Biópsia e vitrificação humana do Blastocyst

Resumo

A biópsia e a vitrificação do Blastocyst são exigidas para conduzir eficientemente o teste genético do pré-implante. Uma aproximação que implica a abertura seqüencial da zona pelúcida e a recuperação de 7-8 pilhas do trofectoderma no dia 5-7 pós-inseminação limita o número de manipulações exigidas e a exposição do embrião às condições ambientais suboptimal.

Resumo

A biópsia do Blastocyst é executada para obter um diagnóstico genético de confiança durante ciclos de IVF com teste genético do pré-implante. Em seguida, o fluxo de trabalho ideal implica um protocolo de vitrificação seguro e eficiente, devido ao tempo de resposta das técnicas diagnósticas e à transferência do (s) embrião (es) selecionado em um endométrio fisiológico em um ciclo natural seguinte. Uma aproximação da biópsia que abrange a abertura seqüencial do pelúcida da zona e a recuperação de 5-10 pilhas do trofectoderma (idealmente 7-8) limita o número de manipulações exigidas e a exposição do embrião às condições ambientais suboptimal. Após o treinamento adequado, a técnica foi reprodutível em diferentes operadores em termos de tempo de biópsia (~ 8 min, variando de 3-22 min com base no número de embriões para biópsia por prato), diagnósticos conclusivos obtidos (~ 97,5%) e taxas de natalidade ao vivo após a transferência de blastocisto de euplóide vitrificado-aquecido (> 40%). A taxa de sobrevida após biópsia, vitrificação e aquecimento foi tão alta quanto 99,8%. A taxa da re-expansão em 1,5 h do aquecimento era tão elevada quanto 97%, pela maior parte dependente do sincronismo entre a biópsia e a vitrificação (idealmente ≤ 30 minutos), a qualidade morfológica do blastocisto e o dia da biópsia. Em geral, é melhor vitrificar um blastocist colapsado; Conseqüentemente, em ciclos da não-PGT, o encolhimento artificial laser-ajudado pôde ser executado para induzir o colapso do embrião antes da criopreservação. A perspectiva futura a mais prometedora é a análise não invasora dos meios de cultura do IVF após a cultura do blastocisto como uma fonte putativo do ADN embrionário. No entanto, este potencial avant-garde ainda está investigação e um protocolo confiável ainda precisa ser definido e validado.

Introdução

O principal objetivo da embriologia humana moderna é maximizar o número de nascidos vivos por ciclo estimulado e reduzir custos, tempo e esforços para conseguir uma gravidez. Para atingir esse objetivo, devem ser empregadas abordagens validadas para a seleção de embriões para identificar embrião reproductivamente competentes dentro de uma coorte obtida durante um ciclo de FIV. De acordo com as evidências as mais atrasadas, a cultura¹ do blastocisto combinada com o teste cromossomático detalhado e transferência Vitrified-aquecida do embrião do ADN (et) é a estrutura a mais eficiente para aumentar a eficiência²de IVF. Claramente, o teste de aneuploidia requer um espécime embrionário, que presentemente é representado na maior parte de poucas pilhas recuperadas do trofectoderma (te), isto é, a seção do blastocisto que dá a origem aos anexos do embrião (por exemplo, a placenta) durante a gravidez . Além da análise do karyotype, também as únicas mutações genéticas puderam ser avaliadas de uma biópsia do te como parte de uma estratégia clínica conhecida como o teste genético do preimplante (PGT;-a para aneuploidies,-Sr para rearranjos cromossomáticos estruturais,-M para doenças monogênica). Outros métodos da biópsia do oocyte/embrião foram teorized e adotados clìnica através das últimas décadas, a saber biópsia dos corpos polares e biópsia do blastômero. No entanto, a sua utilização é reduzida nos dias de hoje, uma vez que as suas desvantagens processuais (por exemplo, maior carga de trabalho e risco de impacto reprodutivo) e limitações diagnósticas (por exemplo, problemas de análise de células únicas) impedem implicitamente um equilíbrio suficiente entre custos, riscos e benefícios (para uma revisão ver³).

