung

Das Hauptziel der modernen menschlichen Embryologie ist es, die Anzahl der Lebendgeburten pro stimulierten Zyklus zu maximieren und Kosten, Zeit und Anstrengungen zu reduzieren, um eine Schwangerschaft zu erreichen. Um dieses Ziel zu erreichen, sollten validierte Ansätze für die Embryonenauswahl verwendet werden, um reproduktiv kompetente Embryonen innerhalb einer Kohorte zu identifizieren, die während eines IVF-Zyklus erhalten wurde. Nach den neuesten Erkenntnissen ist Blastozystenkultur¹ in Kombination mit umfassenden Chromosomentests und verglast-gewärmtem euploiden Embryotransfer (ET) der effizienteste Rahmen zur Steigerung der IVF-Effizienz². Natürlich erfordert ein Aneuploidie-Test eine embryonale Probe, die derzeit meist aus wenigen Zellen aus dem Trophektoderm (TE) dargestellt wird, d. h. dem Abschnitt der Blastozyste, der während der Schwangerschaft den Ursprung von Embryoanhängen (z. B. der Plazenta) gibt. . Neben der Karyotyp-Analyse könnten auch einzelne Genmutationen aus einer TE-Biopsie als Teil einer klinischen Strategie bewertet werden, die als Präimplantationsgenztest bekannt ist (PGT; -A für Aneuploidies, -SR für strukturelle chromosomale Umlagerungen, -M für monogene Krankheiten). Andere Eizellen-/Embryo-Biopsiemethoden wurden in den letzten Jahrzehnten klinisch theoretisiert und übernommen, nämlich Polarkörperbiopsie und Blastomerbiopsie. Ihre Verwendung ist heutzutage jedoch geringer, da ihre verfahrenstechnischen Nachteile (z. B. höhere Arbeitsbelastung und Risiko für reproduktive Auswirkungen) und diagnostische Einschränkungen (z. B. Einzelzellanalyseprobleme) implizit ein ausreichendes Gleichgewicht zwischen Kosten, Risiken und Vorteile (für eine Überprüfung siehe³).

In diesem Beitrag wird eines der wichtigsten Protokolle für die TE-Biopsie zusammen mit den nachfolgenden Verglasungs-, Erwärmungs- und Transferverfahren ausführlich beschrieben. Der hier beschriebene Workflow ist ideal für eine ausgelastete PGT-Einheit.

Wie bereits von unserer Gruppe^4,5beschrieben, beinhaltet das Verfahren die sequenzielle Öffnung der Zona pellucida von voll expandierten Blastozysten und die Entfernung von wenigen TE-Zellen (im Durchschnitt 7-8). Im Vergleich zum Tag 3 laserunterstützte Brut-basierte Blastozysten-Biopsie-Methode⁶, könnte dieses Verfahren den täglichen Zeitplan einer IVF-Einheit erleichtern, wo empfindliche Verfahren, wie Blastozystenbiopsie und Vitrifikation, rechtzeitig durchgeführt werden müssen. Sobald die Blastozyste ihre volle Ausdehnung erreicht, kann die Biopsie durchgeführt werden, indem die zu entfernenden TE-Zellen ausgewählt werden, wodurch das Risiko eines Abreihens der inneren Zellmasse (ICM) verhindert wird, was das Verfahren sonst schwierig machen würde. In der Literatur wurde auch ein drittes Protokoll der Blastozystenbiopsie beschrieben, das lasergestütztes Schlüpfen beinhaltet, sobald der Embryo das Blastozystenstadium bereits erreicht hat, wenige Stunden vor dem Eingriff^5,7. Dieser Ansatz ist jedoch zeitaufwändiger und eignet sich vor allem für IVF-Einheiten, die die TE-Biopsie in den Händen von begrenzt erfahrenen Bedienern und angesichts einer mäßig niedrigen täglichen Arbeitsbelastung implementieren.

