Biopsia e vetrificazione dell'esplosione umana

Riepilogo

La biopsia e la vitrificazione della blastocisti sono necessarie per condurre in modo efficiente i test genetici preimpianto. Un approccio che prevede l'apertura sequenziale della zona pellucida e il recupero di 7-8 cellule di trectodermi nel giorno 5-7 post-inseminazione limita sia il numero di manipolazioni necessarie sia l'esposizione dell'embrione a condizioni ambientali non ottimali.

Abstract

La biopsia Blastocyst viene eseguita per ottenere una diagnosi genetica affidabile durante i cicli di fecondazione in vitro con test genetici preimpianto. Quindi, il flusso di lavoro ideale comporta un protocollo di vitrificazione sicuro ed efficiente, a causa dei tempi di consegna delle tecniche diagnostiche e per trasferire l'embrione o gli embrioni selezionati su un endometrio fisiologico in un ciclo naturale successivo. Un approccio di biopsia che comprende l'apertura sequenziale della zona pellucida e il recupero di 5-10 cellule trophectoderm (idealmente 7-8) limita sia il numero di manipolazioni necessarie sia l'esposizione dell'embrione a condizioni ambientali non ottimali. Dopo un'adeguata formazione, la tecnica è stata riproducibile tra diversi operatori in termini di tempistica della biopsia (8 min, che vanno da 3 a 22 min in base al numero di embrioni alla biopsia per piatto), diagnosi conclusive ottenute (97,5%) e tassi di natalità vivi dopo il trasferimento di blastocisti euploidi vetrificati (>40%). Il tasso di sopravvivenza dopo la biopsia, la vitrificazione e il riscaldamento è stato del 99,8%. Il tasso di riespansione a 1,5 h dal riscaldamento era alto come 97%, in gran parte dipende dalla tempistica tra biopsia e vitrificazione (idealmente , 30 min), qualità morfologica blastocista e giorno della biopsia. In generale, è meglio vitrificare una blastocisti collassata; pertanto, nei cicli non PGT, potrebbe essere eseguito un restringimento artificiale assistito al laser per indurre il collasso dell'embrione prima della crioconservazione. La prospettiva futura più promettente è l'analisi non invasiva dei media di coltura della fecondazione in vitro dopo la coltura della blastocisti come fonte putativa di DNA embrionale. Tuttavia, questa potenziale avanguardia è ancora in fase di studio e un protocollo affidabile deve ancora essere definito e convalidato.

Introduzione

L'obiettivo principale dell'embriologia umana moderna è quello di massimizzare il numero di nascite vive per ciclo stimolato e ridurre i costi, i tempi e gli sforzi per raggiungere una gravidanza. Per raggiungere questo obiettivo, dovrebbero essere utilizzati approcci convalidati per la selezione degli embrioni per identificare gli embrioni competenti riproduttivi all'interno di una coorte ottenuta durante un ciclo di fecondazione in vitro. Secondo le ultime evidenze, la cultura blastocisti¹ combinata con test cromosomici completi e il trasferimento di embrioni euploidi vetrificati (ET) è il quadro più efficiente per aumentare l'efficienza della fecondazione in vitro². Chiaramente, il test di aneuploidità richiede un campione embrionale, che attualmente è per lo più rappresentato da poche cellule recuperate dal trhectoderm (TE), cioè la sezione del blastocisti che dà origine agli annessi embrionali (ad esempio, la placenta) durante la gravidanza . Oltre all'analisi del cariotipo, anche le mutazioni genetiche singole potrebbero essere valutate da una biopsia TE come parte di una strategia clinica nota come test genetico preimpianto (PGT; -A per le aneuploidies, -SR per riarrangiamento cromosomiche strutturali, -M per le malattie monogeniche). Altri metodi di biopsia oocite/embrione sono stati teorizzati e adottati clinicamente negli ultimi decenni, vale a dire biopsia di corpi polari e biopsia blastomeri. Tuttavia, il loro uso è ancora ridotto al giorno d'oggi, poiché i loro inconvenienti procedurali (ad esempio, maggiore carico di lavoro e rischio di impatto riproduttivo) e le limitazioni diagnostiche (ad esempio, problemi di analisi a cella singola) ostacolano implicitamente un equilibrio sufficiente tra costi, rischi e benefici (per una revisione vedere³).