Neste trabalho, um dos principais protocolos para a biópsia TE é completamente descrito juntamente com os procedimentos subsequentes de vitrificação, aquecimento e transferência necessários. O fluxo de trabalho aqui descrito é ideal para uma unidade PGT ocupada.

Como já descrito anteriormente pelo nosso grupo^4,5, o procedimento envolve a abertura sequencial da zona pelúcida de blastocistos totalmente expandidos e remoção de poucas células te (em média 7-8). Comparado ao dia 3 laser-ajudado a incubação-baseou o método⁶da biópsia do blastocisto, este procedimento pôde facilitar a programação diária de uma unidade de IVF onde os procedimentos delicados, tais como a biópsia e a vitrificação do blastocisto, devam ser executados oportuna. Assim que o blastocisto alcança sua expansão cheia, a biópsia pode ser realizada selecionando as pilhas do te a remover, assim impedindo o risco do herniation da massa interna da pilha (ICM), que de outra maneira tornaria o procedimento desafiante. Na literatura, um terceiro Protocolo da biópsia do blastocisto foi descrito igualmente, que envolva o incubação laser-ajudado que está sendo executado uma vez que o embrião já alcangou o estágio do blastocisto, poucas horas antes do procedimento^5,7. Entretanto, esta aproximação é mais demorada e sere principalmente as unidades de IVF que estão implementando a biópsia do te nas mãos de operadores limitadamente experimentados e em vista de uma carga de trabalho diária moderada-baixa.

A injeção intracytoplasmatic do esperma (ICSI)⁸ deve ser uma técnica consolidada se visando conduzir análises genéticas em IVF. Da mesma forma, um sistema de cultura adequado para a colheita segura de embriões para o estágio de blastocist é crucial para a implementação da estratégia de biópsia de TE. Um número adequado de incubadoras, bem como o uso de baixa tensão de oxigênio são pré-requisitos chave para este fim, para não comprometer a taxa de blastocist⁹. Ao mesmo tempo, um programa de criopreservação eficiente é necessário para gerenciar com segurança um ciclo de PGT. Na última década, a implantação da vitrificação impulsionou as taxas de criosobrevivência embrionária até > 99%^10,11. Isso proporcionou tempo suficiente para realizar testes genéticos e adiar a transferência de embriões para o seguinte ciclo menstrual, em um endométrio não estimulado e provavelmente mais receptivo¹².

Tanto a biópsia de TE quanto a vitrificação são tarefas exigentes que exigem habilidades rigorosas e sua eficácia pode variar em operadores não experientes. Um período de formação específico é, portanto, defendido antes de permitir que cada operador realize estes procedimentos clinicamente; Além disso, a manutenção das competências dos operadores deve ser avaliada periodicamente através da monitorização dos indicadores-chave de desempenho (KPI) para os procedimentos de criopreservação e biópsia. Cada clínica de fertilização in vitro deve definir KPIs internos para esse fim, que devem aproximar os publicados por consórcios internacionais e/ou os resultados publicados por laboratórios de referência.

Os procedimentos de biópsia, vitrificação-aquecimento e testemunhando são técnicas validadas em nossa unidade, que foram padronizadas em todos os operadores envolvidos, conforme relatado em três publicações anteriores^11,13,14 .

Protocolo

O protocolo para a biópsia humana do blastocisto, descrito aqui, segue as directrizes do Comitê de Ethic da pesquisa humana de G. en. a.r.a..