Die intrazytoplasmatische Spermieninjektion (ICSI)⁸ sollte eine konsolidierte Technik sein, wenn genetische Analysen in IVF durchgeführt werden sollen. Ebenso ist ein geeignetes Kultursystem zur sicheren Ernte von Embryonen in das Blastozystenstadium von entscheidender Bedeutung für die Umsetzung der TE-Biopsiestrategie. Eine ausreichende Anzahl von Inkubatoren sowie die Verwendung von geringer Sauerstoffspannung sind wichtige Voraussetzungen dafür, um die Blastozystenrate⁹nicht zu gefährden. Gleichzeitig wird ein effizientes Kryokonservierungsprogramm benötigt, um einen PGT-Zyklus sicher zu verwalten. In den letzten zehn Jahren hat die Umsetzung der Vitrifizierung die Kryoüberlebensraten in Embryonen sogar auf >99%^10,11erhöht. Dies bot genügend Zeit, um genetische Tests durchzuführen und den Embryotransfer auf den folgenden Menstruationszyklus auf ein nicht stimuliertes und wahrscheinlich empfänglicheres Endometrium zu verschieben¹².

Sowohl die TE-Biopsie als auch die Verglasung sind anspruchsvolle Aufgaben, die strenge Fähigkeiten erfordern, und ihre Wirksamkeit kann von unerfahrenen Bedienern unterschiedlich sein. Daher wird eine spezifische Ausbildungszeit empfohlen, bevor es jedem Bediener gestattet wird, diese Verfahren klinisch durchzuführen; Darüber hinaus sollte die Aufrechterhaltung der Fähigkeiten der Betreiber regelmäßig durch die Überwachung der Leistungskennzahlen (KPI) für Kryokonservierungs- und Biopsieverfahren bewertet werden. Jede IVF-Klinik sollte zu diesem Zweck interne KPIs festlegen, die sich den von internationalen Konsortien veröffentlichten KPIs und/oder den von Referenzlaboratorien veröffentlichten Ergebnissen annähern müssen.

TE-Biopsie-, Verglasungs-Erwärmungs- und Zeugenverfahren sind validierte Techniken in unserer Einheit, die auf alle beteiligten Akteure standardisiert wurden, wie in drei früheren Veröffentlichungen berichtet^11,13,14 .

Protokoll

Das Protokoll für die biozystische Biopsie des Menschen, hier beschrieben, folgt den Richtlinien des G.EN.E.R.A. Human Research Ethic Committee.

HINWEIS: Siehe Materialtabelle für benötigte Materialien. Weiteres Material erforderlich sind Laborschuhe und -outfit, chirurgische Gesichtsmaske, Haarschutz, chirurgische Handschuhe, ein permanenter ungiftiger Marker, Zangen und Desinfektionsmittel. Die Verwendung von chirurgischen Kleid, Einweg-CHIRURGIE-Handschuhe, Gesichtsmaske, Haarschutz ist obligatorisch, um das Risiko einer Kontamination zu verhindern. Alle Arbeitsbereiche sowie die am Prozess beteiligten Geräte müssen vor Beginn eines Verfahrens gründlich mit Labordesinfektionsmittel (z. B. Oosafe) gereinigt werden. Alle verwendeten Verbrauchsmaterialien und Medien sollten steril und einzeln verpackt oder aliquoted sein. Es wird vorgeschlagen, einen speziellen Arbeitsplatz für Biopsie und Schläuche zu verwenden und den Zugang des Bereichs nur auf die am Verfahren beteiligten Akteure (Embryologen und Zeugen) zu beschränken.

1. Vorbereitung am Tag vor dem Biopsieverfahren

1. Bereiten Sie das Postbiopsie-Kulturgericht vor.
   1. Legen Sie 6 Tropfen von 20 L IVF Kulturmedium (Tabelle der Materialien) in eine IVF-Kulturschale und Overlay mit 6 ml vorgewärmten Mineralöl für embryokultur ( Tabelle derMaterialien).
   2. Fügen Sie jedem Tropfen weitere 10 L IVF-Kulturmedium hinzu. Über Nacht bei 37 °C in kontrollierterAtmosphäre inkubieren (5% O2 , 6% CO2 ).
2. Bereiten Sie eine IVF-Platte 4-Well-Platte zum Spülen der Blastozyste nach der Biopsie vor.
   1. Legen Sie 600 l IVF-Kulturmedium in die ersten beiden Brunnen und überlagern Sie mit 300 l vorgewärmten Mineralölfür die Embryokultur.
   2. Über Nacht bei 37 °C in kontrollierterAtmosphäre inkubieren (5% O2 , 6% CO2 ).
3. Geben Sie in jedem PCR-Rohr 1,5 l der Ladelösung (Materialtabelle) für TE-Zellenrohre auf, drehen Sie es und halten Sie es bei 4 °C.