In questo documento, uno dei principali protocolli per la biopsia TE è accuratamente descritto insieme alle successive procedure di vitrificazione, riscaldamento e trasferimento necessarie. Il flusso di lavoro qui descritto è ideale per un'unità PGT occupata.

Come già descritto in precedenza dal nostro gruppo^4,5, la procedura prevede l'apertura sequenziale della zona pellucida di blastocisti completamente espansi e la rimozione di poche cellule TE (in media 7-8). Rispetto al giorno 3 metodo di biopsia di schiusa-assistita da raggi⁶, questa procedura potrebbe facilitare l'orario giornaliero di un'unità di fecondazione in vitro in cui devono essere eseguite tempestivamente procedure delicate, come la biopsia blastocisti e la vitrificazione. Non appena la blastocisti raggiunge la sua piena espansione, la biopsia può essere effettuata selezionando le cellule TE da rimuovere, impedendo così il rischio di ernia della massa cellulare interna (ICM), che altrimenti renderebbe la procedura impegnativa. In letteratura, è stato descritto anche un terzo protocollo di biopsia di blastocisti, che comporta la schiusa assistita dal laser eseguita una volta che l'embrione ha già raggiunto lo stadio di blastocisti, poche ore prima della procedura^5,7. Tuttavia, questo approccio richiede più tempo e si adatta principalmente alle unità di fecondazione in vitro che implementano la biopsia TE nelle mani di operatori con esperienza limitata e in considerazione di un carico di lavoro giornaliero moderato-basso.

L'iniezione intracitoplasmatica di spermatoi (ICSI)⁸ dovrebbe essere una tecnica consolidata se si mira a condurre analisi genetiche nella fecondazione in vitro. Allo stesso modo, un sistema di coltura adeguato per raccogliere in modo sicuro gli embrioni allo stadio di blastocisti è fondamentale per l'attuazione della strategia di biopsia TE. Un numero adeguato di incubatori, così come l'uso di bassa tensione di ossigeno sono prerequisiti fondamentali a tal fine, per non compromettere il tasso di blastocisti⁹. Allo stesso tempo, è necessario un programma di crioconservazione efficiente per gestire in modo sicuro un ciclo PGT. Nell'ultimo decennio, l'attuazione della vetrificazione ha aumentato i tassi di crio-sopravvivenza degli embrioni anche fino a >99%^10,11. Ciò ha fornito tempo sufficiente per eseguire test genetici e rinviare il trasferimento dell'embrione al successivo ciclo mestruale, su un endometrio non stimolato e probabilmente più ricettivo¹².

Sia la biopsia TE che la vitrificazione richiedono attività rigorose e la loro efficacia può variare a seconda degli operatori non esperti. Si propongono pertanto un periodo di formazione specifico prima di consentire a ciascun operatore di eseguire clinicamente queste procedure; inoltre, il mantenimento delle competenze degli operatori dovrebbe essere valutato periodicamente monitorando gli indicatori chiave di prestazione (KPI) per le procedure di crioconservazione e biopsia. Ogni clinica di fecondazione in vitro dovrebbe fissare KPI interni a tal fine, che deve approssimare quelli pubblicati dai consorzi internazionali e/o i risultati pubblicati dai laboratori di riferimento.

La biopsia TE, il riscaldamento della vitrificazione e le procedure di testimonianza sono tecniche convalidate presso la nostra unità, che sono state standardizzate in tutti gli operatori coinvolti come riportato in tre precedenti pubblicazioni^11,13,14 .

Protocollo

Il protocollo per la biopsia della blastocisti umana, qui descritto, segue le linee guida del Comitato Etico della ricerca umana G.EN.E.R.A.

