Controllo spaziale e temporale dell'iniziazione del melanoma murino dalle cellule staminali di melanociti mutanti

Riepilogo

La seguente procedura descrive un metodo per il controllo spaziale e temporale dell'iniziazione tumorale melanocitica nella pelle dorsali murina, utilizzando un modello di topo geneticamente modificato. Questo protocollo descrive l'iniziazione macroscopica e microscopica del melanoma cutaneo.

Abstract

Il melanoma cutaneo è ben noto come il cancro della pelle più aggressivo. Sebbene i fattori di rischio e le principali alterazioni genetiche continuino a essere documentati con maggiore profondità, il tasso di incidenza del melanoma cutaneo ha mostrato un rapido e continuo aumento negli ultimi decenni. Al fine di trovare metodi preventivi efficaci, è importante comprendere i primi passi dell'iniziazione del melanoma nella pelle. I dati precedenti hanno dimostrato che le cellule staminali follicolari dei melanociti (MCSC) nei tessuti cutanei adulti possono fungere da cellule di melanoma di origine quando esprimono mutazioni oncogeniche e alterazioni genetiche. La tumorigenesi derivante da MCSCs inclini al melanoma può essere indotta quando MCSCs passa da uno stato quiescente a uno attivo. Questa transizione in MCSCs inclini al melanoma può essere promossa dalla modulazione dello stato di attività delle cellule staminali follicoli piliferi o da fattori ambientali estrinseci come l'ultravioletto-B (UV-B). Questi fattori possono essere manipolati artificialmente in laboratorio mediante depilazione chimica, che provoca la transizione delle cellule staminali follicoli piliferi e delle MCSC da una condizione di quiescenza a quella attiva, e dall'esposizione UV-B utilizzando una luce da banco. Questi metodi forniscono un controllo spaziale e temporale riuscito dell'iniziazione cutanea del melanoma nella pelle dorsale murina. Pertanto, questi sistemi di modelli in vivo saranno preziosi per definire i primi passi dell'inizio del melanoma cutaneo e potrebbero essere usati per testare i potenziali metodi per la prevenzione del tumore.

Introduzione

Il melanoma, la forma maligna dei tumori melanocitici, è il tumore più aggressivo della pelle con melanoma cutaneo responsabile della maggior parte dei decessi per cancro della pelle¹. Negli Stati Uniti, il melanoma è comunemente diagnosticato; si prevede di essere il 5^° al 6^° tipo di cancro più comune tra i nuovi casi di cancro stimato in 2018². Inoltre, mentre le incidenze tumorali complessive hanno evidenziato l'andamento della progressiva riduzione degli ultimi decenni, i tassi di incidenza del melanoma cutaneo negli ultimi decenni dimostrano un aumento continuo e rapido di entrambi i sessi².

Per combattere il melanoma cutaneo in modo più efficiente, è importante comprendere chiaramente i primi eventi di sviluppo del melanoma dalle loro cellule di origine per identificare meglio i metodi preventivi clinicamente efficaci. Ora è noto che le cellule staminali adulte possono contribuire significativamente alla formazione tumorale come origine cellulare dei tumori in molti tipi diversi di organi, compresi i tessuti cutanei^3,4,5. Analogamente, le cellule staminali melanocitarie adulte (MCSC) nella pelle dorsale murina possono funzionare come cellule di melanoma di origine all'attivazione aberrante dei pathway RAS/RAF e Akt ⁶. Tuttavia, queste mutazioni oncogeniche da sole non sono in grado di indurre efficacemente la formazione tumorale da MCSCs quiescenti. i tumori melanocitici si sviluppano quando MCSCs diventano attivi durante il ciclismo naturale dei capelli. Tuttavia, in questo protocollo, descriveremo i metodi per indurre artificialmente l'attivazione cellulare di MCSCS inclini al tumore, facilitando così un controllo preciso dell'inizio del melanoma^6,7.

Attraverso i metodi qui descritti, il controllo spaziale e temporale dell'iniziazione cutanea del melanoma da MCSCs inclini al tumore che esprimono BRAF^V600E oncogenico insieme alla perdita dell'espressione PTEN può essere eseguito con successo, come abbiamo hanno riferito in precedenza⁶. Questo metodo incorpora precedenti risultati che dimostrano l'attivazione delle cellule staminali follicolari dei capelli attraverso la depilazione, così come l'esposizione della pelle di murina a UV-B può facilitare l'attivazione di MCSCs residente al follicolo pilifero e la traslocazione di questo cellulare sottopopolazione all'epidermide interfollicolare^6,8,9,10. Questi sistemi di modelli in vivo possono fornire informazioni preziose su come i cambiamenti fisiologici e ambientali possono alterare lo stato cellulare dei MCSC inclini al melanoma, che a loro volta possono indurre una significativa iniziazione del melanoma nella pelle.