2. Vorbereitung am Tag des Biopsieverfahrens

1. Bereiten Sie das Biopsiegericht vor.
   1. Legen Sie 3 Tropfen von 10 L HEPES-gepufferten Medium (ergänzt mit humans Serumalbumin) (Tabelle der Materialien) in einer Reihe in einem IVF-Kulturgericht.
   2. Wiederholen Sie Schritt 1.1.1 entsprechend der Anzahl der blastozysten verfügbaren Blastozysten (bis zu 4 Blastozysten pro Schale) und Überlagerung mit 6 ml vorgewärmten Mineralöl für die Embryokultur.
   3. Inkubieren Sie die Schale bei 37 °C für mindestens 1 h vor der Durchführung der Biopsie.

3. Blastozystenauswahl und -benotung

1. Gradieren Sie die Blastozyste nach ihrer Ausdehnung und dem morphologischen Erscheinungsbild von ICM und TE (Abbildung 1).
   HINWEIS: Die Einstufungskriterien wurden von Gardner und Schoolcraft¹⁵ angepasst und zuvor von Capalbo et al. und Cimadomo et al.^4,11beschrieben.
   1. Definieren Sie die Größe und die Expansionsgrad als: A für eine voll geschlüpfte Blastozyste, B für eine schraffierte Blastozyste, C für eine vollständig erweiterte Blastozyste und D für eine nicht expandierte Blastozyste (diese Embryonen werden nur dann biopsiet, wenn sie sich bis Zum Tag 7 nicht weiter ausdehnen).
   2. Definieren Sie ICM-Grade: 1 für auffällige ICM mit mehreren streng verpackten Zellen; 2 für erkennbar mit mehreren, aber grob verpackten Zellen; 3 für schwer zu unterscheiden mit sehr wenigen minderwertigen Zellen.
   3. Definieren Sie die TE-Klasse wie folgt: 1 für gut organisiertes Epithel mit mehreren Zellen; 2 für loses Epithel mit wenigen Zellen; 3 für wenige und/oder große Zellen niedriger Qualität.

