Control espacial y temporal de la iniciación del melanoma murino a partir de células madre de melanocitos mutantes

Resumen

El siguiente procedimiento describe un método para el control espacial y temporal del inicio del tumor melanocítico en la piel dorsal murina, utilizando un modelo de ratón modificado genéticamente. Este protocolo describe el inicio de melanoma cutáneo macroscópico y microscópico.

Resumen

El melanoma cutáneo es bien conocido como el cáncer de piel más agresivo. Aunque los factores de riesgo y las principales alteraciones genéticas continúan documentándose con una profundidad cada vez mayor, la tasa de incidencia del melanoma cutáneo ha mostrado un aumento rápido y continuo durante las últimas décadas. Con el fin de encontrar métodos preventivos efectivos, es importante entender los primeros pasos de iniciación del melanoma en la piel. Los datos anteriores han demostrado que las células madre foliculares de melanocito (MCSC) en los tejidos de la piel adulta pueden actuar como células del melanoma de origen al expresar mutaciones oncogénicas y alteraciones genéticas. La tumorigénesis derivada de los MCSC propensos al melanoma puede inducirse cuando la MCSCs se transición de un estado inactivo al activo. Esta transición en MCSCs propenso al melanoma puede ser promovida por la modulación del estado de actividad de las células madre del folículo piloso o a través de factores ambientales extrínsecos como el ultravioleta-B (UV-B). Estos factores pueden ser manipulados artificialmente en el laboratorio por depilación química, lo que provoca la transición de las células madre del folículo piloso y MCSC de un estado inactivo a activo, y por la exposición UV-B usando una luz de sobremesa. Estos métodos proporcionan un control espacial y temporal exitoso del inicio del melanoma cutáneo en la piel dorsal murina. Por lo tanto, estos sistemas modelo in vivo serán valiosos para definir los primeros pasos del inicio del melanoma cutáneo y podrían utilizarse para probar métodos potenciales para la prevención de tumores.

Introducción

El melanoma, la forma maligna de los tumores melanocíticos, es el cáncer más agresivo en la piel con melanoma cutáneo responsable de la mayoría de las muertes por cáncer de piel¹. En los Estados Unidos, el melanoma es comúnmente diagnosticado; se proyecta que es el tipo de cáncer más común de 5 a 6 entre los nuevos casos de cáncer estimados en 2018². Además, si bien las incidencias generales del cáncer han mostrado la tendencia de reducción gradual en las últimas décadas, las tasas de incidencia de melanoma cutáneo durante las últimas décadas demuestran un aumento continuo y rápido en ambos sexos².

Para combatir el melanoma cutáneo de manera más eficiente, es importante comprender claramente los primeros acontecimientos del desarrollo del melanoma desde sus células de origen para identificar mejor los métodos preventivos clínicamente efectivos. Ahora se sabe que las células madre adultas pueden contribuir significativamente a la formación de tumores como los orígenes celulares de los cánceres en muchos tipos diferentes de órganos, incluyendo los tejidos de la piel^3,4,5. Del mismo modo, las células madre adultas de melanocito (MCSC) en la piel dorsal murina pueden funcionar como células del melanoma de origen tras la activación aberrante de la Ras/Raf y las vías de Akt ⁶. Sin embargo, estas mutaciones oncogénicas por sí solas no son capaces de inducir eficientemente la formación de tumores de los MCSC en reposo. los tumor melanocíticos eventualmente se desarrollan cuando los MCSC se vuelven activos durante el ciclo natural del cabello. Sin embargo, en este protocolo, describiremos métodos para inducir artificialmente la activación celular de los mcscs propensos a tumores, facilitando así el control preciso de la iniciación del melanoma^6,7.

A través de los métodos descritos aquí, el control espacial y temporal del inicio del melanoma cutáneo de MCSCs propensos a tumores que expresan BRAF oncogénico^V600E junto con la pérdida de la expresión PTEN se puede realizar con éxito, ya que han reportado previamente⁶. Este método incorpora hallazgos previos que demuestran la activación de las células del folículo piloso a través de la depilación, así como la exposición de la piel murina a UV-B puede facilitar la activación de los residentes de MCSCs en el folículo piloso y la translocación de este celular subpoblación a la epidermis interfolicular^6,8,9,10. Estos sistemas modelo in vivo pueden proporcionar información valiosa sobre cómo los cambios fisiológicos y ambientales pueden alterar el estado celular de los MCSC propensos al melanoma, que a su vez pueden inducir un inicio significativo del melanoma en la piel.

