التحكم المكاني والزماني للبدء من الميلانوما من الخلايا الجذعية المتحولة للخلايا الصباغية

Summary

يصف الاجراء التالي طريقه للسيطرة المكانية والزمانيه لبدء ورم الخلايا الصباغية في الجلد الظهري المريد ، وذلك باستخدام نموذج الماوس المهندسة وراثيا. يصف هذا البروتوكول المجهرية بالاضافه إلى بدء الورم الميلاني الجلدي.

Abstract

الورم الميلاني الجلدي معروف جيدا بسرطان الجلد الأكثر عدوانيه. وعلي الرغم من استمرار توثيق عوامل الخطر والتغيرات الجينية الرئيسية بعمق متزايد ، فقد اظهر معدل الاصابه بسرطان الجلد الجلدي زيادة سريعة ومستمرة خلال العقود الاخيره. من أجل العثور علي أساليب وقائية فعاله ، من المهم ان نفهم الخطوات المبكرة من البدء في سرطان الجلد. أظهرت البيانات السابقة ان الخلايا الجذعية للخلايا الميلانينيه (MCSCs) في انسجه البشرة البالغة يمكن ان تكون خلايا المنشا الميلانوما عند التعبير عن الطفرات الجينية والتعديلات الوراثية. ويمكن ان يسببه الورم الناجم عن الأورام السرطانية المعرضة للاصابه بسرطان الجلد عند انتقال MCSCs من السكون إلى الحالة النشطة. ويمكن الترويج لهذا الانتقال في MCSCs المعرضة لسرطان الجلد من خلال تحوير اما الخلايا الجذعية بصيلات الشعر ' الدولة النشاط أو من خلال العوامل البيئية الخارجية مثل الاشعه فوق البنفسجية-B (الاشعه فوق البنفسجية-B). يمكن التلاعب بهذه العوامل بشكل مصطنع في المختبر عن طريق أزاله الشعر الكيميائي ، والذي يسبب انتقال الخلايا الجذعية بصيلات الشعرة و MCSCs من الهدوء إلى الحالة النشطة ، والتعرض للاشعه فوق البنفسجية-B باستخدام ضوء السطح. توفر هذه الطرق التحكم المكاني والزماني الناجح لبدء الجلد الميلاني الجلدي في البشرة الظهرية المرجينه. ولذلك ، فان هذه النظم في نموذج الجسم الفيفو تكون ذات قيمه لتحديد الخطوات المبكرة للبدء الجلدية الميلانوما ويمكن استخدامها لاختبار الطرق المحتملة للوقاية من الأورام.

Introduction

الميلانوما ، الشكل الخبيث للأورام الصباغية ، هو السرطان الأكثر عدوانيه في الجلد مع الميلانوما الجلدية المسؤولة عن معظم وفيات سرطان الجلد¹. في الولايات المتحدة ، يتم تشخيص سرطان الجلد عاده ؛ ومن المتوقع ان يكون نوع السرطان الأكثر شيوعا من 5 إلى 6 من بين حالات السرطان الجديدة المقدرة في 2018². وعلاوة علي ذلك ، ففي حين أظهرت حالات السرطان العامة اتجاه الانخفاض التدريجي في العقود الاخيره ، فان معدلات الاصابهبالورم الميلانيني الجلدي خلال العقود القليلة الماضية تدل علي زيادة مستمرة وسريعة في كلا الجنسين.

لمكافحه الميلانوما الجلدية بشكل أكثر كفاءه ، من المهم ان نفهم بوضوح الاحداث المبكرة لنمو سرطان الجلد من خلايا المنشا الخاصة بهم للتعرف بشكل أفضل علي الطرق الوقائية الفعالة سريريا. ومن المعروف الآن ان الخلايا الجذعية الكبار يمكن ان تسهم بشكل كبير في تكوين الورم والأصول الخلوية للسرطان في العديد من أنواع مختلفه من الأعضاء بما في ذلك انسجه الجلد^3,4,5. المثل ، يمكن للخلايا الجذعية البالغة الخلايا الصباغية (MCSCs) في الجلد الظهري المريد ان تعمل كخلايا من أصل الميلانوما عند التنشيط الشاذ للراس/Raf و akt مسارات⁶. ومع ذلك ، فان هذه الطفرات اونكوغينيك وحدها ليست قادره علي تحفيز تكوين الورم بكفاءة من MCSCs هادئه. أورام الخلايا الصباغية تتطور في نهاية المطاف عندما تصبح MCSCs نشطه اثناء ركوب الشعر الطبيعي. ومع ذلك ، في هذا البروتوكول ، فاننا سوف تصف أساليب للحث بشكل مصطنع تنشيط الخلوية من mcscs المعرضة للورم ، التالي تسهيل التحكم الدقيق في بدء الورم الميلاني^6،7.