Nota: Consulte a tabela de materiais para materiais necessários. Material adicional necessário implica calçado de laboratório e equipamento, facemask cirúrgico, tampa do cabelo, luvas cirúrgicas, um marcador permanente não-tóxico, fórceps e desinfetante. O uso do vestido cirúrgico, luvas cirúrgicas descartáveis, facemask, tampa do cabelo é obrigatório para evitar o risco de contaminação. Todas as áreas de trabalho, bem como os equipamentos envolvidos no processo, devem ser cuidadosamente limpos com desinfetante laboratorial (por exemplo, Oosafe) antes de iniciar qualquer procedimento. Todos os consumíveis e meios de comunicação utilizados devem ser estéreis e embalados individualmente ou aliquotados. Sugere-se a utilização de uma estação de trabalho dedicada para biópsia e tubulação e limitar o acesso da área apenas para os operadores envolvidos no procedimento (embriologista e testemunha).

1. preparação no dia anterior ao procedimento de biópsia

1. Prepare o prato de cultura pós-biópsia.
   1. Coloque 6 gotas de 20 μL de meio de cultura IVF (tabela de materiais) em um prato de cultura IVF e sobreposição com 6 ml de óleo mineral pré-aquecido para cultura embrionária (tabela de materiais).
   2. Adicione mais 10 μL de meio de cultura IVF a cada gota. Incubar durante a noite a 37 ° c numa atmosfera controlada (5% O₂, 6% co₂).
2. Prepare uma placa do prato de IVF 4-well para enxaguar o blastocisto após a biópsia.
   1. Colocar 600 μL de meio de cultura de fertilização in vitro nos dois primeiros poços e sobrepor com 300 μL de óleo mineral pré-aquecido para cultura embrionária.
   2. Incubar durante a noite a 37 ° c numa atmosfera controlada (5% O₂, 6% co₂).
3. Dispense 1,5 μL de solução de carga (tabela de materiais) em cada tubo de PCR a ser utilizado para tubos de células te, gire-o e mantenha-o a 4 ° c.

2. preparação no dia do procedimento de biópsia

1. Prepare o prato de biópsia.
   1. Coloque 3 gotas de 10 μL de meio tamponado HEPES (suplementado com albumina sérica humana) (tabela de materiais) em uma fileira em um prato de cultura IVF.
   2. Repita o passo 1.1.1 de acordo com o número de blastocistos disponíveis (até 4 blastocistos por prato) e sobreposição com 6 mL de óleo mineral pré-aquecido para a cultura embrionária.
   3. Incubar o prato a 37 ° c durante pelo menos 1 h antes de realizar o procedimento de biópsia.

3. seleção e nivelamento do Blastocyst

1. Classific o blastocisto de acordo com sua expansão e a aparência morfológica de ICM e de te (Figura 1).
   Nota: os critérios de nivelamento foram adaptados de Gardner e Schoolcraft¹⁵ e descritos anteriormente por Capalbo et al. e Cimadomo et al.^4,11.
   1. Defina o tamanho e a classe da expansão como: a para um blastocisto inteiramente-chocado, B para um blastocisto de eclosão, C para um blastocisto inteiramente expandido, e D para um blastocisto não expandido (estes embriões são biópsia somente se não se expandiram mais até o dia 7).
   2. Defina a classe ICM: 1 para o ICM perceptível com diversas pilhas estritamente-embaladas; 2 para discernable com diversas mas aproximadamente-pilhas embaladas; 3 para difícil distinguir com muito poucas células de baixa qualidade.
   3. Definir TE grau da seguinte maneira: 1 para epitélio bem organizado com várias células; 2 para o epitélio frouxo com poucas pilhas; 3 para poucas e/ou grandes células de baixa qualidade.