NOT: Fare riferimento alla Tabella dei materiali per i materiali necessari. Ulteriori materiali necessari riguardano calzature e abiti da laboratorio, maschera chirurgica, copertura per capelli, guanti chirurgici, un marcatore permanente non tossico, pinze e disinfettante. L'uso di abito chirurgico, guanti chirurgici usa e getta, maschera per il viso, copertura dei capelli è obbligatorio per prevenire il rischio di contaminazione. Tutte le aree di lavoro, così come le attrezzature coinvolte nel processo, devono essere pulite accuratamente con disinfettante di laboratorio (ad esempio, Oosafe) prima di iniziare qualsiasi procedura. Tutti i materiali di consumo e i supporti utilizzati devono essere sterili e confezionati singolarmente o a pacchetto. Si consiglia di utilizzare una postazione di lavoro dedicata per la biopsia e i tubi e limitare l'accesso dell'area solo agli operatori coinvolti nella procedura (embriologo e testimone).

1. Preparazione il giorno prima della procedura di biopsia

1. Preparare il piatto di cultura post biopsia.
   1. Mettere 6 gocce di 20 - Vesso medio (Tabella dei materiali) in un piatto di coltura fecondazione in vitro e sovrapporre con 6 mL di olio minerale preriscaldato per la coltura embrionale ( Tabella deimateriali).
   2. Aggiungere altri 10 -L di supporto di coltura FIV ad ogni goccia. Incubare durante la notte a 37 gradi centigradi in un'atmosfera controllata (5% O₂, 6% CO₂).
2. Preparare un piatto di fecondazione in vitro a 4 pozzetti per il risciacquo della blastocisti dopo la biopsia.
   1. Posizionare 600 -L di mezzo di coltura fiocco nei primi due pozzi e sovrapporli con 300 l di olio minerale preriscaldato per la coltura embrionale.
   2. Incubare durante la notte a 37 gradi centigradi in un'atmosfera controllata (5% O₂, 6% CO₂).
3. Distribuisce 1,5 - di soluzione di carico (Tabella dei materiali) in ogni tubo PCR da utilizzare per il tubing delle cellule TE, ruotarlo e tenerlo a 4 gradi centigradi.

2. Preparazione il giorno della procedura di biopsia

1. Preparare il piatto di biopsia.
   1. Mettete 3 gocce di 10L di mezzo tampone HEPES (integrato con albumina siero umano) (Tabella dei materiali) in fila in un piatto di coltura di fecondazione in vitro.
   2. Ripetere il passaggio 1.1.1 in base al numero di blastocisti disponibili (fino a 4 blastocisti per piatto) e sovrapporli con 6 mL di olio minerale preriscaldato per la coltura embrionale.
   3. Incubare il piatto a 37 gradi centigradi per almeno 1 h prima di eseguire la procedura di biopsia.

3. Selezione e gradazione Blastocyst

1. Classificare la blastocisti in base alla sua espansione e all'aspetto morfologico di ICM e TE (Figura 1).
   NOTA: I criteri di classificazione sono stati adattati da Gardner e Schoolcraft¹⁵ e precedentemente descritti da Capalbo et al. e Cimadomo et al.^4,11.
   1. Definire le dimensioni e il grado di espansione come: A per una blastocisti completamente tratteggiata, B per una blastocisti di schiusa, C per una blastocisti completamente espansa e D per una blastocisti non espansa (questi embrioni vengono biopsiati solo se non si sono espansi ulteriormente fino al giorno 7).
   2. Definire il grado ICM: 1 per iCM evidente con diverse celle rigorosamente imballate; 2 per distinguibili con diverse cellule ma grossolanamente imballate; 3 per difficile distinguere con pochissime cellule di bassa qualità.
   3. Definire il grado TE come segue: 1 per l'epitelio ben organizzato con diverse cellule; 2 per epitelio sciolto con poche cellule; 3 per poche e/o grandi celle di bassa qualità.