Protocolo

Todos los procedimientos en animales se realizan de acuerdo con el Comité institucional de cuidado y uso de animales de la Universidad Cornell (IACUC).

1. preparación

1. Recoja los clips de la cola de los ratones postnatales de 12 días y digárelos en 400 μL de 0,05 N NaOH a 95 ° c durante 1 h. vórtice y añada 32 μL de Tris-HCl de 1 M, pH 7. Ratones de genotipo según protocolos de PCR proporcionados a través del laboratorio de Jackson e identifican ratones con genotipo de interés⁶.
   - Tyr-pública – hemicigotos (+/CreER)
   - LSL-BRAF^V600E – heterocigotos (+/LSL-V600E)
   - PTEN – Flox homocigotos (Flox/Flox)
   - Lei-tdtomato – hemicigotos (+/LSL-tdtomato)
   Nota: Las secuencias de imprimación se proporcionan en la tabla de materiales.
2. Utilice un cortapelos (podadora eléctrica) para afeitar la piel dorsal de 2 a 3 días antes de todos los experimentos descritos a continuación, y cuando los ratones tengan aproximadamente 7 semanas de edad. Tenga cuidado de no dañar la piel delgada del ratón usando la podadora eléctrica ya que cualquier lesión puede provocar una respuesta de cicatrización de heridas que activará las células madre del folículo piloso, incluyendo MCSCs.
3. Determine si el ciclo del cabello está en telógeno y si la piel está herida durante el período de espera. Si la piel muestra cualquier signo de lesión, el ratón no debe ser utilizado para estos procedimientos.
   Nota: Aunque el ciclo del cabello puede diferir ligeramente entre los fondos genéticos, a esta edad el ciclo del cabello en la piel dorsal es generalmente en el estado telógeno¹¹. El transgénico de Tyr-pública se dirige a los MCSC en la piel telógena, y las alteraciones genéticas subsiguientes se expresarán permanentemente en todos los linajes del FCM, incluyendo los melanocitos diferenciados y los tumores melanocíticos.

2. tratamiento del tamoxifeno para la recombinación genética Cre-Lox

1. Preparación del tamoxifeno para la inyección intraperitoneal (IP) o administración tópica para la recombinación genética sistémica o localizada
   Nota: Para que el tamoxifeno provoque la recombinación, primero debe ser metabolizado por el hígado a 4-hidroxitamoxifeno (4-OHT), que puede unirse y activar el pública. La aplicación tópica de tamoxifeno no se metaboliza de esta manera y 4-OHT debe utilizarse directamente. Solo se requiere un método de entrega de tamoxifeno para una recombinación suficiente.
   1. Tamoxifeno: preparar el tamoxifeno a una concentración de 10 mg mL^-1 disuelto en aceite de maíz. Para ayudar en la disolución de la droga en solución, añadir hasta 10% volumen total de etanol 100% grado molecular a la droga en forma de polvo, vórtice durante 3 min y luego añadir el volumen restante de aceite de maíz. Continúe hasta el vórtice hasta que el material cristalino ya no sea aparente en la solución. La solución de tamoxifeno se puede esterilizar pasando por un filtro de 0,2 μm. Proceda al paso 2.2.1 para el tratamiento.
   2. 4-OHT: Prepare una solución en stock de hidroxitamoxifeno hasta 3 mg mL^-1 en etanol al 100%. Entonces, una solución de trabajo se puede aplicar tanto como sea necesario para cubrir el área de la piel de interés (generalmente una sola aplicación).
      Nota: Se puede disolver una solución en stock de hidroxitamoxifeno en etanol al 100% para una concentración final de 5 mM. A continuación, para preparar una solución de trabajo, se pueden diluir 5 μL de solución de stock de 4OH-tamoxifeno en 15 μL de etanol al 100%. Para 4 mm² zona, se pueden aplicar por vía tópica de 1 a 3 μl de solución de trabajo.
2. Tratamiento de ratones con tamoxifeno ya sea sistémicamente o tópicamente
   1. Para el tratamiento sistémico, administrar 2 mg de tamoxifeno a través de inyección de IP una vez al día durante 3 días usando una aguja de 26 G.
      Nota: Con este modelo, aproximadamente el 93% ± 4% de los MCSCs en reposo están etiquetados con tdTomato⁶.
   2. Para la activación regional, realice un tratamiento tópico con 4-OHT. Cubra el área de la piel de interés con la solución de trabajo. La cantidad de solución de trabajo se puede determinar por el tamaño de la región de interés como se describe en el paso 2.1.2.
3. A las 48 h después de la última dosis de tamoxifeno, proceda al paso 3 para la depilación química inducida por iniciación tumoral o al paso 4 para la iniciación tumoral inducida por UV-B

