שליטה מרחבית וטמפורלית של מלנומה מורין ייזום מוטציה תאי גזע מלנוציט

Summary

הפרוצדורה הבאה מתארת שיטה לשליטה מרחבית וטמפורלית של ייזום גידול מלנוציטוטי בעור מוראני, באמצעות דגם עכבר מהונדס גנטית. פרוטוקול זה מתאר מאקרוסקופי כמו גם חניכה מיקרוסקופיים עורית מלנומה.

Abstract

מלנומה עורית ידועה כסרטן העור האגרסיבי ביותר. למרות גורמי הסיכון ושינויים גנטיים העיקריים להמשיך להיות מתועד עם עומק הגוברת, שיעור השכיחות של מלנומה עורית הראה עלייה מהירה ורציפה במהלך העשורים האחרונים. כדי למצוא שיטות מניעה יעיל, חשוב להבין את השלבים המוקדמים של חניכה מלנומה בעור. הנתונים הקודמים הוכיחו כי בתאי גזע מלנוציט הזקיקים (MCSCs) ברקמות העור המבוגר יכול לשמש כתאי מלנומה של המקור בעת המבטא מוטציות אונגניים ושינויים גנטיים. Tuמוריגנזה הנובעים MCSCs נוטה מלנומה יכול להיגרם כאשר MCSCs מעבר מן השקט למצב פעיל. מעבר זה מלנומה נוטה MCSCs ניתן לקדם על ידי אפנון של או שיער זקיק תאי גזע המדינה פעילות או באמצעות גורמים סביבתיים חיצוניים כגון אולטרה סגול-B (UV-B). גורמים אלה יכולים להיות מניפולציות באופן מלאכותי במעבדה על ידי depilation כימיים, מה שגורם מעבר של תאי גזע שיער זקיק ו מן השקט למצב פעיל, ועל ידי חשיפה UV-B באמצעות אור שספסל העליון. שיטות אלה מספקות שליטה מרחבית מוצלחת והטמפורלית של חניכה מלנומה עורית בעור מוריין. לכן, אלה במערכות מודל vivo יהיה בעל ערך להגדיר את השלבים המוקדמים של חניכה מלנומה עורית יכול לשמש כדי לבדוק שיטות פוטנציאליות למניעת גידול.

Introduction

מלנומה, הצורה המממנת של גידולים מלנולוציפטיים, הוא הסרטן האגרסיבי ביותר בעור עם מלנומה עורית אחראי על רוב מקרי המוות של סרטן העור¹. בארצות הברית, מלנומה מאובחנת בדרך כלל; הוא הוקרן להיות 5 עד 6^th הסרטן הנפוץ ביותר בקרב המקרים המשוער סרטן חדש ב 2018². יתר על כן, בעוד מקרי סרטן הכולל הראו את המגמה של צמצום הדרגתי בעשורים האחרונים, מלנומה עורית שיעור שיעור במהלך העשורים האחרונים להפגין עלייה רציפה ומהירה בשני המינים².

כדי להילחם מלנומה עורית ביעילות רבה יותר, חשוב להבין בבירור את האירועים המוקדמים של פיתוח מלנומה מתאי המוצא שלהם לזהות טוב יותר קלינית שיטות מניעה יעיל. ידוע כיום כי בתאי גזע בוגרים יכולים לתרום באופן משמעותי להיווצרות הגידול כמקורות הסלולר של סרטן בסוגים רבים ושונים של איברים כולל רקמות העור^3,4,5. באופן דומה, מבוגרים תאי גזע מלנוציט (MCSCs) בעור המורין הישן יכול לעבוד כתאי מלנומה של המקור על הפעלה חריגה של Ras/חיל הארץ ו akt מסלולים⁶. עם זאת, אלה מוטציות אונגניים לבד אינם מסוגלים ביעילות לגרום להיווצרות הגידול מן השקט MCSCs. גידולים מלנולוציפטיים בסופו של דבר להתפתח כאשר MCSCs להיות פעיל במהלך רכיבה על שיער טבעי. עם זאת, בפרוטוקול זה, נתאר שיטות כדי לגרום באופן מלאכותי הפעלה תאית של MCSCs מועדת הגידול, ובכך להקל על שליטה מדויקת של חניכה מלנומה^6,7.