من خلال الطرق الموصوفة هنا ، والسيطرة المكانية والزمانيه من سرطان الجلد الشروع الجلدية من MCSCs المعرضة للورم التعبير عن الV600E braf بالاضافه إلى فقدان التعابير pten يمكن ان يؤديها بنجاح ، ونحن سبق ان أبلغت عن⁶. هذا الأسلوب يدمج النتائج السابقة التي تثبت الخلايا الجذعية الشعرية التنشيط من خلال أزاله الشعر ، فضلا عن كيفيه التعرض للجلد murine إلى الاشعه فوق البنفسجية-B يمكن ان تسهل تفعيل MCSCs المقيمين في بصيلات الشعر ونقل هذه الخلوية السكان الفرعيين إلى البشرة البينية^6،8،9،10. ويمكن لهذه النظم في نموذج الجسم الفيزيائي توفير معلومات قيمه فيما يتعلق بكيفية تغيير الفسيولوجية والبيئية يمكن ان تغير الوضع الخلوي لل MCSCs المعرضة للميلانوما ، والتي بدورها يمكن ان تحفز البدء الكبير من سرطان الجلد في البشرة.

Protocol

يتم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية وفقا للجنة الرعاية الحيوانية المؤسسية جامعه كورنيل والاستخدام (IACUC).

1-الاعداد

1. جمع مقاطع الذيل من 12 يوما بعد الولادة الفئران وهضم في 400 μL من 0.05 N NaOH في 95 درجه مئوية ل 1 ح. دوامه وأضافه 32 μL من 1 M تريس-HCl ، pH 7. الفئران النمط الجيني وفقا لبروتوكولات PCR المقدمة من خلال مختبر جاكسون وتحديد الفئران مع النمط الجيني للفائدة⁶.
   - صور-CreER- hemizygous(+/creer)
   - LSL-Braf^V600E – غير متجانس (+/Lsl-v600e)
   - Pten- flox العائمة (فلويكس/فلويكس)
   - LSL-tdTomato- hemizygous(+/lsl-tdorord)
   ملاحظه: وترد التسلسلات التمهيدية في جدول المواد.
2. استخدم مقص الشعر (أداه تشذيب كهربائيه) لحلاقه الجلد الظهري قبل 2 إلى 3 أيام من كل التجارب الموصوفة أدناه ، وعندما تكون الفئران حوالي 7 أسابيع من العمر. الحرص علي عدم الاضرار الجلد الماوس رقيقه باستخدام الانتهازي الكهربائية كما اي أصابه قد تثير استجابه التئام الجروح التي سوف تنشط الخلايا الجذعية بصيلات الشعر ، بما في ذلك MCSCs.
3. تحديد ما إذا كانت دوره الشعر في تساقط وما إذا كان الجلد مصابا خلال فتره الانتظار. إذا كان الجلد يظهر اي علامة علي الاصابه ، لا ينبغي استخدام الماوس لهذه الإجراءات.
   ملاحظه: علي الرغم من ان دوره الشعر قد تختلف قليلا بين الخلفيات الوراثية ، في هذا العصر دوره الشعر في الجلد الظهري عاده في الدولة تساقط¹¹. وسوف تستهدف الجينات تير-creer mcscs في الجلد تساقط ، سيتم التعبير عن التعديلات الجينية اللاحقة بشكل دائم في جميع السلالات من mcscs ، بما في ذلك الخلايا الصباغية المتمايزة والأورام الصباغية.