4. Biopsia del tristoderlo

1. Esegui la biopsia TE su tutte le blastociti completamente espanse (preferibilmente di grado C per le dimensioni e l'espansione).
2. Set pipette di detenzione e biopsia per ogni procedura di biopsia. Le raccomandazioni per la pipetta biopsia sono le seguenti: diametro interno di 30 m, angolo di piegatura di 35 gradi, punta di distanza di 0,75 mm da piegare.
3. Etichettare il piatto di biopsia con i dettagli del paziente (nome e cognome della donna, data di nascita e ID) e quindi numerare ogni goccia con ID embrionale e ciclo. Utilizzare un marcatore permanente non tossico.
4. Trasferire la blastocisti con una pipetta di stripping di 300 m alla prima goccia del piatto di biopsia e sciacquarla per rimuovere l'eccesso di mezzo di coltura. Quindi spostare la blastocisti nella seconda goccia del piatto di biopsia.
5. Spostare il piatto al microscopio invertito e innescare la pipetta biopsia aspirando qualche mezzo dalla terza goccia del piatto di biopsia.
6. Con un ingrandimento di 20 x, orientare la blastocisti per avere una visione chiara dell'ICM. Quando viene visualizzato a ore 7 (opposto all'area che sarà mirata a rimuovere le cellule TE), fissare l'embrione sulla pipetta di contenimento (Figura 2a).
7. Concentrarsi sulla zona pellucida e verificare che sia le pipette che la blastocisti siano sullo stesso piano focale.
8. Passare all'obiettivo laser (tempo di impulso 0,3 ms, 6,5 m) e posizionare il puntatore laser sulla zona pellucida sul lato opposto di ICM. Perforare la zona pellucida attraverso 2-3 impulsi laser (Figura 2b).
9. Premere delicatamente la pipetta biopsia contro la zona pellucida e soffiare qualche mezzo attraverso la breccia per staccare le cellule TE dalla sua superficie interna e accelerare il crollo blastocisti (Figura 2c).
10. Una volta che il TE è staccato (Figura 2d), entrare attraverso il foro (se necessario, renderlo più ampio con un ultimo impulso laser) e aspirare poche cellule TE (idealmente 7-8^13,16) nella pipetta biopsia con aspirazione delicata (Figura 2e).
11. Spostare leggermente la pipetta biopsia all'indietro applicando un'aspirazione moderata per allungare le celle bersaglio (Figura 2f).
12. Dirigere il laser verso la parte più sottile delle cellule aspirate e sparare impulsi laser 2-5 alle giunzioni tra le cellule per separare le cellule bersaglio dal corpo dell'embrione (Figura 2g). La tempistica degli impulsi laser e il numero di impulsi possono essere regolati in base alla qualità della blastocisti; tuttavia, cercare di minimizzarli per evitare la lisi cellulare.
13. Dopo la separazione del frammento di TE dalla blastocisti (Figura 2h), rilasciarlo nella stessa biopsia goccia lontano dalla blastocisti. Ciò è necessario per evitare che vengano risucchiati nella pipetta biopsia (Figura 2i).
14. Rilasciare la blastocisti dalla pipetta di possesso e sollevare prontamente entrambe le pipette per evitare che il frammento si attacchi a loro.
15. Scattare una foto del frammento biopsiato a scopo di controllo di qualità (Figura 3).
    NOTA: Se si vuole biopsia su più di una blastocisti per procedura (fino a quattro per piatto di biopsia), modificare la pipetta di biopsia con una nuova per evitare la contaminazione incrociata tra embrioni.
16. Ripetere i passaggi 4.1/4.13.
17. Riportare il piatto della biopsia sul cappuccio del flusso laminare.
18. Etichettare il piatto di coltura post-biopsia con l'ID coppia, e ogni goccia con l'embrione e l'ID del ciclo.
19. In presenza di un testimone, sciacquare la blastocisti nel mezzo di fecondazione in vitro pulito e, infine, spostarlo nella corrispondente goccia del piatto post-biopsia.
20. Spostare il piatto post-biopsia sull'incubatrice in un'atmosfera controllata (37 gradi centigradi, 6% CO₂, 5% O₂) fino alla vitrificazione. Si consiglia di eseguire la vetrificazione entro 30 min dalla procedura di biopsia, per evitare la riespansione della blastocisti.

5. Tubing

NOT: L'intera procedura deve essere eseguita in presenza di un testimone e all'interno del cofano a flusso laminare a temperatura ambiente. Durante la procedura, tenere i tubi PCR in un rack di tubi freddi sul ghiaccio (Figurasupplementare 1).