באמצעות השיטות המתוארות כאן, שליטה מרחבית וטמפורלית של חניכה מלנומה עורית מפני גידול MCSCs ביטוי אונגניים Braf^V600E יחד עם אובדן של ביטוי pten ניתן לבצע בהצלחה, כמו שאנחנו דיווחו בעבר על⁶. שיטה זו משלבת ממצאים קודמים כי הפגנת שיער זקיק גזע הפעלה של תא דרך הסרת שיער כמו גם איך חשיפה של העור murine ל-UV-B יכול להקל על ההפעלה של MCSCs תושב זקיק השיער וטרנסלוקציה של הסלולר הזה אוכלוסיית המשנה לאפידרמיס הפוליקולרית^6,8,9,10. אלה במערכות מודל vivo יכול לספק מידע חשוב לגבי איך שינויים פיסיולוגיים וסביבתיים יכולים לשנות את הסטטוס התאי של מלנומה נוטה MCSCs, אשר בתורו יכול לגרום לחניכה משמעותית של מלנומה בעור.

Protocol

כל ההליכים בעלי החיים מבוצעים בהתאם לטיפול בבעלי חיים מוסדיים באוניברסיטת קורנל ולהשתמש בוועדה (IACUC).

1. הכנה

1. לאסוף קטעי זנב מ 12 יום עכברים לידתיים ולעכל ב 400 μL של 0.05 N NaOH ב 95 ° צ' עבור 1 h. מערבולת ולהוסיף 32 μL של 1 M טריס-HCl, pH 7. עכברים גנוטיפ על פי פרוטוקולי ה-PCR שסופקו דרך המעבדה ג'קסון ולזהות עכברים עם גנוטיפ של ריבית⁶.
   - Tyr-creer – hemizygous (+/creer)
   - Lsl-Braf^V600E – heterozygous (+/Lsl-v600e)
   - Pten – homozygous flox (flox/flox)
   - Lsl-tdTomato – hemizygous (+/ליטר)
   הערה: רצפים פריימר מסופקים ברשימת חומרים.
2. השתמש בקוצץ שיער (קוצץ חשמלי) כדי לגלח את העור הקודם 2 עד 3 ימים לפני כל הניסויים המתוארים להלן, וכאשר עכברים הם כ -7 שבועות של גיל. לדאוג לא לפגוע בעור העכבר הדק באמצעות הקוצץ החשמלי כמו כל פציעה עלולה לעורר תגובה ריפוי הפצע אשר יפעיל את השיער זקיק גזע תאים, כולל MCSCs.
3. קבע אם מחזור השיער הוא בתוך הזמן והאם העור נפצע במהלך תקופת ההמתנה. אם העור מראה סימן כלשהו לפציעה, אין להשתמש בעכבר להליכים אלה.
   הערה: למרות שמחזור השיער עשוי להיות מעט שונה בין הרקעים הגנטיים, בגיל זה מחזור השיער בעור העורבן הוא בדרך כלל במצב הטלנוגן¹¹. The Tyr-CreER הגנטי יהיה יעד MCSCs בעור טלעוגן, ואת השינויים הגנטיים הבאים יהיה להתבטא לצמיתות בכל שלדורות של mcsc, כולל גידולים מלנוציטים ומלנוציטוטיק.