4. Trophectoderm Biopsie

1. Führen Sie te Biopsie auf allen lebensfähigen voll expandierten Blastozysten (vorzugsweise C-Grad für Größe und Expansion) durch.
2. Stellen Sie Halte- und Biopsiepipetten für jeden Biopsievorgang ein. Die Empfehlungen für die Biopsiepipette lauten wie folgt: 30 m Innendurchmesser, 35° Biegewinkel, 0,75 mm Abstandsspitze zum Biegen.
3. Etikettieren Sie die Biopsieschale mit den Daten des Patienten (Name und Nachname der Frau, Geburtsdatum und ID) und nummerieren Sie dann jeden Tropfen mit Embryo- und Zyklus-IDs. Verwenden Sie einen dauerhaften ungiftigen Marker.
4. Übertragen Sie die Blastozyste mit einer 300 m abisolierenden Pipette auf den ersten Tropfen der Biopsieschale und spülen Sie sie ab, um den Überschuss des Kulturmediums zu entfernen. Dann bewegen Sie die Blastozyste in den zweiten Tropfen der Biopsieschale.
5. Bewegen Sie die Schale auf das invertierte Mikroskop und grundieren Sie die Biopsiepipette, die ein Medium aus dem dritten Tropfen der Biopsieschale ansaugt.
6. Bei 20-facher Vergrößerung die Blastozyste so ausrichten, dass sie einen klaren Blick auf das ICM hat. Wenn es bei 7 Uhr visualisiert wird (gegenüber dem Bereich, der gezielt die TE-Zellen entfernen soll), sichern Sie den Embryo auf der haltepipette (Abbildung 2a).
7. Konzentrieren Sie sich auf die Zona pellucida und stellen Sie fest, dass sich sowohl die Pipetten als auch die Blastozyste auf derselben Brennebene befinden.
8. Wechseln Sie zum Laserobjektiv (Pulszeit 0,3 ms, 6,5 m) und positionieren Sie den Laserpointer auf der Zona pellucida auf der gegenüberliegenden Seite des ICM. Bohren Sie die Zona pellucida durch 2-3 Laserpulse (Abbildung 2b).
9. Drücken Sie vorsichtig die Biopsiepipette gegen die Zona pellucida und blasen Sie ein Medium durch die Bresche, um die TE-Zellen von ihrer inneren Oberfläche zu lösen und den Zusammenbruch der Blastozysten zu beschleunigen (Abbildung 2c).
10. Sobald das TE abgetrennt ist (Abbildung 2d), betreten Sie durch das Loch (falls erforderlich, machen Sie es mit einem letzten Laserpuls breiter) und aspirieren Sie einige TE-Zellen (idealerweise 7-8^13,16) in die Biopsiepipette mit sanfter Absaugung (Abbildung2e).
11. Bewegen Sie die Biopsiepipette leicht nach hinten, während Sie eine moderate Absaugung anwenden, um die Zielzellen zu dehnen (Abbildung 2f).
12. Richten Sie den Laser auf den dünnsten Teil der angesaugten Zellen und feuern Sie 2-5 Laserpulse an den Knoten zwischen den Zellen ab, um die Zielzellen vom Körper des Embryos zu trennen (Abbildung 2g). Das Timing von Laserpulsen und die Anzahl der Impulse können entsprechend der Qualität der Blastozyste eingestellt werden; Versuchen Sie jedoch, sie zu minimieren, um eine Zelllyse zu vermeiden.
13. Nach der Trennung des TE-Fragments von der Blastozyste (Abbildung 2h) geben Sie es in den gleichen Biopsietropfen weit weg von der Blastozyste frei. Dies ist notwendig, um zu verhindern, dass sie wieder in die Biopsiepipette gesaugt werden (Abbildung 2i).
14. Lösen Sie die Blastozyste aus der Haltepipette und heben Sie beide Pipetten sofort an, um zu verhindern, dass das Fragment an ihnen klebt.
15. Nehmen Sie ein Bild des biopsied Fragment für Die Qualitätskontrolle Zweck (Abbildung 3).
    HINWEIS: Wenn mehr als eine einzige Blastozyste pro Verfahren biopsied (bis zu vier pro Biopsieschale) biopsien soll, ändern Sie die Biopsiepipette mit einer neuen, um kreuzkontaminationen zwischen Embryonen zu verhindern.
16. Wiederholen Sie die Schritte 4.1-4.13.
17. Bewegen Sie die Biopsieschale zurück auf die laminare Fließhaube.
18. Beschriften Sie das Kulturgericht nach der Biopsie mit der Paar-ID und jeden Tropfen mit dem Embryo und der Zyklus-ID.
19. In Anwesenheit eines Zeugen, spülen Sie die Blastozyste in sauberen IVF-Medium, und schließlich bewegen Sie es auf den entsprechenden Tropfen der Post-Biopsie-Schale.
20. Die Nachbiopsieschale in kontrollierter Atmosphäre (37 °C, 6%CO2 , 5% O2 ) bis zur Vitrifizierung in den Inkubator bringen. Es ist ratsam, die Vitrifizierung innerhalb von 30 min nach dem Biopsieverfahren durchzuführen, um eine erneute Ausbreitung der Blastozysten zu verhindern.

5. Schläuche

HINWEIS: Das gesamte Verfahren muss in Anwesenheit eines Zeugen und in der laminaren Strömungshaube bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Während des Verfahrens die PCR-Rohre in einem Kaltrohrträger auf Eis halten(Zusatzabbildung 1).