3. depilación química

1. Equipar una sala de tratamiento de ratón que contiene un sistema de isoflurano con los siguientes materiales requeridos: crema de depilación, algodón hisopos, paño de papel y agua.
2. Colocar el ratón en la cámara de inducción y anestesiar con 3,5 a 4,5% isoflurano y 1 L/min de oxígeno.
3. Una vez que la frecuencia respiratoria se ha estabilizado, confirme que el ratón está en el plano adecuado de la anestesia mediante la realización de un pellizco del dedo del pie y transferir el ratón al tubo principal manteniendo la anestesia con 1 a 1,5% isoflurano y 1 L/min de oxígeno. Aplique ungüento ocular para evitar que los ojos se sequen mientras está bajo anestesia.
4. Utilice un bastoncillo de algodón para aplicar una capa delgada de crema para depilación a la región afeitada de la piel del ratón.
5. Una vez que la crema se ha aplicado uniformemente, utilice hisopos de algodón limpio para comenzar la extracción. El tiempo total que la crema está en contacto con la piel no debe exceder 1 min.
6. Limpie suavemente la piel con un paño de papel húmedo y asegúrese de que se ha quitado cualquier crema residual.
   Nota: La crema para depilación puede causar irritación en la piel si no se elimina por completo. Algunos ratones, como los que están en un fondo C57BL/6, pueden ser propensos a desarrollar dermatitis¹². Aunque es raro, algunos animales desarrollarán dermatitis dentro de las 24 h después de la aplicación de crema de depilación o depilación mecánica. Asegúrese de revisar los ratones el día después del tratamiento para buscar cualquier signo de irritación regional de la piel.
7. Deseche los pozos de pelo removidos y cualquier material utilizado en una papelera de riesgo biológico.
8. Coloque el ratón en una jaula de ratón vacía y limpia hasta que la anestesia se haya desgastado.
9. Devuelva los ratones a sus jaulas.

4. irradiación UV-B

1. Equipar una sala de tratamiento de ratón que contiene un sistema isoflurano con los siguientes materiales requeridos: sistema de luz UV-B, medidor de luz UV-B, cubierta protectora para el ratón, EPI adicional de protección UV-B para el investigador, y un temporizador.
2. Los ratones deben irradiarse a la dosis de interés UV-B (es decir, 0-180 mJ/cm²). Utilice el medidor de luz UV-B para determinar el período de tiempo adecuado para irradiar los ratones.
   Nota: mW/cm² x Time = dosis
3. Anestesiar el ratón con isoflurano. Mientras esté en la cámara de inducción, utilice 3,5 a 4,5% de isoflurano y 1 L/min de oxígeno.
4. Una vez que el ratón se estabiliza, confirme los efectos de la anestesia con un pellizco del dedo del pie y transfiera el ratón al tubo de anestesia principal ubicado en la cámara UV. Aplique ungüento ocular para evitar que los ojos se sequen mientras está bajo anestesia. Mantener la anestesia con 1 a 1,5% de isoflurano y 1 L/min de oxígeno.
5. Cubra la piel dorsal con material protector UV-B para que sólo se exponga la región deseada.
   Nota: En este momento, se debe utilizar un EPP apropiado. El tiempo necesario para irradiar el ratón depende de la intensidad de la bombilla utilizada, pero la anestesia puede necesitar ser monitoreada si el tiempo requerido excede los 30 s.
6. Cubra la cámara UV utilizando una tapa resistente a los rayos UV o cualquier otro material adecuado.
7. Encienda la lámpara UV-B e irradie el ratón por el tiempo determinado por los investigadores para el objetivo específico.
8. Apague el sistema UV y el isoflurano, luego coloque el ratón en una jaula vacía del ratón hasta que la anestesia se haya desgastado.
9. Devuelva los ratones a sus jaulas.