1. Etichettare i tubi PCR con un marcatore permanente non tossico.
   NOT: L'etichettatura deve essere eseguita come richiesto dal laboratorio genetico. Generalmente, il nome e il cognome del paziente (iniziali), l'ID coppia, l'embrione e l'ID ciclo (ad esempio: JD 12345 1.2 per l'embrione N.1 del secondo ciclo appartenente a Jane Doe il cui ID coppia è 12345). Id embrionale deve essere riportato anche in lettere sul corpo del tubo.
2. Etichettare il coperchio di un piatto di coltura da 60 mm x 15 mm (piatto di tubazione) con gli ID degli embrioni biopsied ( Figura supplementare1) e preparare due gocce da 10 gocce di soluzione di lavaggio della biopsia ( Tableof Materials) in esso.
3. Prime la pipetta di strappo di 140 m (Figura supplementare 1) con qualche soluzione di lavaggio biopsia dalla seconda goccia del piatto di tubi.
4. Posizionare il parabola di biopsia sotto lo stereoscopio per visualizzare facilmente i frammenti te.
5. Rilasciare delicatamente qualche soluzione di lavaggio biopsia sul frammento TE; quindi, caricarlo nella pipetta di stripping.
6. Spostare il frammento di TE alla seconda goccia di soluzione di lavaggio biopsia nella tubazione e sciacquarlo con attenzione 2-3 volte.
7. Trasferire il frammento di TE sul fondo del tubo PCR (precedentemente etichettato dopo di esso) con la soluzione di carico, prestando attenzione a non toccare le pareti con la punta della pipetta di stripping.
8. Ripetere la procedura dal passaggio 5.3 al passaggio 5.7 per ogni frammento di TE, prestando attenzione all'uso di un nuovo capillare per ogni frammento di TE.
9. Alla fine della procedura di tubazione, mettere tutti i tubi PCR in una mini centrifuga e ruotarli per alcuni secondi.
10. Conservare i campioni a -20 gradi centigradi fino a quando non li spedirà al laboratorio genetico di riferimento per i test.

6. Vitrificazione di Blastocyst

1. Le blastocisti collassate vitrificate entro 30 min dalla biopsia TE per impedirne la riespansione.
2. Etichettare la piastra di vetrificazione con i dettagli della donna e gli ID delle blastocisti che devono essere vetrificati.
3. Etichettare il supporto o i supporti di vetrificazione con il nome e il cognome della donna, l'ID della coppia, l'ID dell'embrione che verrà caricato su di esso, nonché la data della procedura. Vengono utilizzate etichette speciali che ne conservano l'integrità anche a temperature molto basse (-196 gradi centigradi).
4. A temperatura ambiente, erogare 0,3 mL di soluzione di equilibratura (ES) (Tabella dei materiali) per ogni blastocisti che sarà vetrificata.
5. In presenza di un testimone, spostare la blastocisti in ES utilizzando la pipetta di stripping di 300 m.
6. Lascia la blastocisti nell'ES per 13-15 min. Dopo un primo restringimento del volume, si osserverà una graduale riespansionee.
7. Riempire un piccolo rack di raffreddamento con azoto liquido (LN₂) e posizionarlo sotto il cofano a flusso laminare.
8. Distribuisci 300 l di soluzione di vitrificazione (VS) (Tabella dei materiali) nel secondo pozzo. Dopo che la blastocisti completa ri-espansione, trasferirla nella soluzione VS per 1 min e risciacquarla per diluire l'ES.
9. In presenza di un testimone, caricare la blastocisti sul supporto di vitrificazione e prendersi cura di rimuovere l'eccesso di VS. Un sottile film di soluzione dovrebbe circondare la blastocisti.
10. Immergere il supporto della vetrificazione in LN₂ e spostarlo energicamente al fine di ridurre il rischio di formazione di bolle vicino al campione.
11. Posizionare il tappo protettivo mantenendo il supporto di vitrificazione immerso nella LN_2.
12. In presenza di un testimone, spostare il supporto di vitrificazione in un serbatoio di stoccaggio LN₂ a lungo termine.