Protocollo

Tutte le procedure degli animali sono eseguite in conformità con il Comitato istituzionale per l'assistenza e l'uso degli animali della Cornell University (IACUC).

1. la preparazione

1. Raccogliere clip di coda da topi postnatali 12 giorni e digerire in 400 μL di 0,05 N NaOH a 95 ° c per 1 h. Vortex e aggiungere 32 μL di 1 M Tris-HCl, pH 7. I topi di genotipo secondo i protocolli PCR forniti attraverso il laboratorio Jackson e identificano i topi con genotipo di interesse⁶.
   - Tyr-creer – emizygous (+/creer)
   - LSL-BRAF^V600E – eterozigoti (+/LSL-V600E)
   - PTEN – flox omozigote (flox/flox)
   - LSL-tdpomodoro – emizygous (+/LSL-tdtomato)
   Nota: Le sequenze di primer sono fornite nella tabella dei materiali.
2. Utilizzare un tagliacapelli (trimmer elettrico) per radersi la pelle dorsale 2 a 3 giorni prima di tutti gli esperimenti descritti di seguito, e quando i topi sono circa 7 settimane di età. Fare attenzione a non danneggiare la pelle del topo sottile utilizzando il trimmer elettrico come qualsiasi lesione può suscitare una risposta di guarigione della ferita che attiverà le cellule staminali del follicolo pilifero, tra cui MCSCs.
3. Determinare se il ciclo dei capelli è in telogen e se la pelle è ferita durante il periodo di attesa. Se la pelle Mostra qualsiasi segno di lesione, il mouse non deve essere utilizzato per queste procedure.
   Nota: Anche se il ciclo dei capelli può differire leggermente tra gli sfondi genetici, a questa età il ciclo dei capelli nella pelle dorsale è di solito nello stato telogen¹¹. Il transgene Tyr-CreER Bersaglierà MCSCS in pelle telogen, e le successive alterazioni genetiche saranno espresse in modo permanente in tutte le linee del MCSC, compresi i melanociti differenziati e i tumori melanocitici.

2. trattamento con tamoxifene per la Ricomcombinazione genetica cre-lox

1. Preparazione di tamoxifene per iniezione intraperitoneale (IP) o somministrazione topica per la riconcombinazione genetica sistemica o localizzata
   Nota: Affinché il tamoxifene induca la ricompressione, deve prima essere metabolizzato dal fegato a 4-idrossitamoxifene (4-OHT), che può legarsi e attivare il creer. Applicazione topica di tamoxifene non sarà metabolizzato in questo modo e 4-OHT deve essere utilizzato direttamente. Solo un metodo di consegna tamoxifene è necessaria per una sufficiente ricomfusione.
   1. Tamoxifene: preparare il tamoxifene ad una concentrazione di 10 mg mL^-1 disciolto in olio di mais. Per aiutare nella dissoluzione del farmaco in soluzione, aggiungere fino a 10% volume totale di 100% etanolo di grado molecolare al farmaco in forma di polvere, vortice per 3 min e quindi aggiungere il volume rimanente di olio di mais. Continuare a vortice fino a quando il materiale cristallino non è più evidente in soluzione. La soluzione di tamoxifene può essere sterilizzata passando attraverso un filtro da 0,2 μm. Procedere al passaggio 2.2.1 per il trattamento.
   2. 4-OHT: preparare una soluzione di stock di idrossitamoxifene fino a 3 mg mL^-1 in 100% etanolo. Quindi, una soluzione di lavoro può essere applicata per quanto necessario per coprire l'area di interesse della pelle (in genere una singola applicazione).
      Nota: Una soluzione di stock di idrossitamoxifene può essere disciolto in 100% etanolo per una concentrazione finale di 5 mM. Quindi, per preparare una soluzione di lavoro, 5 μL di soluzione di stock 4OH-tamoxifene può essere diluito in 15 μL di 100% etanolo. Per 4 mm² area, da 1 a 3 μL di soluzione di lavoro può essere applicato per via topica.
2. Trattare i topi con tamoxifene sia a livello sistemico che topico
   1. Per il trattamento sistemico, somministrare 2 mg di tamoxifene tramite iniezione IP una volta al giorno per 3 giorni con un ago da 26 G.
      Nota: Utilizzando questo modello, circa 93% ± 4% dei MCSCs quiescenti sono etichettati con tdTomato⁶.
   2. Per l'attivazione regionale, eseguire un trattamento topico con 4-OHT. Coprire l'area di interesse della pelle con la soluzione di lavoro. La quantità di soluzione di lavoro può essere determinata dalle dimensioni della regione di interesse, come descritto al punto 2.1.2.
3. A 48 h dopo l'ultima dose di tamoxifene, procedere al passo 3 per la depilazione chimica indotta inizio tumore o al passo 4 per l'inizio del tumore indotta da UV-B