5. procesamiento de tejidos

1. El aislamiento cutáneo
   1. Obtenga lo siguiente antes de comenzar: instrumentos necropsia, papel de filtro y toallas de papel.
   2. Eutanzar los ratones de acuerdo con los protocolos aprobados por la IACUC, y confirmar la muerte antes de proceder.
   3. Con un cortaúñas, afeitarse cualquier pelo de la zona dorsal de la piel. Cepille ligeramente el área con un tejido libre de pelusas para despejar el área.
   4. Haga una pequeña incisión con tijeras afiladas justo por encima de la base de la cola.
   5. Inserte grandes tijeras contundentes en la incisión y separe los tejidos conectivos subdérmicos.
   6. Aísle cuidadosamente la región de la piel de interés cortando con tijeras afiladas a lo largo del borde del tejido.
   7. Coloque el tejido de la piel en una toalla de papel limpia y use fórceps apagados para estirar la piel de manera que se adhiera a la toalla y se enseñe. Este paso sirve para proporcionar soporte adicional para el tejido para que pueda ser manipulado y procesado manteniendo su forma.
      Nota: Tenga cuidado de manejar sólo las regiones externas del tejido de la piel, ya que el fórceps puede causar daño a la piel que se puede ver histológicamente.
2. Fijación de tejido
   1. Dobla un trozo de papel de filtro por la mitad y rótulo apropiadamente. Coloque la piel junto con el respaldo de la toalla de papel en el papel doblado inmediatamente adyacente al pliegue, asegurando que la muestra sea lisa y no plegada o arrugado. Selle el papel de filtro grapando los lados abiertos, y luego recorte para que el papel restante se pueda utilizar para futuras muestras.
      Nota: Este paso se realiza para que la piel conserve su forma durante la fijación.
   2. Sumergir completamente la muestra de tejido en un 10% de formalina amortiguada neutral durante 3 a 5 h a temperatura ambiente o durante la noche a 4 ° c.
   3. Después de la fijación, retire las muestras de formalina, lave en agua desionizada (2x, 5 min cada una) y proceda a hacer bloques de tejido. Retire con cuidado cualquier material residual del tejido de la piel (es decir, papel residual).
3. Fabricación de bloques de tejido congelado (figura 1)
   1. Recorte los bordes de la muestra de piel para que no sean dentados y luego haga 3 cortes sagital. La anchura de estas tiras no debe ser superior a la altura del crimomoldeo (5 mm). A continuación, hacer cortes transversales para tener trozos de piel que no son más largas que la anchura del crimomoldeo (20 mm) y se pueden incrustar. Repetir con la mitad restante de la piel dorsal, o guardar el tejido para otros usos (alternativamente, ahorrar la mitad antes de la fijación).
      Nota: Es importante mantener las piezas de la piel en la orientación adecuada.
   2. Orientar el crimomoldeo (25 x 20 x 5 mm³) en una orientación vertical y colocar de 4 a 5 pedazos de piel en la parte superior de la Oct. Una vez que todas las piezas están en su lugar, utilice 2 pares de fórceps finos para llevar el borde largo de la piel a la parte inferior del crimomoldeo. Ahora la piel debe estar de pie en el OCT perpendicular a la base del molde. Tenga cuidado de minimizar la formación de bolsas de aire dentro de la OCT durante este paso (figura 1).
   3. Llene el molde con OCT hasta el segundo labio, y colóquelo sobre la superficie plana de hielo seco. Utilice fórceps para ajustar cualquier pieza de piel que pueda haber desplazado durante la transferencia a medida que el bloque comienza a congelarse. Una vez que la capa inferior se solidifica, la manipulación de los tejidos será imposible.
   4. Cortar diapositivas de 8-10 μm para su análisis.
4. Hacer que los bloques de tejido de formol Fixed parafin Embedded (FFPE)
   1. Coloque 2 piezas de piel fija en un cassette etiquetado y deshidratar en concentraciones crecientes de etanol (75% de etanol durante 30 min, 85% durante 30 min, 90% durante 30 min, 95% durante 30 min, 100% para 2x 30 min, xileno o xileno sustituto durante 2x 30 min). Incubar con parafina a 58-60 °, primero durante 30 min, y luego durante la noche.
   2. Incrustar el tejido en un molde de tejido de acero inoxidable de 24 x 24 mm² con parafina líquida y solidificar a-5 ° c. La orientación del tejido debe ser similar a la de los bloques de tejido congelado, de modo que se puedan visualizar secciones longitudinales a través de múltiples folículos pilosos (figura 1).
   3. Una vez que la parafina se haya solidificado, retire el molde y corte en secciones de 5-10 μm para su análisis.