2. العلاج تاموكسيفين ل Cre-Lox الوراثية أعاده الإدماج

1. اعداد تاموكسيفين للحقن داخل الصفاق (IP) أو الاداره الموضعية لأعاده الإدماج الوراثية الجهازية أو الموضعية
   ملاحظه: من أجل تاموكسيفين للحث علي أعاده الدمج, يجب أولا ان استقلاب الكبد إلى 4-هيدروكسي تاموكسيفين (4-OHT), التي يمكن ربط وتنشيط Creer. لن يتم استقلاب التطبيق الموضعي من تاموكسيفين بهذه الطريقة و 4-OHT يجب ان تستخدم مباشره. مطلوب طريقه واحده فقط من التسليم تاموكسيفين لأعاده تركيبه كافيه.
   1. تاموكسيفين: اعداد تاموكسيفين في تركيز 10 ملغ مل^{-1 المذاب} في زيت الذرة. للمساعدة في حل المخدرات في محلول ، أضافه ما يصل إلى 10 ٪ من الحجم الإجمالي لل 100 ٪ الايثانول الجزيئي الصف إلى المخدرات في شكل مسحوق ، دوامه لمده 3 دقائق ثم أضافه حجم المتبقية من زيت الذرة. الاستمرار في دوامه حتى المواد البلورية لم يعد واضحا في الحل. يمكن تعقيم محلول تاموكسيفين عن طريق تمرير من خلال فلتر 0.2 μm. انتقل إلى الخطوة 2.2.1 للعلاج.
   2. 4-OHT: اعداد حل الأسهم من هيدروكسي تاموكسيفين تصل إلى 3 ملغ مل^-1 في 100 ٪ الايثانول. ثم ، يمكن تطبيق حل العمل بقدر الحاجة لتغطيه منطقه الجلد من الفائدة (عموما تطبيق واحد).
      ملاحظه: حل الأسهم من هيدروكسي تاموكسيفين يمكن حله في الايثانول 100 ٪ للتركيز النهائي من 5 ملم. ثم ، لاعداد حل العمل ، يمكن ان تضعف 5 μL من 4OH-تاموكسيفين حل الأسهم إلى 15 μL من الايثانول 100 ٪. ل 4 مم² المنطقة ، 1 إلى 3 μl من حل العمل يمكن تطبيقها موضعيا.
2. علاج الفئران مع تاموكسيفين اما بالمنهجية أو موضعيا
   1. للمعالجة الجهازية ، وأداره 2 ملغ من تاموكسيفين عن طريق حقن الملكية الفكرية مره واحده يوميا لمده 3 أيام باستخدام ابره 26 G.
      ملاحظه: باستخدام هذا النموذج ، ما يقرب من 93 ٪ ± 4 ٪ من MCSCs هادئه هي المسمية مع tdTomato⁶.
   2. لتفعيل الاقليميه ، وأداء واحد العلاج الموضعي مع 4-OHT. غطي منطقه الجلد ذات الاهتمام بحل العمل. يمكن تحديد مقدار الحل العمل حسب حجم منطقه الاهتمام كما هو موضح في الخطوة 2-1-2.
3. في 48 h بعد الجرعة الاخيره من تاموكسيفين, المضي قدما إلى الخطوة 3 لأزاله الاشعه الكيميائية المستحثة بدء الورم أو إلى الخطوة 4 للاشعه فوق البنفسجية-B بدء الورم المستحث

3. أزاله المزيل الكيميائي

1. تجهيز غرفه العلاج الماوس التي تحتوي علي نظام ايزوفلواني مع المواد المطلوبة التالية: كريم أزاله الشعر ، ومسحات قطنية ، والقماش ورقه ، والماء.
2. وضع الماوس في غرفه التعريفي وتخدير مع 3.5 إلى 4.5 ٪ ايزوفلونان و 1 لتر/دقيقه الأكسجين.
3. بمجرد استقرار معدل التنفس ، تاكد من ان الماوس في المستوي الصحيح من التخدير عن طريق اجراء قرصه اصبع القدم ونقل الماوس إلى الأنبوب الرئيسي الحفاظ علي التخدير مع 1 إلى 1.5 ٪ ايزوفلونان و 1 لتر/دقيقه الأكسجين. تطبيق مرهم العين للحفاظ علي العينين من التجفيف بينما تحت التخدير.
4. استخدام مسحه من القطن لتطبيق طبقه رقيقه من كريم أزاله الشعر إلى منطقه حليقه من الجلد الماوس.
5. مره واحده وقد تم تطبيق كريم بالتساوي ، واستخدام مسحات القطن نظيفه للبدء في أزاله. الوقت الإجمالي الذي يكون الكريم علي اتصال مع الجلد يجب ان لا تتجاوز 1 دقيقه.
6. امسح الجلد برفق بقطعه قماش مبلله وتاكد من أزاله اي كريم متبقي.
   ملاحظه: كريم أزاله الشعر يمكن ان يسبب تهيج في الجلد إذا لم يتم ازالته تماما. بعض الفئران ، مثل تلك الموجودة علي خلفيه C57BL/6 ، يمكن ان تكون عرضه للاصابه بالتهاب الجلد¹². علي الرغم من ان نادره ، وبعض الكائنات الحيوانية تطوير التهاب الجلد في غضون 24 ساعة بعد أزاله الشعر تطبيق كريم أو مزيل للشعر الميكانيكية. تاكد من التحقق من الفئران في اليوم بعد العلاج للبحث عن اي علامات تهيج الجلد الاقليميه.
7. تخلص من أعمده الشعر المزالة وأي مواد تستخدم في سله المخاطر البيولوجية.
8. ضع الماوس في قفص فاره فارغ ونظيف حتى يزول التخدير.
9. أعاده الفئران إلى اقفاصهم.