7. Restringimento artificiale delle Blastocisti non biopsied

1. Se non viene eseguita alcuna biopsia TE, comprimere artificialmente le blastocisti immediatamente prima della vitrificazione (Figura 4).
   1. Spostare il piatto di coltura dall'incubatrice al microscopio invertito e concentrarsi sull'embrione selezionato.
   2. Passare all'obiettivo laser (impulso preimpostato: 0,3 ms, 6,5 m), prendere di mira la zona pellucida sul lato opposto dell'ICM, quindi dirigere 1–2 impulsi laser verso le giunzioni tra le celle TE a una distanza di sicurezza dall'ICM. Le blastocisti dovrebbero collassare in meno di 5 min.
2. Procedere con la vetrificazione della blastocisti collassata come descritto nella sezione 6.

8. Riscaldamento Blastocisti trasferibili

1. Il giorno dell'ET, preparare la piastra ET 4 pozzetti mettendo per ogni pozzo 600 gradi di supporto di coltura in fecondazione in vitro pre-equilibrato. Incubare a 37 gradi centigradi in un'atmosfera controllata (5% O₂, 6% CO_2),durante l'esecuzione del riscaldamento blastocisti.
2. Etichettare il piatto riscaldante con il nome della donna e cognome, coppia ID, ID dell'embrione che sarà riscaldato in esso.
3. Distribuisci 1 mL della soluzione di scongelamento (TS) (Tabella dei materiali) in un piatto di fecondazione in vitro ( Figura supplementare1) e riscaldarlo a 37 gradi centigradi in un termostato per almeno 1 h prima di iniziare la procedura.
4. Riempire un piccolo supporto di raffreddamento con LN₂ e posizionarlo nella cappa di flusso laminare nelle immediate vicinanze dell'area di lavoro.
5. Prima di iniziare la procedura, controllare le informazioni sulla blastocisti riportate sul supporto della vetrificazione. Tutti gli ID devono corrispondere al rapporto genetico e la blastocisti al caldo deve essere scelta tra quelle trasferibili. Durante la procedura è necessario un testimone.
6. Prendere il piatto di un pozzo contenente TS riscaldato dal termostato e posizionarlo su un palco riscaldato sotto lo stereoscopio.
7. Tirare sopra il tappo protettivo all'interno della LN₂ usando i pinze.
8. Immergete rapidamente la punta del supporto per la vetrificazione nel 37 .
9. Sotto osservazione microscopica, spostare delicatamente il supporto di vitrificazione fino a quando la blastocisti non viene rilasciata dalla punta.
10. Lasciare la blastocisti per un totale di 1 min nel TS, prestando attenzione a tenerlo in fondo al TS.
11. A temperatura ambiente erogare 200 - L di soluzione di diluizione (DS) (Tabella dei materiali) sul primo pozzo della piastra di vitrificazione.
12. Trasferire la blastocyst a DS e posizionarla nella parte inferiore del pozzo mentre si rilascia no, mentre si rilasciano alcuni TS sulla parte superiore di esso per creare una sorta di gradiente. Lasciare per 3 min.
13. Distribuisci 200 - L di soluzione di lavaggio (WS) in 2 pozzi diversi (WS1 e WS2).
14. Trasferire la blastocisti a WS1 e posizionarla sul fondo del pozzo mentre si rilascia un po 'di supporto DS sulla parte superiore di esso. Quindi trasferire la blastocisti a WS2 e lasciarlo indisturbato per 1 min.
15. Etichettare la piastra ET post-riscaldamento con il nome e il cognome della donna, id coppia, ID dell'embrione che verrà coltivato in esso.
16. In presenza di un testimone, trasferire la blastocisti riscaldata al mezzo culturale pre-equilibrato nella piastra ET post-riscaldamento.
17. Sciacquare la blastocisti nel primo pozzo della piastra ET e posizionarlo nel secondo pozzo.
18. Trasferire il piatto di coltura post-riscaldamento all'incubatrice in un'atmosfera controllata (37 gradi centigradi, 6% CO₂, 5% O₂) e la coltura della blastocisti per almeno 1,5 h prima di controllarne la sopravvivenza e la riespansione.
    NOT: La figura 5 mostra esempi di blastocisti degenerati, crio-sopravvissuti ma non riespansi e crio-sopravvissuti e completamente espansi.