1. Beschriften Sie die PCR-Rohre mit einem dauerhaften ungiftigen Marker.
   HINWEIS: Die Etikettierung sollte nach Bedarf des genetischen Labors erfolgen. Im Allgemeinen sind der Vor- und Nachname des Patienten (Initialen), die Paar-ID, der Embryo und die Zyklus-ID (z. B. JD 12345 1.2 für den Embryo N.1 des 2. Zyklus, der Jane Doe gehört, deren Paar-ID 12345) ist. Embryo-ID sollte auch in Buchstaben auf dem Körper des Rohres gemeldet werden.
2. Beschriften Sie den Deckel einer 60 mm x 15 mm Kulturschale (Schlauchschale) mit den IDs der biopsied embryonierten Embryonen (Zusatzabbildung 1) und bereiten Sie darin zwei 10 L Tropfen Biopsiewaschlösung (TabellederMaterialien) vor.
3. Die 140 m Abisolierpipette (Zusatzabbildung 1) mit einer Biopsie-Waschlösung aus dem zweiten Tropfen der Schlauchschale grundieren.
4. Legen Sie die Biopsieschale unter das Stereomikroskop, um die TE-Fragmente einfach zu visualisieren.
5. Lösen Sie vorsichtig eine Biopsie-Waschlösung auf dem TE-Fragment; dann in die Abisolierpipette laden.
6. Bewegen Sie das TE-Fragment auf den zweiten Tropfen Biopsie-Waschlösung in der Schlauchschale und spülen Sie es sorgfältig 2-3 Mal ab.
7. Übertragen Sie das TE-Fragment mit Ladelösung auf den Boden des PCR-Rohrs (zuvor danach beschriftet), wobei Sie darauf achten, dass die Wände nicht mit der Spitze der Abisolierleitung berührt werden.
8. Wiederholen Sie den Vorgang von Schritt 5.3 bis Schritt 5.7 für jedes TE-Fragment, wobei Sie darauf achten, für jedes TE-Fragment eine neue Kapillare zu verwenden.
9. Am Ende des Schlauchvorgangs alle PCR-Röhren in eine Minizentrifuge geben und für einige Sekunden drehen.
10. Bewahren Sie die Proben bei -20 °C auf, bis sie zur Prüfung an das verweisende genetische Labor versandt werden.

6. Blastozysten-Vitrifikation

1. Vitrify kollabierte Blastozysten innerhalb von 30 min von te Biopsie, um ihre erneute Expansion zu verhindern.
2. Beschriften Sie die Verglasungsplatte mit den Details der Frau und den Ausleinen der Blastozysten, die verglast werden müssen.
3. Kennzeichnen Sie die Verglasungsunterstützung(en) mit dem Vor- und Nachnamen der Frau, der Paar-ID, der ID des embryonalen Embryos, der auf sie geladen wird, sowie dem Datum des Verfahrens. Es werden spezielle Kryoetiketten verwendet, die ihre Integrität auch bei sehr niedrigen Temperaturen (-196 °C) bewahren.
4. Bei Raumtemperatur 0,3 ml Ausgleichslösung (ES)(Materialtabelle) für jede Blastozyste, die verglast wird, dosieren.
5. Bewegen Sie in Anwesenheit eines Zeugen die Blastozyste in ES mit der 300 m Abisolierpipette.
6. Lassen Sie die Blastozyste in der ES für 13-15 min. Nach einer anfänglichen Schrumpfung des Volumens wird eine allmähliche Reexpansion beobachtet.
7. Füllen Sie ein kleines Kühlregal mit flüssigem Stickstoff (LN₂) und legen Sie es unter die laminare Durchflusshaube.
8. Geben Sie 300 l Verglasungslösung (VS) (Materialtabelle) im zweiten Brunnen. Nach der Blastozyste vollständige Re-Expansion, übertragen Sie es in der VS-Lösung für 1 min und spülen Sie es, um die ES zu verdünnen.
9. Laden Sie in Anwesenheit eines Zeugen die Blastozyste auf die Verglasungsstütze und kümmern Sie sich um die Entfernung des Vs-Überschusses. Ein subtiler Lösungsfilm sollte die Blastozyste umgeben.
10. Tauchen Sie die Verglasungsunterstützung in LN₂ ein und bewegen Sie sie energetisch, um das Risiko einer Blasenbildung in der Nähe der Probe zu reduzieren.
11. Legen Sie die Schutzkappe, während Sie die Verglasungsunterstützung in der LN₂ unter Wasser halten.
12. In Anwesenheit eines Zeugen, bewegen Sie die Verglasung Unterstützung in einem langfristigen LN₂ Lagertank.

7. Künstliche Schrumpfung von nicht biopsied Blastozysten

1. Wenn keine TE-Biopsie durchgeführt wird, kollabieren die Blastozysten unmittelbar vor der Vitrifizierung künstlich (Abbildung 4).
   1. Bewegen Sie die Kulturschale vom Inkubator zum invertierten Mikroskop und konzentrieren Sie sich auf den ausgewählten Embryo.
   2. Wechseln Sie zum Laserobjektiv (voreingestellter Puls: 0,3 ms, 6,5 m), zielen Sie auf die Zona pellucida auf der gegenüberliegenden Seite des ICM und leiten Sie dann 1–2 Laserpulse in einem sicheren Abstand vom ICM zu den Knotenpunkten zwischen TE-Zellen. Die Blastozysten sollten in weniger als 5 min zusammenbrechen.
2. Fahren Sie mit der Verglasung der zusammengebrochenen Blastozyste fort, wie in Abschnitt 6 beschrieben.