4. الاشعه فوق البنفسجية-B التشعيع

1. تجهيز غرفه العلاج الماوس التي تحتوي علي نظام ايزوفلوان مع المواد المطلوبة التالية: الاشعه فوق البنفسجية-B نظام الضوء ، الاشعه فوق البنفسجية-B متر الخفيفة ، وتغطيه واقيه للماوس ، اضافيه واقيه من الاشعه فوق البنفسجية-B وقائية للباحث ، وتوقيت.
2. يجب ان تكون الفئران المشعة في جرعه الاشعه فوق البنفسجية-B من الفائدة (اي ، 0-180 مللي جول/سم²). استخدام متر ضوء الاشعه فوق البنفسجية-B لتحديد المدة المناسبة من الوقت لتشع الفئران.
   ملاحظه: mW/cm² x الوقت = الجرعة
3. تخدير الماوس مع ايزوفلواني. بينما في الغرفة التعريفي ، استخدم 3.5 إلى 4.5 ٪ ايزوفلونان و 1 لتر/دقيقه الأكسجين.
4. مره واحده يتم تثبيت الماوس ، وتاكيد اثار التخدير مع قرصه اصبع القدم ونقل الماوس إلى أنبوب التخدير الرئيسي الموجود في غرفه الاشعه فوق البنفسجية. تطبيق مرهم العين لمنع العينين من التجفيف بينما تحت التخدير. الحفاظ علي التخدير مع 1 إلى 1.5 ٪ ايزوفلواني و 1 لتر/دقيقه الأكسجين.
5. تغطيه الجلد الظهري مع الاشعه فوق البنفسجية-B المواد الواقية بحيث فقط المنطقة المطلوبة سيتم كشفها.
   ملاحظه: وينبغي في الوقت الحالي استخدام معدات الوقاية الخاصة المناسبة. طول الفترة الزمنيه اللازمة ليشع الماوس يعتمد علي كثافة لمبة الضوء المستخدمة ، ولكن قد تحتاج إلى مراقبه التخدير إذا كان الوقت المطلوب يتجاوز 30 ثانيه.
6. تغطيه غرفه الاشعه فوق البنفسجية باستخدام غطاء مقاوم للاشعه فوق البنفسجية أو اي مواد أخرى مناسبه.
7. قم بتشغيل مصباح الاشعه فوق البنفسجية-B وأشرق الماوس للوقت الذي يحدده الباحثون للهدف المحدد.
8. قم بإيقاف تشغيل نظام الاشعه فوق البنفسجية و ايزوفلونان ، ثم ضع الماوس علي قفص فاره فارغ حتى يزول التخدير.
9. أعاده الفئران إلى اقفاصهم.