9. EmbryoTransfer

1. Per eseguire ET, posizionare il piatto sullo stadio riscaldato della cappa di flusso laminare, in modo che l'embrione sia visibile al microscopio a un basso ingrandimento.
2. Prendere circa 0,4 mL di fecondazione in vitro medio di coltura. Fissare saldamente la punta della siringa nell'estremità ricevente del catetere interno e quindi rilasciare il supporto fino a 0,1 mL.
3. Mezzo di coltura aspirato fino all'osservazione degli embrioni che entrano nel catetere (quantità minima di supporti: 10-15 L).
4. Posizionare il catetere nella custodia di plastica e andare in sala operatoria e posizionare il catetere interno nella guida esterna.
5. Una volta raggiunto l'utero, spingere lo stantuffo della siringa per rilasciare l'embrione(s). Rilasciare molto lentamente il mezzo fino a quando lo stantuffo legge 0,1 mL.
6. Riportare il catetere in laboratorio e controllare al microscopio che l'embrione sia stato trasferito.

Risultati

La figura 6 rappresenta uno schema di tutti i risultati di una procedura di biopsia che può essere adottata per standardizzare il protocollo e monitorare le prestazioni di ciascun operatore. Il principale risultato procedurale è la tempistica per completare la biopsia/biopsia; il principale risultato tecnico è la qualità della trama prodotta dopo i test genetici che potrebbero portare a una diagnosi conclusiva o inconcludente, quest'ultima delle quali ric...

Discussione

Solo gli embriologi esperti di esperti che hanno completato il loro periodo di formazione dovrebbero eseguire sia la biopsia TE che la vitrificazione della blastocisti. Inoltre, un testimone è tenuto a monitorare le procedure e garantire un'efficiente tracciabilità durante i) i movimenti della blastocisti biopsied dal piatto di biopsia ( Figura supplementare1) alla parabola post-biopsia (Figurasupplementare 1 ), quindi alla targhetta di vitrificazione (figura supplementare 1

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Cold tube rack	Biocision	XTPCR96
Electronic pipette controller	Fisher Scientific	710931
Flexipet adjustable handle set	Cook	G18674	Stripper holder
Gilson Pipetman	Gilson	66003	p20
IVF Electronic Witness System	CooperSurgical Fertility & Genomic Solutions		RI Witness ART Management System
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TE2000-U
Laminar Flow Hood	IVF TECH		Grade A air flow
Laser objective	RI	Saturn 5
Microinjectors	Nikon Narishige	NT-88-V3
Mini centrifuge for PCR tubes	Eppendorf	CSLQSPIN	for 0.2ml PCR tubes
Stereomicroscope	Leica	Leica M80
Thermostat	Panasonic	MCO-5AC-PE
Tri-gas incubator	Panasonic	MCO-5M-PE	02/CO2
Consumables
Biopsy pipette	RI	7-71-30FB35720	30µm ID, flat 35°C
Cryolock	Cryolock	CL-R-CT
CSCM complete	Irvine Scientific	90165	IVF culture medium supplemented with HSA
Embryo Transfer Catheter	Cook	G17934
Flexipet pipette	Cook	G26712	140µm stripping pipette tip
Flexipet pipette	Cook	G46020	300µm stripping pipette tips
Holding pipette	RI	7-71-IH35/20	30µm ID, flat 35°C
Human Serum Albumin	Irvine Scientific	9988
IVF One well dish	Falcon	353653
Mineral Oil for embryo culture	Irvine Scientific	9305
Modified HTF Medium	Irvine Scientific	90126	Hepes-Buffered medium
Nuclon Delta Surface	Thermofisher scientific	176740	IVF dish 4-well plate with sliding lid
Primaria Cell culture dish	Corning	353802	60x15mm
Reproplate	Kitazato	83016
Serological pipette	Falcon	357551	10ml
Sterile disposable Gilson tips	Eppendorf	0030 075.021	200µl
Tubing Kit	Provided by the genetic lab		PCR tubes (0.2mL), loading solution, biopsy washing solution
Vitrification media	Kitazato	VT801	Equilibration and vitrification solutions
Warming media	Kitazato	VT802	Thawing and dilution solutions