4. biópsia do trophectoderm

1. Realize a biópsia de TE em todos os blastocistos totalmente expandidos viáveis (preferivelmente classe de C para o tamanho e a expansão).
2. Ajuste as pipetas da terra arrendada e da biópsia para cada procedimento da biópsia. As recomendações para a pipeta da biópsia são as seguintes: diâmetro interno de 30 μm, ângulo de curvatura de 35 °, ponta da distância de 0,75 milímetros à curvatura.
3. Rotule o prato de biópsia com os detalhes do paciente (nome e sobrenome da mulher, data de nascimento e ID) e, em seguida, número de cada gota com embriões e IDs de ciclo. Use um marcador permanente não-tóxico.
4. Transfira o blastocisto com uma pipeta de descascamento de 300 μm à primeira gota do prato da biópsia e enxague-a a fim remover o excesso de meio de cultura. Em seguida, mova o blastocisto na segunda gota do prato de biópsia.
5. Mova o prato para o microscópio invertido e prime a pipeta de biópsia aspirando algum meio da terceira gota do prato de biópsia.
6. Na ampliação 20x, Oriente o blastocisto para ter uma vista desobstruída do ICM. Quando é visualizado às 7 horas (oposto à área que será alvejada para remover as pilhas de TE), prenda o embrião na pipeta da terra arrendada (Figura 2a).
7. Concentre-se na zona pelúcida e verificar que ambas as pipetas e o blastocist estão no mesmo plano focal.
8. Mude para o objetivo do laser (tempo de pulso 0,3 ms, 6,5 μm) e posicione o ponteiro laser na zona pelúcida no lado oposto do ICM. Perfure a zona pelúcida através de pulsos laser 2 − 3 (Figura 2b).
9. Pressione suavemente a pipeta de biópsia contra a zona pelúcida e soprar algum meio através da ruptura para separar as células te de sua superfície interna e acelerar o colapso do blastocisto (Figura 2C).
10. Uma vez que o te é destacado (Figura 2D), incorpore através do furo (se exigido, faça-o mais largo com um último pulso do laser) e aspirado poucas pilhas do te (idealmente 7 − 8^13,16) na pipeta da biópsia com sucção delicada (Figura 2e).
11. Mova levemente a pipeta da biópsia para trás ao aplicar uma sucção moderada para esticar as células-alvo (Figura 2F).
12. Direcionar o laser para a parte mais fina das células aspiradas e disparar 2 a 5 pulsos de laser nas junções entre as células para separar as células-alvo do corpo do embrião (Figura 2G). O sincronismo de pulsos do laser e o número de pulsos podem ser ajustados de acordo com a qualidade do Blastocyst; no entanto, tente minimizá-los para evitar a lise celular.
13. Após a separação do fragmento te do blastocist (Figura 2h), libere-o na mesma gota da biópsia longe do blastocisto. Isso é necessário para evitar que eles sejam sugados novamente para a pipeta de biópsia (Figura 2i).
14. Libere o blastocist da pipeta da terra arrendada e levante prontamente ambas as pipetas para impedir que o fragmento fure-lhes.
15. Tirar uma foto do fragmento biopsiado para fins de controle de qualidade (Figura 3).
    Nota: se mais do que um único blastocisto deve ser biopsiado por procedimento (até quatro por prato de biópsia), mude a pipeta de biópsia com uma nova para evitar a contaminação cruzada entre os embriões.
16. Repita os passos 4.1 − 4.13.
17. Mova o prato de biópsia de volta para a capa de fluxo laminar.
18. Rotule o prato de cultura pós-biópsia com o ID do casal e cada gota com o embrião e o ID do ciclo.
19. Na presença de uma testemunha, enxague o blastocisto no meio limpo de IVF, e mova-o por último a sua gota correspondente do prato da borne-biópsia.
20. Mova o prato pós-biópsia para a incubadora em uma atmosfera controlada (37 ° c, 6% CO_2,5% O₂) até a vitrificação. É aconselhável realizar a vitrificação dentro de 30 minutos do procedimento da biópsia, para impedir o re-Expansion do blastocisto.

5. tubulação

Nota: O procedimento inteiro deve ser realizado na presença de uma testemunha e dentro da capa do fluxo laminar na temperatura ambiente. Durante o procedimento, mantenha os tubos do PCR em uma cremalheira fria do tubo no gelo (Figura suplementar 1).