3. depilazione chimica

1. Dotare una sala di trattamento del mouse contenente un sistema isoflurano con i seguenti materiali richiesti: crema per la depilazione, tamponi di cotoni, panno di carta e acqua.
2. Posizionare il mouse nella camera di induzione e anestetizzare con 3,5 a 4,5% isoflurano e 1 L/min di ossigeno.
3. Una volta che la frequenza respiratoria si è stabilizzata, confermare che il mouse è nel piano corretto dell'anestesia eseguendo un pizzico di punta e trasferire il mouse al tubo principale mantenendo l'anestesia con 1 a 1,5% isoflurano e 1 L/min di ossigeno. Applicare l'unguento oculare per evitare che gli occhi si asciugarsi durante l'anestesia.
4. Utilizzare un batuffolo di cotone per applicare un sottile strato di crema per la depilazione nella regione rasata della pelle del topo.
5. Una volta che la crema è stata applicata uniformemente, utilizzare tamponi di cotone puliti per iniziare la rimozione. Il tempo totale che la crema è a contatto con la pelle non deve superare 1 min.
6. Strofinare delicatamente la pelle con un panno di carta umido e assicurarsi che qualsiasi crema residua sia stata rimossa.
   Nota: Crema depilazione può causare irritazione alla pelle se non è completamente rimosso. Alcuni topi, come quelli su uno sfondo topi C57BL/6, possono essere inclini a sviluppare la dermatite¹². Anche se rari, alcuni animali svilupperanno la dermatite entro 24 h dopo l'applicazione di crema per la depilazione o la rasatura meccanica. Assicuratevi di controllare i topi il giorno dopo il trattamento per cercare eventuali segni di irritazione cutanea regionale.
7. Scartare i pozzi dei capelli rimossi e tutti i materiali utilizzati in un bidone di Biohazard.
8. Posizionare il mouse in una gabbia di topo vuota e pulita fino a quando l'anestesia è usurata.
9. Restituisci i topi alle loro gabbie.

4. irraggiamento UV-B

1. Dotare una sala di trattamento del topo contenente un sistema isoflurano con i seguenti materiali richiesti: sistema di luce UV-B, misuratore di luce UV-B, rivestimento protettivo per il mouse, dpi protettivi UV-B aggiuntivi per ricercatore e un timer.
2. I topi devono essere irradiati alla dose di interesse UV-B (cioè 0-180 mJ/cm²). Utilizzare il misuratore di luce UV-B per determinare il periodo di tempo appropriato per irradiare i topi.
   Nota: mW/cm² x tempo = dose
3. Anestetizzare il topo con l'isoflurano. Mentre nella camera di induzione, utilizzare 3,5 a 4,5% isoflurano e 1 L/min di ossigeno.
4. Una volta che il mouse è stabilizzato, confermare gli effetti di anestesia con un pizzico di punta e trasferire il mouse al tubo di anestesia principale situato nella camera UV. Applicare l'unguento oculare per evitare che gli occhi si asciugino durante l'anestesia. Mantenere l'anestesia con 1 a 1,5% isoflurano e 1 L/min di ossigeno.
5. Coprire la pelle dorsale con materiale protettivo UV-B in modo che solo la regione desiderata sarà esposta.
   Nota: In questo momento, devono essere utilizzati dpi appropriati. La lunghezza del tempo necessario per irradiare il mouse dipende dall'intensità della lampadina utilizzata, ma potrebbe essere necessario monitorare l'anestesia se il tempo richiesto supera i 30 s.
6. Coprire la camera UV utilizzando il coperchio resistente ai raggi UV o qualsiasi altro materiale idoneo.
7. Accendere la lampada UV-B e irradiare il mouse per il tempo determinato dai ricercatori per l'obiettivo specifico.
8. Spegni il sistema UV e l'isoflurano, quindi posiziona il mouse su una gabbia per topi vuota fino a quando l'anestesia non si è esaurita.
9. Restituisci i topi alle loro gabbie.