2. טיפול טמוקסיפן לקומבינציה גנטית של היצור-לקס

1. הכנת טמוקסיפן עבור הזרקת הצפק (IP) או ניהול אקטואלי עבור שילוב גנטי מערכתי או מקומי מחדש
   הערה: על מנת טמוקסיפן כדי לגרום שילוב חוזר, זה חייב להיות מטבוליזם על ידי הכבד ל 4-הידרוקסימטפן (4-OHT), אשר יכול לאגד ולהפעיל את Creer. יישום מקומי של טמוקסיפן לא יהיה חילוף חומרים בדרך זו ו 4-OHT חייב לשמש ישירות. רק שיטה אחת של משלוח טמוקסיפן נדרש עבור שילוב מספיק מחדש.
   1. טממוקסיפן: מכינים טממוקסיפן בריכוז של 10 מ ג^-1 מומס בשמן תירס. כדי לסייע פירוק התרופה לתוך פתרון, להוסיף עד 10% נפח הכולל של 100% אתנול כיתה מולקולרית תרופה בצורת אבקה, מערבולת עבור 3 דקות ולאחר מכן להוסיף את הנפח הנותר של שמן תירס. המשך למערבולת עד שהחומר הגבישי אינו גלוי עוד בפתרון. פתרון טמוקסיפן ניתן לעקר על ידי עובר דרך מסנן יקרומטר 0.2. . המשך לשלב 2.2.1 לטיפול
   2. 4-OHT: להכין פתרון מניות של הידרוקסיטמוקסיפן עד 3 מ"ג mL^-1 ב 100% אתנול. לאחר מכן, ניתן ליישם פתרון עובד ככל הנדרש כדי לכסות את אזור העור של הריבית (בדרך כלל יישום יחיד).
      הערה: פתרון מניות של הידרוקסיטמוקסיפן יכול להיות מומס ב 100% אתנול עבור ריכוז סופי של 5 מ"מ. לאחר מכן, כדי להכין פתרון עובד, 5 μL של פתרון מניות 4OH-tamoxifen ניתן מדולל לתוך 15 μL של 100% אתנול. עבור 4 מ"מ² שטח, 1 עד 3 μl של פתרון העבודה ניתן להחיל למריחה על הסביבה.
2. טיפול בעכברים עם טמוקסיפן או מערכתית או למריחה על העיצוב
   1. עבור טיפול סיסטמי, מנהל 2 מ"ג טמוקסיפן דרך הזרקת IP פעם ביום עבור 3 ימים באמצעות מחט G 26.
      הערה: באמצעות מודל זה, כ 93% ± 4% של השקט MCSCs מתויגים עם tdTomato⁶.
   2. להפעלה אזורית, בצע טיפול מקומי אחד עם 4-OHT. כסו את תחום העור המעניין בפתרון העבודה. ניתן לקבוע את כמות פתרון העבודה לפי גודל אזור הריבית כפי שמתואר בשלב 2.1.2.
3. ב 48 h בעקבות המינון האחרון של טמוקסיפן, המשך לשלב 3 עבור הגידול הכימי להסרת שיער המושרה או לשלב 4 עבור UV-B המושרה ליזום גידול

3. להסרת שיער כימית

1. לצייד חדר טיפול בעכבר המכיל מערכת isof, עם החומרים הנדרשים הבאים: קרם הסרת שיער, שקיות צמר, מטלית נייר, ומים.
2. מניחים את העכבר לתוך התא אינדוקציה מורדם עם 3.5 כדי 4.5% isofלאנה ו 1 L/min חמצן.
3. לאחר שקצב הנשימה התייצב, לאשר את העכבר הוא במישור הנכון של הרדמה על ידי ביצוע צביטה הבוהן ולהעביר את העכבר לצינור הראשי שמירה על הרדמה עם 1 כדי 1.5% isofלהקה ו 1 L/min חמצן. להחיל משחה העין כדי לשמור על העיניים מפני ייבוש תוך הרדמה.
4. השתמש בספוגית כותנה כדי להחיל שכבה דקה של קרם הסרת שיער לאזור מגולח של העור העכבר.
5. ברגע שהקרם הוחל באופן שווה, השתמש בדגימות כותנה נקיות כדי להתחיל בהסרה. הזמן הכולל שהקרם במגע עם העור לא יעלה על 1 דקות.
6. לנגב בעדינות את העור במטלית נייר לחה ולהבטיח כי כל קרם שיורית הוסר.
   הערה: קרם להסרת שיער יכול לגרום לגירוי בעור אם הוא לא מוסר לחלוטין. עכברים מסוימים, כגון אלה על רקע C57BL/6, יכול להיות נוטה לפתח דרמטיטיס¹². למרות נדיר, כמה בעלי חיים יפתחו דרמטיטיס בתוך 24 שעות לאחר הסרת השיער קרם יישום או להסרת שיער מכני. הקפד לבדוק את העכברים יום לאחר הטיפול כדי לחפש סימנים של גירוי בעור האזורי.
7. הסירו את פירי השיער שהוסרו ואת כל החומרים ששימשו לתוך תא בידוד.
8. מניחים את העכבר לתוך כלוב העכבר ריק, נקי עד ההרדמה יש לבשו.
9. . החזר את העכברים לכלובים שלהם