1. Rotule os tubos do PCR com um marcador não-tóxico permanente.
   Nota: A rotulagem deve ser realizada conforme solicitado pelo laboratório genético. Geralmente, o nome e sobrenome do paciente (iniciais), ID do casal, embrião e ID do ciclo (por exemplo: JD 12345 1,2 para o embrião N. 1 do 2º ciclo pertencente a Jane Doe cujo par ID é 12345). A identificação do embrião deve ser relatada também nas letras no corpo do tubo.
2. Rotule a tampa de um prato de cultura de 60 mm x 15 mm (prato de tubos) com os IDs de embriões biopsiados (Figura complementar 1) e prepare 2 10 μL de gotas de solução de lavagem de biópsia (tabela de materiais).
3. Prima a pipeta de descascamento de 140 μm (Figura complementar 1) com alguma solução de lavagem da biópsia da segunda gota do prato da tubulação.
4. Coloque o prato de biópsia o estereomicroscópio para visualizar facilmente o (s) fragmento (es) TE.
5. Libere delicadamente alguma solução de lavagem da biópsia em cima do fragmento do TE; em seguida, coloque-o na pipeta de decapagem.
6. Mova o fragmento TE para a segunda gota da solução de lavagem da biópsia no prato da tubulação e enxague-o com cuidado 2 − 3 vezes.
7. Transfira o fragmento TE para a parte inferior do tubo de PCR (previamente rotulado após ele) com a solução de carga, prestando atenção para evitar tocar suas paredes com a ponta da pipeta de decapagem.
8. Repita o procedimento da etapa 5,3 para a etapa 5,7 para cada fragmento de TE, prestando atenção ao uso de um novo capilar para cada fragmento de TE.
9. No fim do procedimento da tubulação, põr todos os tubos do PCR em um mini centrifugador, e gire-os por poucos segundos.
10. Guarde as amostras a-20 ° c até os enviar para o laboratório genético de referência para teste.

6. vitrificação do Blastocyst

1. Vitrify colapsou blastocistos dentro de 30 minutos da biópsia do te para impedir seu re-Expansion.
2. Rotule a placa de vitrificação com detalhes da mulher e os IDs dos blastocistos que devem ser vitrificados.
3. Rotule o suporte (s) de vitrificação com o nome e sobrenome da mulher, ID do casal, ID do embrião que será carregado nele, bem como a data do procedimento. Os cryolabels especiais são usados que preservam sua integridade mesmo na temperatura muito baixa (-196 ° c).
4. À temperatura ambiente, dispensar 0,3 mL de solução de equilíbrio (ES) (tabela de materiais) para cada blastocisto que será vitrificado.
5. Na presença de uma testemunha, mova o blastocist no ES usando a pipeta de descascamento de 300 μm.
6. Deixe o blastocist no ES por 13 − 15 min. Após um encolhimento inicial do volume, uma re-expansão gradual será observada.
7. Encha uma cremalheira refrigerando pequena com nitrogênio líquido (LN₂) e coloc a a capa do fluxo laminar.
8. Dispensar 300 μL de solução de vitrificação (VS) (tabela de materiais) no segundo poço. Após a re-expansão completa do blastocist, transfira-a na solução de VS por 1 minuto e enxague-a para diluir o ES.
9. Na presença de uma testemunha, carregar o blastocisto sobre o suporte de vitrificação e cuidar de remover o excesso de VS. Uma película subtil da solução deve cercar o Blastocyst.
10. Mergulhe o suporte de vitrificação no LN₂ e mova-o energeticamente a fim de reduzir o risco de formação de bolhas perto da amostra.
11. Coloque a tampa protetora enquanto mantém o suporte de vitrificação submerso no LN_2.
12. Na presença de uma testemunha, mova o suporte de vitrificação em um tanque de armazenamento LN₂ de longo prazo.