Resultados

El inicio del melanoma cutáneo inducido por depilación química

El procedimiento de depilación química se muestra en la figura 2. Cuando los ratones son de 7 semanas después del parto, su piel dorsal está en telógeno. Durante el telógeno, se sabe que las células madre del folículo piloso y los MCSC están en estado de reposo. La piel no debe mostrar un crecimiento signific...

Discusión

Las alteraciones genéticas distintivas que se encuentran frecuentemente en tumores de melanoma cutáneo han sido bien descritas¹³. La mutación del conductor más dominante es BRAF^V600E, y un modelo de ratón genéticamente diseñado para el melanoma de BRAF^V600Emediado fue generado por el grupo Bosenberg¹⁴ y depositado en el laboratorio Jackson. Con este modelo de ratón, nuestro estudio reciente demostró el requisito de la activac...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tamoxifen	Sigma	T5648-1G	For systemic injection
Tamoxifen	Cayman Chemical	13258	For systemic injection
Corn oil	Sigma	45-C8267-2.5L-EA
4OH-tamoxifen	Sigma	H7904-25MG	For topical treatment
26 G 1/2" needles	various		Veterinary grade
1 mL syringe	various		Veterinary grade
Pet hair trimmer	Wahl	09990-502
Hair removal cream	Nair	n/a	Available at most drug stores
Cotton swabs	various
Ultraviolet light bulb	UVP	95-0042-08	model XX-15M midrange UV lamp
200 proof ethanol	various		pure ethanol
Histoplast PE	Fisher Scientific	22900700	paraffin pellets
Neutral Buffered Formalin, 10%	Sigma	HT501128-4L
Clear-Rite 3	Thermo Scientific	6901	xylene substitute
O.C.T. Compound	Thermo	23730571
Tissue Cassette	Sakura	89199-430	for FFPE processing
Cryomolds	Sakura	4557	25 x 20 mm
FFPE metal mold	Leica	3803082	24 mm x 24 mm
Isoflurane	various		Veterinary grade
Anesthesia inhalation system	various		Veterinary grade
Fine scissor	FST	14085-09	Straight, sharp/sharp
Fine scissor	FST	14558-09	Straight, sharp/sharp
Metzenbaum	FST	14018-13	Straight, blunt/blunt
Forcep	FST	11252-00	Dumont #5
Forcep	FST	11018-12	Micro-Adson
Tyr-CreER; LSL-BrafV600E; Pten-f/f	Jackson Labs	13590
LSL-tdTomato	Jackson Labs	007914	ai14
Cre-1		n/a	GCATTACCGGTCGATGCAACGA GTGATGAG
Cre-2		n/a	GAGTGAACGAACCTGGTCGAA ATCAGTGCG
Braf-V600E-1		n/a	TGAGTATTTTTGTGGCAACTGC
Braf-V600E-2		n/a	CTCTGCTGGGAAAGCGGC
Kras-G12D-1		n/a	AGCTAGCCACCATGGCTTGAGT AAGTCTGCA
Kras-G12D-2		n/a	CCTTTACAAGCGCACGCAGACT GTAGA
Pten-1		n/a	ACTCAAGGCAGGGATGAGC
Pten-2		n/a	AATCTAGGGCCTCTTGTGCC
Pten-3		n/a	GCTTGATATCGAATTCCTGCAGC
tdTomato-1		n/a	AAGGGAGCTGCAGTGGAGTA
tdTomato-2		n/a	CCGAAAATCTGTGGGAAGTC
tdTomato-3		n/a	GGCATTAAAGCAGCGTATCC
tdTomato-4		n/a	CTGTTCCTGTACGGCATGG