4. UV-B הקרנה

1. צייד חדר טיפול בעכבר המכיל מערכת isof, עם החומרים הנדרשים הבאים: UV-B מערכת אור, UV-B מטר אור, כיסוי מגן על העכבר, נוסף UV-B הגנה לחוקר, ו טיימר.
2. עכברים צריכים להיות לקרינה במינון UV-B של ריבית (כלומר, 0-180 mJ/cm²). השתמש במד אור UV-B כדי לקבוע את אורך הזמן המתאים כדי להאיר את העכברים.
   הערה: mW/cm² x זמן = מינון
3. . לדבר עם העכבר בעזרת מלגלית בעוד בחדר האינדוקציה, להשתמש 3.5 כדי 4.5% isofלאנה ו 1 L/min חמצן.
4. ברגע העכבר מיוצב, לאשר תופעות הרדמה עם צביטה בבוהן ולהעביר את העכבר לצינור ההרדמה הראשי הממוקם בחדר UV. להחיל משחה העין כדי למנוע את העיניים מהתייבשות בזמן הרדמה. שמרו על הרדמה עם 1 עד 1.5%. וחמצן 1 L/דקות
5. לכסות את העור הגבי עם חומר הגנה UV-B, כך שרק האזור הרצוי יהיה חשוף.
   הערה: בשלב זה, יש לעשות שימוש ב-PPE המתאים. משך הזמן הדרוש כדי לפרק את העכבר תלוי בעוצמת הנורה המשמש, אבל הרדמה אולי צריך להיות מנוטרים אם הזמן הנדרש עולה על 30 s.
6. מכסים את תא UV באמצעות מכסה עמידות UV או כל חומרים מתאימים אחרים.
7. הפעל את מנורת UV-B והקרין את העכבר במשך הזמן שנקבע על ידי חוקרים עבור המטרה הספציפית.
8. כבה את מערכת UV ו-isofלאנה, ואז למקם את העכבר על כלוב העכבר ריק עד ההרדמה יש לבשו.
9. . החזר את העכברים לכלובים שלהם