7. encolhimento artificial de blastocistos não biopsied

1. Se não for realizada biópsia de TE, colapsar artificialmente os blastocistos imediatamente antes da vitrificação (Figura 4).
   1. Mova o prato de cultura da incubadora para o microscópio invertido e concentre-se no embrião selecionado.
   2. Mude para o objetivo do laser (pulso pré-ajustado: 0,3 ms, 6,5 μm), alvo a zona pelúcida no lado oposto de ICM, a seguir dirija pulsos do laser 1 – 2 às junções entre pilhas do te a uma distância segura do ICM. Os blastocistos devem entrar em colapso em menos de 5 min.
2. Proceder com a vitrificação do blastocist recolhido como descrito na secção 6.

8. aquecimento de Blastocist transferíveis

1. No dia do ET, prepare a placa ET 4-well colocando 600 μL de meio de cultura de fertilização in vitro pré-equilibrados para cada poço. Incubar a 37 ° c em atmosfera controlada (5% O₂, 6% co₂), enquanto executa O aquecimento do blastocisto.
2. Rotule o prato de aquecimento com nome e sobrenome da mulher, ID do casal, ID do embrião que será aquecido nele.
3. Dispensar 1 mL da solução de descongelar (TS) (tabela de materiais) em um prato de um poço de FIV (Figura complementar 1) e aqueça-o a 37 ° c em um termostato por pelo menos 1 h antes de iniciar o procedimento.
4. Encha um apoio refrigerando pequeno com LN₂ e coloc o na capa do fluxo laminar na proximidade próxima da área de funcionamento.
5. Antes de iniciar o procedimento, verifique a informação de blastocisto relatada no suporte de vitrificação. Todos os IDs devem combinar o relatório genético e o blastocisto ao morno deve ser escolhido entre os transferíveis. Uma testemunha é exigida durante o procedimento.
6. Tome o prato de um poço que contem TS aquecido fora do termostato e coloc o em um estágio heated o stereomicroscope.
7. Puxe a tampa protetora dentro do LN₂ usando fórceps.
8. Mergulhe rapidamente a ponta do suporte de vitrificação no TS 37 ° c.
9. a observação microscópica, mova delicadamente o apoio da vitrificação até que o blastocisto esteja liberado da ponta.
10. Deixe o blastocisto por um total de 1 min no TS, prestando atenção para mantê-lo na parte inferior do TS.
11. À temperatura ambiente dispensar 200 μL de solução de diluição (DS) (tabela de materiais) no primeiro poço da placa de vitrificação.
12. Transfira o blastocisto ao DS e coloc o na parte inferior do poço ao liberar algum TS na parte superior dele para criar uma sorte do inclinação. Deixe por 3 min.
13. Dispensar 200 μL de solução de lavagem (WS) em 2 poços diferentes (WS1 e WS2).
14. Transfira o blastocisto a WS1 e coloc o na parte inferior do poço ao liberar algum meio DS na parte superior dele. Em seguida, transfira o blastocisto para WS2 e deixe-o sem perturbações durante 1 min.
15. Rotule a placa ET pós-aquecimento com o nome e sobrenome da mulher, ID do casal, ID do embrião que será cultivado nele.
16. Na presença de uma testemunha, transfira o blastocisto aquecido ao meio de cultura pre-equilibrado na placa do et do borne-aquecimento.
17. Enxague o blastocisto no primeiro poço da placa ET e coloque-o no segundo poço.
18. Transfira o prato de cultura pós-aquecimento para a incubadora em uma atmosfera controlada (37 ° c, 6% CO_2,5% o₂) e cultura o blastocisto por pelo menos 1,5 h antes de verificar sua sobrevivência e re-expansão.
    Nota: A Figura 5 mostra exemplos de blastocistos degenerados, Cryo-sobrevividos mas não re-expandidos e Cryo-sobrevividos e totalmente expandidos.