5. lavorazione dei tessuti

1. Isolamento cutaneo
   1. Prima di iniziare, ottenere quanto segue: strumenti di necroscopia, carta da filtro e asciugamani di carta.
   2. Euthanize i topi secondo i protocolli approvati da IACUC e confermano la morte prima di procedere.
   3. Utilizzando un tagliacapelli, radersi i capelli dalla zona della pelle dorsale. Spazzolare leggermente l'area con un tessuto privo di lanugine per liberare l'area.
   4. Fare una piccola incisione con forbici affilate appena sopra la base della coda.
   5. Inserire grandi forbici smussati nell'incisione e separare i tessuti connettivi subdermici.
   6. Isolare accuratamente la regione di pelle di interesse tagliando con forbici affilate lungo il bordo del tessuto.
   7. Mettere il tessuto della pelle su un panno di carta pulito e utilizzare pinze opache per allungare la pelle in modo che aderisce all'asciugamano e viene insegnato. Questo passaggio serve a fornire un supporto aggiuntivo per il tessuto in modo che possa essere manipolato ed elaborato mantenendo la sua forma.
      Nota: Fare attenzione a gestire solo le regioni esterne del tessuto cutaneo, poiché le pinze possono causare danni alla pelle che può essere visto istologicamente.
2. Fissazione dei tessuti
   1. Piegare un pezzo di carta filtrante a metà e etichettare appropriatamente. Posizionare la pelle insieme al supporto di tovagliolo di carta nella carta piegata immediatamente adiacente alla piega, assicurando che il campione sia liscio e non piegato o sgualcito. Sigillare la carta filtrante pinzando i lati aperti, quindi tagliare in modo che la carta rimanente possa essere utilizzata per i campioni futuri.
      Nota: Questo passaggio viene eseguito in modo che la pelle mantenga la sua forma durante la fissazione.
   2. Immergere completamente il campione di tessuto in formalina tamponata neutra al 10% per 3 a 5 ore a temperatura ambiente o durante la notte a 4 ° c.
   3. Dopo la fissazione, rimuovere i campioni da formalina, lavare in acqua deionizzata (2x, 5 min ciascuno) e procedere a fare blocchi di tessuto. Rimuovere con cautela qualsiasi materiale residuo dal tessuto cutaneo (ad es. carta residua).
3. Creazione di blocchi di tessuto congelati (Figura 1)
   1. Tagliare i bordi del campione di pelle in modo che non siano frastagliati e quindi fare 3 tagli sagittali. La larghezza di queste strisce non deve essere superiore all'altezza del criomantico (5 mm). Successivamente, fare tagli trasversali per avere pezzi di pelle che non sono più lunghi della larghezza del criomantico (20 mm) e possono essere incorporati. Ripetere con la metà restante della pelle dorsale, o salvare il tessuto per altri usi (alternativamente, salvare la metà prima della fissazione).
      Nota: È importante tenere i pezzi di pelle in un orientamento corretto.
   2. Orientare il criomantico (25 x 20 x 5 mm³) in un orientamento verticale e posizionare da 4 a 5 pezzi di pelle sulla parte superiore del PTOM. Una volta che tutti i pezzi sono in posizione, utilizzare 2 paia di pinze sottili per portare il bordo lungo della pelle al fondo del criomantico. Ora la pelle dovrebbe essere in piedi nel PTOM perpendicolare alla base dello stampo. Fare attenzione a minimizzare la formazione di sacche d'aria all'interno del PTOM durante questa fase (Figura 1).
   3. Riempire lo stampo con OCT al secondo labbro e posizionarlo sulla superficie piana del ghiaccio secco. Utilizzare pinze per regolare eventuali pezzi di pelle che possono essere spostati durante il trasferimento come il blocco comincia a congelare. Una volta che lo strato inferiore è solidificato, la manipolazione dei tessuti sarà impossibile.
   4. Tagliare i vetrini da 8-10 μm per l'analisi.
4. Creazione di blocchi tissutali fissi in paraffina incorporati (FFPE) di formalin
   1. Mettere 2 pezzi di pelle fissa in una cassetta etichettata e disidratare in concentrazioni crescenti di etanolo (75% etanolo per 30 min, 85% per 30 min, 90% per 30 min, 95% per 30 min, 100% per 2x 30 min, xilene o xilene sostituto per 2x 30 min). Incubare con paraffina a 58-60 °, prima per 30 minuti, e poi durante la notte.
   2. Incorporare il tessuto in uno stampo di tessuto in acciaio inox 24 x 24 mm² con paraffina liquida e solidificare a-5 ° c. L'orientamento tissutale deve essere simile a quello dei blocchi di tessuto congelati in modo che le sezioni longitudinali su più follicoli piliferi possano essere visualizzate (Figura 1).
   3. Una volta che la paraffina si è solidificata, rimuovere lo stampo e tagliare in sezioni 5-10 μm per l'analisi.