5. עיבוד רקמה

1. בידוד עור
   1. השג את הפרטים הבאים לפני תחילת העבודה: מכשירי נקרופסי, נייר סינון ומגבות נייר.
   2. המתת חסד העכברים לפי פרוטוקולים IACUC שאושרו, ולאשר את המוות לפני שתמשיך.
   3. משתמשים בקוצץ שיער, מגלחים. את כל השערות מאזור העור מצחצח בקלילות את האזור ברקמה נטולת מוך כדי לפנות את האזור.
   4. לעשות חתך קטן עם מספריים חדים ממש מעל הבסיס של הזנב.
   5. הוסף מספריים בוטים גדולים לתוך החתך ולהפריד את רקמות החיבור התת עורי.
   6. לבודד בזהירות את אזור העור של עניין על ידי גזירה עם מספריים חדים לאורך קצה הרקמה.
   7. מניחים את רקמת העור על מגבת נייר נקייה להשתמש מלקחיים עמום כדי למתוח את העור כך שהוא דבק המגבת והוא לימד. שלב זה משמש למתן תמיכה נוספת לרקמות כך שניתן יהיה לתמרן ולעבד אותה תוך שמירה על צורתו.
      הערה: להיזהר רק לטפל באזורים החיצוניים של רקמת העור, כמו מלקחיים עלול לגרום נזק לעור אשר ניתן לראות היסטולוגית.
2. קיבוע רקמות
   1. מקפלים פיסת נייר סינון במחצית ומתייג בהתאם. מניחים את העור יחד עם גיבוי מגבת נייר לתוך הנייר המקופל הצמוד מיד לקמט, להבטיח כי המדגם הוא חלק ולא מקופל או מקומט. אטום את נייר הסינון על-ידי הידוק הצדדים הפתוחים ולאחר מכן קצץ כך שניתן יהיה להשתמש בנייר הנותר לדגימות עתידיות.
      הערה: שלב זה מבוצע כך העור שומר על צורתו במהלך הקיבעון.
   2. יש להטביע במלואו את דגימת הרקמה ב-10% מחסן ניטרלי באגירה עבור 3 עד 5 שעות בטמפרטורת החדר או לילה ב -4 ° c.
   3. בעקבות קיבעון, להסיר את הדגימות מתוך formalin, לשטוף במים מוכי (2x, 5 דקות כל אחד) ולהמשיך לעשות בלוקים רקמות. הסירו בזהירות כל חומר שרידי מרקמת העור (כלומר, נייר שיורית).
3. ביצוע בלוקים רקמות קפואות (איור 1)
   1. חתוך את הקצוות של דגימת העור כך שהם לא משוננים ולאחר מכן לבצע 3 חתכים משונן. רוחב של רצועות אלה לא צריך להיות יותר מאשר הגובה של cryomold (5 מ"מ). הבא, לעשות חתכים רוחבי יש פיסות העור אשר אינם ארוכים יותר מאשר ברוחב של cryomold (20 מ"מ) והוא יכול להיות מוטבע. חזרו עם החצי הנותר של העור הקודם, או שמרו את הרקמה לשימושים אחרים (לסירוגין, שמרו חצי לפני הקיבעון).
      הערה: חשוב לשמור על חלקי העור בכיוון הנכון.
   2. אוריינט the cryomold (25 x 20 x 5 מ"מ³) בכיוון לאורך ובמקום 4 כדי 5 פיסות עור על גבי OCT. פעם כל החלקים נמצאים במקום, להשתמש 2 זוגות של מלקחיים עדינים כדי להביא את הקצה הארוך של העור אל החלק התחתון של cryomold. העור צריך עכשיו לעמוד ב-OCT בניצב לבסיס העובש. דאג למזער את היווצרות כיסי האוויר בתוך ה-OCT במהלך שלב זה (איור 1).
   3. ממלאים את העובש עם OCT אל השפה השנייה, ומניחים על המשטח השטוח של הקרח היבש. מלקחיים להשתמש כדי להתאים את כל חלקי העור שייתכן שזזו במהלך ההעברה כמו הבלוק מתחיל להקפיא. לאחר השכבה התחתונה מתחזק, מניפולציה של רקמות יהיה בלתי אפשרי.
   4. גזור 8-10 יקרומטר שקופיות לניתוח.
4. ביצוע Formalin קבוע פרפין מוטבע (FFPE) רקמה בלוקים
   1. מקום 2 חתיכות של עור קבוע לתוך קלטת בתווית ומייבשים בריכוזים הגוברת של אתנול (75% אתנול עבור 30 דקות, 85% עבור 30 דקות, 90% עבור 30 דקות, 95% עבור 30 דקות, 100% עבור 2x 30 דקות, מחליף את הפקודה קסילן או קסילן עבור 2x 30 דקות). דגירה עם פרפין ב 58-60 °, הראשון 30 דקות, ולאחר מכן לילה.
   2. להטביע את הרקמה 24 x 24 מ"מ² כייר רקמת פלדת אל-חלד עם פרפין נוזלי ולגבש ב-5 ° c. התמצאות רקמות צריך להיות דומה לזה של גושי רקמה קפואים כך סעיפים האורך על פני זקיקי שיער מרובים יכולים להיות דמיינו (איור 1).
   3. לאחר הפרפין התחזק, להסיר את העובש לחתוך לתוך 5-10 יקרומטר סעיפים לניתוח.