8. Übertragbare BlastozystenErwärmung

1. Bereiten Sie am Tag der ET die ET 4-Well-Platte vor, indem Sie für jeden Brunnen 600 L vorausgeglichenes IVF-Kulturmedium platzieren. Inkubieren Sie bei 37 °C ineiner kontrollierten Atmosphäre (5% O2 , 6% CO2 ), während Blastozystenerwärmung durchgeführt wird.
2. Etikettieren Sie die wärmende Schale mit dem Namen und Nachnamen der Frau, der Paar-ID, der ID des Embryos, der darin erwärmt wird.
3. 1 ml der Auftaulösung (TS) (Materialtabelle) in eine IVF-Einbrunnenschale geben (Zusatzabbildung 1) und in einem Thermostat mindestens 1 h auf 37 °C erwärmen, bevor Sie mit dem Verfahren beginnen.
4. Füllen Sie eine kleine Kühlstütze mit LN₂ und legen Sie sie in die laminare Durchflusshaube in unmittelbarer Nähe des Arbeitsbereichs.
5. Bevor Sie mit dem Verfahren beginnen, überprüfen Sie die Blastozysteninformationen, die über die Verglasungsunterstützung berichtet werden. Alle IDs sollten dem genetischen Bericht entsprechen und die Blastozyste zu warm muss unter den übertragbaren gewählt werden. Während des Verfahrens wird ein Zeuge geladen.
6. Nehmen Sie die einwellige Schale mit erwärmtem TS aus dem Thermostat und legen Sie sie auf eine beheizte Bühne unter dem Stereomikroskop.
7. Ziehen Sie die Schutzkappe innerhalb der LN₂ mit Zangen.
8. Die Spitze der Verglasungsstütze schnell in das 37 °C TS eintauchen.
9. Unter mikroskopischer Beobachtung bewegen Sie die Verglasungsstütze vorsichtig, bis die Blastozyste von der Spitze gelöst wird.
10. Lassen Sie die Blastozyste für insgesamt 1 min in der TS, achten Sie darauf, es am unteren Rand des TS zu halten.
11. Bei Raumtemperatur 200 l Verdünnungslösung (DS)(Materialtabelle) auf den ersten Brunnen der Verglasungsplatte geben.
12. Übertragen Sie die Blastozyste auf DS und platzieren Sie sie an der Unterseite des Brunnens, während Sie einige TS oben loslassen, um eine Art Gradient zu erstellen. Lassen Sie es für 3 min.
13. Geben Sie 200 L Waschlösung (WS) in 2 verschiedenen Brunnen (WS1 und WS2).
14. Übertragen Sie die Blastozyste auf WS1 und legen Sie sie auf die Unterseite des Brunnens, während Sie ein DS-Medium auf der Oberseite davon loslassen. Dann übertragen Sie die Blastozyste auf WS2 und lassen Sie sie ungestört für 1 min.
15. Beschriften Sie die ET-Platte nach der Erwärmung mit dem Vor- und Nachnamen der Frau, der Paar-ID, der ID des Embryos, der darin kultiviert wird.
16. Übertragen Sie in Anwesenheit eines Zeugen die erwärmte Blastozyste in das vorausgeglichene Kulturmedium in der post-warmen ET-Platte.
17. Spülen Sie die Blastozyste im ersten Brunnen der ET-Platte und legen Sie sie in den zweiten Brunnen.
18. Übertragen Sie das Kulturgericht nach der Erwärmung in kontrollierter Atmosphäre (37°C, 6% CO2 , 5% O2) auf den Brutkasten und bekulturen Sie die Blastozyste mindestens 1,5 h, bevor sie ihr Überleben und ihre Erneute Expansion überprüft.
    HINWEIS: Abbildung 5 zeigt Beispiele für degenerierte, kryo-überlebte, aber nicht wieder erweiterte und kryo-survived und vollständig erweiterte Blastozysten.