9. EmbryoTransfer

1. Para executar o ET, coloque o prato no estágio aquecido da capa de fluxo laminar, de modo que o embrião é visível o microscópio em uma baixa ampliação.
2. Tome aproximadamente 0,4 mL do meio de cultura de IVF. Fixe a ponta da seringa firmemente na extremidade receptora do cateter interno e, em seguida, liberte o meio até 0,1 mL.
3. Aspirar meio de cultura até observar os embriões entrando no cateter (quantidade mínima de mídia: 10 − 15 μL).
4. Coloque o cateter na caixa de plástico e vá para a sala de operação e coloque o cateter interno na guia externa.
5. Uma vez atingido o útero, empurre o êmbolo da seringa para liberar o embrião (s). Solte muito lentamente o meio até que o êmbolo esteja lendo 0,1 mL.
6. Leve o cateter de volta para o laboratório e verifique o microscópio que o embrião foi transferido.

Resultados

A Figura 6 representa um esquema de todos os desfechos de um procedimento de biópsia que pode ser adotado para padronizar o protocolo e monitorar o desempenho de cada operador. O resultado processual principal é o sincronismo para terminar a biópsia/biópsias; o principal resultado técnico é a qualidade do enredo produzido após o teste genético que pode resultar em um diagnóstico conclusivo ou inconclusivo, o último dos quais requer uma re-biópsia d...

Discussão

Somente os embriologistas hábeis bem experientes que concluíram seu período de treinamento devem executar a biópsia do te e a vitrificação do blastocisto. Além disso, uma testemunha é exigida para monitorar os procedimentos e para garantir uma rastreabilidade eficiente durante i) os movimentos do blastocisto biópsia do prato da biópsia (Figura complementar 1) ao prato da borne-biópsia (Figura 1 suplementar ), depois à placa de vitrificação (Figura 1 suplementar

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Cold tube rack	Biocision	XTPCR96
Electronic pipette controller	Fisher Scientific	710931
Flexipet adjustable handle set	Cook	G18674	Stripper holder
Gilson Pipetman	Gilson	66003	p20
IVF Electronic Witness System	CooperSurgical Fertility & Genomic Solutions		RI Witness ART Management System
Inverted microscope	Nikon	Eclipse TE2000-U
Laminar Flow Hood	IVF TECH		Grade A air flow
Laser objective	RI	Saturn 5
Microinjectors	Nikon Narishige	NT-88-V3
Mini centrifuge for PCR tubes	Eppendorf	CSLQSPIN	for 0.2ml PCR tubes
Stereomicroscope	Leica	Leica M80
Thermostat	Panasonic	MCO-5AC-PE
Tri-gas incubator	Panasonic	MCO-5M-PE	02/CO2
Consumables
Biopsy pipette	RI	7-71-30FB35720	30µm ID, flat 35°C
Cryolock	Cryolock	CL-R-CT
CSCM complete	Irvine Scientific	90165	IVF culture medium supplemented with HSA
Embryo Transfer Catheter	Cook	G17934
Flexipet pipette	Cook	G26712	140µm stripping pipette tip
Flexipet pipette	Cook	G46020	300µm stripping pipette tips
Holding pipette	RI	7-71-IH35/20	30µm ID, flat 35°C
Human Serum Albumin	Irvine Scientific	9988
IVF One well dish	Falcon	353653
Mineral Oil for embryo culture	Irvine Scientific	9305
Modified HTF Medium	Irvine Scientific	90126	Hepes-Buffered medium
Nuclon Delta Surface	Thermofisher scientific	176740	IVF dish 4-well plate with sliding lid
Primaria Cell culture dish	Corning	353802	60x15mm
Reproplate	Kitazato	83016
Serological pipette	Falcon	357551	10ml
Sterile disposable Gilson tips	Eppendorf	0030 075.021	200µl
Tubing Kit	Provided by the genetic lab		PCR tubes (0.2mL), loading solution, biopsy washing solution
Vitrification media	Kitazato	VT801	Equilibration and vitrification solutions
Warming media	Kitazato	VT802	Thawing and dilution solutions