תוצאות

מלנומה עורית חניכה הנגרמת על ידי שיער כימי

הליך ההסרת שיער כימי מתואר באיור 2. כאשר העכברים הם 7-שבועות לאחר הלידה, העור הטייתי שלהם הוא בטלגן. במהלך טלעוגן, תאי גזע שיער זקיק ו MCSCs ידועים להיות בשקט, מצב מנוחה. העור ?...

Discussion

ההיכר שינויים גנטיים לעתים קרובות למצוא גידולים מלנומה עורית כבר תיאר היטב¹³. המוטציה הדומיננטית ביותר הנהג הוא Braf^V600E, ומודל מהונדסים גנטית העכבר עבור braf^V600E-תיווך מלנומה נוצר על ידי קבוצת Bosenberg¹⁴ והופקד במעבדה ג'קסון. באמצעות מודל זה של העכבר, ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tamoxifen	Sigma	T5648-1G	For systemic injection
Tamoxifen	Cayman Chemical	13258	For systemic injection
Corn oil	Sigma	45-C8267-2.5L-EA
4OH-tamoxifen	Sigma	H7904-25MG	For topical treatment
26 G 1/2" needles	various		Veterinary grade
1 mL syringe	various		Veterinary grade
Pet hair trimmer	Wahl	09990-502
Hair removal cream	Nair	n/a	Available at most drug stores
Cotton swabs	various
Ultraviolet light bulb	UVP	95-0042-08	model XX-15M midrange UV lamp
200 proof ethanol	various		pure ethanol
Histoplast PE	Fisher Scientific	22900700	paraffin pellets
Neutral Buffered Formalin, 10%	Sigma	HT501128-4L
Clear-Rite 3	Thermo Scientific	6901	xylene substitute
O.C.T. Compound	Thermo	23730571
Tissue Cassette	Sakura	89199-430	for FFPE processing
Cryomolds	Sakura	4557	25 x 20 mm
FFPE metal mold	Leica	3803082	24 mm x 24 mm
Isoflurane	various		Veterinary grade
Anesthesia inhalation system	various		Veterinary grade
Fine scissor	FST	14085-09	Straight, sharp/sharp
Fine scissor	FST	14558-09	Straight, sharp/sharp
Metzenbaum	FST	14018-13	Straight, blunt/blunt
Forcep	FST	11252-00	Dumont #5
Forcep	FST	11018-12	Micro-Adson
Tyr-CreER; LSL-BrafV600E; Pten-f/f	Jackson Labs	13590
LSL-tdTomato	Jackson Labs	007914	ai14
Cre-1		n/a	GCATTACCGGTCGATGCAACGA GTGATGAG
Cre-2		n/a	GAGTGAACGAACCTGGTCGAA ATCAGTGCG
Braf-V600E-1		n/a	TGAGTATTTTTGTGGCAACTGC
Braf-V600E-2		n/a	CTCTGCTGGGAAAGCGGC
Kras-G12D-1		n/a	AGCTAGCCACCATGGCTTGAGT AAGTCTGCA
Kras-G12D-2		n/a	CCTTTACAAGCGCACGCAGACT GTAGA
Pten-1		n/a	ACTCAAGGCAGGGATGAGC
Pten-2		n/a	AATCTAGGGCCTCTTGTGCC
Pten-3		n/a	GCTTGATATCGAATTCCTGCAGC
tdTomato-1		n/a	AAGGGAGCTGCAGTGGAGTA
tdTomato-2		n/a	CCGAAAATCTGTGGGAAGTC
tdTomato-3		n/a	GGCATTAAAGCAGCGTATCC
tdTomato-4		n/a	CTGTTCCTGTACGGCATGG