9. EmbryoTransfer

1. Um ET durchzuführen, legen Sie die Schale auf die beheizte Stufe der laminaren Strömungshaube, so dass der Embryo unter dem Mikroskop bei geringer Vergrößerung sichtbar ist.
2. Nehmen Sie ca. 0,4 ml IVF-Kulturmedium. Befestle die Spritzenspitze fest in das Empfangsende des Innenkatheters und lassen Sie dann das Medium bis zu 0,1 ml los.
3. Das Kulturmedium der Spiratkultur bis zur Beobachtung der Embryonen, die in den Katheter gelangen (minimale Medienmenge: 10 bis 15 L).
4. Legen Sie den Katheter in das Kunststoffgehäuse und gehen Sie in den Operationssaal und legen Sie den internen Katheter in die externe Führung.
5. Sobald Sie die Gebärmutter erreicht haben, drücken Sie den Spritzenkolben, um den/die Embryo(n) freizugeben. Lassen Sie das Medium sehr langsam los, bis der Kolben 0,1 ml liest.
6. Nehmen Sie den Katheter zurück ins Labor und überprüfen Sie unter dem Mikroskop, ob der Embryo übertragen wurde.

Ergebnisse

Abbildung 6 stellt ein Schema aller Ergebnisse eines Biopsieverfahrens dar, das zur Standardisierung des Protokolls und zur Überwachung der Leistung jedes Betreibers angenommen werden kann. Das wichtigste Verfahrensergebnis ist der Zeitpunkt für die Fertigstellung der Biopsien/Biopsien; das wichtigste technische Ergebnis ist die Qualität der nach genetischen Tests erzeugten Handlung, die entweder zu einer schlüssigen oder nicht schlüssigen Diagnose führ...

Diskussion

Nur erfahrene erfahrene Embryologen, die ihre Ausbildung abgeschlossen haben, sollten sowohl TE-Biopsie als auch Blastozysten-Vitrifikation durchführen. Darüber hinaus ist ein Zeuge verpflichtet, die Verfahren zu überwachen und eine effiziente Rückverfolgbarkeit während i) der Bewegungen der biopsied Blastozyste von der Biopsieschale(Zusatzabbildung 1) zur Nachbiopsieschale (Zusatzabbildung 1) zu gewährleisten. ), dann zur Verglasungsplatte (Zusatzabbildung 1) und ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Cold tube rack	Biocision	XTPCR96
Electronic pipette controller	Fisher Scientific	710931
Flexipet adjustable handle set	Cook	G18674	Stripper holder
Gilson Pipetman	Gilson	66003	p20
IVF Electronic Witness System	CooperSurgical Fertility & Genomic Solutions		RI Witness ART Management System
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TE2000-U
Laminar Flow Hood	IVF TECH		Grade A air flow
Laser objective	RI	Saturn 5
Microinjectors	Nikon Narishige	NT-88-V3
Mini centrifuge for PCR tubes	Eppendorf	CSLQSPIN	for 0.2 mLl PCR tubes
Stereomicroscope	Leica	Leica M80
Thermostat	Panasonic	MCO-5AC-PE
Tri-gas incubator	Panasonic	MCO-5M-PE	02/CO2
Consumables
Biopsy pipette	RI	7-71-30FB35720	30 µm ID, flat 35 °C
Cryolock	Cryolock	CL-R-CT
CSCM complete	Irvine Scientific	90165	IVF culture medium supplemented with HSA
Embryo Transfer Catheter	Cook	G17934
Flexipet pipette	Cook	G26712	140µm stripping pipette tip
Flexipet pipette	Cook	G46020	300µm stripping pipette tips
Holding pipette	RI	7-71-IH35/20	30 µm ID, flat 35 °C
Human Serum Albumin	Irvine Scientific	9988
IVF One well dish	Falcon	353653
Mineral Oil for embryo culture	Irvine Scientific	9305
Modified HTF Medium	Irvine Scientific	90126	Hepes-Buffered medium
Nuclon Delta Surface	Thermofisher scientific	176740	IVF dish 4-well plate with sliding lid
Primaria Cell culture dish	Corning	353802	60 mm x15 mm
Reproplate	Kitazato	83016
Serological pipette	Falcon	357551	10ml
Sterile disposable Gilson tips	Eppendorf	0030 075.021	200 µL
Tubing Kit	Provided by the genetic lab		PCR tubes (0.2 mL), loading solution, biopsy washing solution
Vitrification media	Kitazato	VT801	Equilibration and vitrification solutions
Warming media	Kitazato	VT802	Thawing and dilution solutions