5. معالجه الانسجه

1. عزل الجلد
   1. الحصول علي ما يلي قبل البدء: الصكوك الحبال ، ورقه فلتر والمناشف الورقية.
   2. موت ببطء الفئران وفقا لبروتوكولات IACUC المعتمدة ، وتاكيد الموت قبل المضي قدما.
   3. باستخدام مقص الشعر ، احلق اي شعر من منطقه الجلد الظهرية. نظف المنطقة برفق بنسيج خال من الوبر لمسح المنطقة.
   4. جعل شق صغير مع مقص حاد فقط فوق قاعده الذيل.
   5. ادراج مقص حاده كبيره في الشق وفصل الانسجه الضامة تحت الجلد.
   6. عزل بعناية منطقه الجلد من الفائدة عن طريق قطع مع مقص حاد علي طول حافه النسيج.
   7. ضع نسيج الجلد علي منشفه ورقيه نظيفه واستخدم ملقطا مملا لتمدد الجلد بحيث يلتصق بالمنشفة ويتم تدريسه. تعمل هذه الخطوة علي توفير دعم إضافي للانسجه بحيث يمكن التلاعب بها ومعالجتها مع الحفاظ علي شكلها.
      ملاحظه: كن حذرا للتعامل فقط مع المناطق الخارجية من انسجه الجلد ، والملقط قد يسبب ضررا علي الجلد والتي يمكن ان ينظر اليها تشريحيا.
2. تثبيت الانسجه
   1. اضعاف قطعه من ورقه فلتر في نصف والتسمية بشكل مناسب. ضعي الجلد مع منشفه ورقيه في الورقة المطوية المجاورة مباشره للتجعد ، لضمان ان تكون العينة ناعمه وغير مطوية أو تكومه. قم بختم ورقه الفلتر بتدبيس الجانبين المفتوحين ، ثم تقليم بحيث يمكن استخدام الورق المتبقي للعينات المستقبلية.
      ملاحظه: يتم تنفيذ هذه الخطوة بحيث يحتفظ الجلد شكله اثناء التثبيت.
   2. غمر تماما عينه الانسجه في 10 ٪ محايده الفورمالين المخزنة مؤقتا لمده 3 إلى 5 ح في درجه حرارة الغرفة أو بين عشيه وضحيها في 4 درجه مئوية.
   3. بعد التثبيت ، وأزاله العينات من formalin ، ويغسل في الماء منزوع الأيونات (2x ، 5 دقيقه لكل منهما) والمضي قدما لجعل كتل الانسجه. قم بازاله اي مواد متبقية بعناية من نسيج الجلد (اي الورق المتبقي).
3. صنع كتل الانسجه المجمدة (الشكل1)
   1. تقليم حواف عينه الجلد بحيث انها ليست خشنه ومن ثم جعل 3 السهمي التخفيضات. وينبغي ان يكون عرض هذه الشرائط لا يكون أكثر من ارتفاع البرد (5 ملم). بعد ذلك ، اجراء تخفيضات عرضيه ان يكون قطعه من الجلد التي ليست أطول من عرض البرد (20 ملم) ويمكن ان تكون جزءا لا يتجزا. كرر مع النصف المتبقي من الجلد الظهري ، أو حفظ الانسجه لاستخدامات أخرى (بالتناوب ، حفظ نصف قبل التثبيت).
      ملاحظه: من المهم الحفاظ علي قطع الجلد في الاتجاه الصحيح.
   2. توجيه البرد الكبير (25 × 20 × 5 مم³) في اتجاه عمودي ووضع 4 إلى 5 قطع من الجلد علي راس OCT. مره واحده كل القطع في مكانها ، استخدم 2 أزواج من ملقط غرامه لتحقيق الحافة الطويلة من الجلد إلى الجزء السفلي من البرد. يجب ان تكون البشرة الآن واقفا في عمودي OCT إلى قاعده العفن. الحرص علي تقليل تشكيل جيوب الهواء داخل OCT خلال هذه الخطوة (الشكل 1).
   3. ملء العفن مع OCT إلى الشفة الثانية ، ووضع علي سطح مستو من الجليد الجاف. استخدام ملقط لضبط اي قطعه الجلد التي قد تحولت اثناء نقل كما يبدا كتله لتجميد. مره واحده يتم تدعيم الطبقة السفلي ، والتلاعب في الانسجه سيكون من المستحيل.
   4. قطع 8-10 ميكرومتر الشرائح للتحليل.
4. جعل Formalin ثابته البارافين المضمنة (FFPE) كتل الانسجه
   1. ضع 2 قطعه من الجلد الثابت في الكاسيت المسمي والهيدرات في زيادة تركيزات الايثانول (75 ٪ الايثانول لمده 30 دقيقه ، 85 ٪ لمده 30 دقيقه ، 90 ٪ لمده 30 دقيقه ، 95 ٪ لمده 30 دقيقه ، 100 ٪ ل 2x 30 دقيقه ، أكسلين أو أكسلين بديل ل 2x 30 دقيقه). احتضان مع البارافين في 58-60 درجه مئوية ، أولا لمده 30 دقيقه ، ومن ثم بين عشيه وضحيها.
   2. تضمين النسيج في 24 × 24 ملم² الفولاذ المقاوم للصدا العفن الانسجه مع البارافين السائل ويصلب في-5 درجه مئوية. وينبغي ان يكون التوجه الانسجه مماثله لتلك الكتل الانسجه المجمدة بحيث يمكن تصور المقاطع الطولية عبر بصيلات الشعر متعددة (الشكل 1).
   3. مره واحده وقد عزز البارافين ، وأزاله العفن وقطع في أقسام 5-10 μm للتحليل.

النتائج

الجلدية التي يسببها أزاله الجلد بواسطة الكيميائية

ويرد في الشكل 2الاجراء الخاص بازاله المزيلات الكيميائية. عندما الفئران هي 7 أسابيع بعد الولادة ، والجلد الظهري في telogen. خلال telogen, الخلايا الجذعية بصيلات الشعر و MC...

Discussion

التغييرات الوراثية المميزة التي كثيرا ما وجدت في أورام سرطان الجلد الجلدي وصفت جيدا¹³. طفرة السائق الأكثر هيمنة هو Braf^V600E، وتم إنشاء نموذج الماوس المهندسة وراثيا لسرطان الجلد braf^V600Eبوساطة مجموعه Bosenberg¹⁴ وأودعت في مختبر جاكسون. باستخدام هذا النم...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tamoxifen	Sigma	T5648-1G	For systemic injection
Tamoxifen	Cayman Chemical	13258	For systemic injection
Corn oil	Sigma	45-C8267-2.5L-EA
4OH-tamoxifen	Sigma	H7904-25MG	For topical treatment
26g 1/2" needles	various		Veterinary grade
1 mL syringe	various		Veterinary grade
Pet hair trimmer	Wahl	09990-502
Hair removal cream	Nair	n/a	Available at most drug stores
Cotton swabs	various
Ultraviolet light bulb	UVP	95-0042-08	model XX-15M midrange UV lamp
200 proof ethanol	various		pure ethanol
Histoplast PE	Fisher Scientific	22900700	paraffin pellets
Neutral Buffered Formalin, 10%	Sigma	HT501128-4L
Clear-Rite 3	Thermo Scientific	6901	xylene substitute
O.C.T. Compound	Thermo	23730571
Tissue Cassette	Sakura	89199-430	for FFPE processing
Cryomolds	Sakura	4557	25 x 20 mm
FFPE metal mold	Leica	3803082	24 x 24 mm
Isoflurane	various		Veterinary grade
Anesthesia inhalation system	various		Veterinary grade
Fine scissor	FST	14085-09	Straight, sharp/sharp
Fine scissor	FST	14558-09	Straight, sharp/sharp
Metzenbaum	FST	14018-13	Straight, blunt/blunt
Forcep	FST	11252-00	Dumont #5
Forcep	FST	11018-12	Micro-Adson
Tyr-CreER; LSL-BrafV600E; Pten-f/f	Jackson Labs	13590
LSL-tdTomato	Jackson Labs	007914	ai14
Cre-1		n/a	GCATTACCGGTCGATGCAACGAGTGATGAG
Cre-2		n/a	GAGTGAACGAACCTGGTCGAAATCAGTGCG
Braf-V600E-1		n/a	TGAGTATTTTTGTGGCAACTGC
Braf-V600E-2		n/a	CTCTGCTGGGAAAGCGGC
Kras-G12D-1		n/a	AGCTAGCCACCATGGCTTGAGTAAGTCTGCA
Kras-G12D-2		n/a	CCTTTACAAGCGCACGCAGACTGTAGA
Pten-1		n/a	ACTCAAGGCAGGGATGAGC
Pten-2		n/a	AATCTAGGGCCTCTTGTGCC
Pten-3		n/a	GCTTGATATCGAATTCCTGCAGC
tdTomato-1		n/a	AAGGGAGCTGCAGTGGAGTA
tdTomato-2		n/a	CCGAAAATCTGTGGGAAGTC
tdTomato-3		n/a	GGCATTAAAGCAGCGTATCC
tdTomato-4		n/a	CTGTTCCTGTACGGCATGG