Risultati

Inizio del melanoma cutaneo indotto dalla depilazione chimica

La procedura di depilazione chimica è raffigurata in Figura 2. Quando i topi sono 7 settimane dopo Natale, la loro pelle dorsale è in telogen. Durante telogen, cellule staminali follicoli piliferi e MCSCs sono noti per essere in uno stato quiescente, riposo. La pelle non dovrebbe mostrare alcuna crescita significativa d...

Discussione

Le alterazioni genetiche di Hallmark che si trovano frequentemente nei tumori del melanoma cutaneo sono state ben descritte¹³. La mutazione più dominante del conducente è BRAF^V600E, e un modello di topo geneticamente modificato per il melanoma BRAF^V600E-mediato è stato generato dal gruppo Bosenberg¹⁴ e depositato nel Jackson Laboratory. Utilizzando questo modello di topo, il nostro recente studio ha dimostrato il requisito dell'att...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tamoxifen	Sigma	T5648-1G	For systemic injection
Tamoxifen	Cayman Chemical	13258	For systemic injection
Corn oil	Sigma	45-C8267-2.5L-EA
4OH-tamoxifen	Sigma	H7904-25MG	For topical treatment
26 G 1/2" needles	various		Veterinary grade
1 mL syringe	various		Veterinary grade
Pet hair trimmer	Wahl	09990-502
Hair removal cream	Nair	n/a	Available at most drug stores
Cotton swabs	various
Ultraviolet light bulb	UVP	95-0042-08	model XX-15M midrange UV lamp
200 proof ethanol	various		pure ethanol
Histoplast PE	Fisher Scientific	22900700	paraffin pellets
Neutral Buffered Formalin, 10%	Sigma	HT501128-4L
Clear-Rite 3	Thermo Scientific	6901	xylene substitute
O.C.T. Compound	Thermo	23730571
Tissue Cassette	Sakura	89199-430	for FFPE processing
Cryomolds	Sakura	4557	25 x 20 mm
FFPE metal mold	Leica	3803082	24 mm x 24 mm
Isoflurane	various		Veterinary grade
Anesthesia inhalation system	various		Veterinary grade
Fine scissor	FST	14085-09	Straight, sharp/sharp
Fine scissor	FST	14558-09	Straight, sharp/sharp
Metzenbaum	FST	14018-13	Straight, blunt/blunt
Forcep	FST	11252-00	Dumont #5
Forcep	FST	11018-12	Micro-Adson
Tyr-CreER; LSL-BrafV600E; Pten-f/f	Jackson Labs	13590
LSL-tdTomato	Jackson Labs	007914	ai14
Cre-1		n/a	GCATTACCGGTCGATGCAACGA GTGATGAG
Cre-2		n/a	GAGTGAACGAACCTGGTCGAA ATCAGTGCG
Braf-V600E-1		n/a	TGAGTATTTTTGTGGCAACTGC
Braf-V600E-2		n/a	CTCTGCTGGGAAAGCGGC
Kras-G12D-1		n/a	AGCTAGCCACCATGGCTTGAGT AAGTCTGCA
Kras-G12D-2		n/a	CCTTTACAAGCGCACGCAGACT GTAGA
Pten-1		n/a	ACTCAAGGCAGGGATGAGC
Pten-2		n/a	AATCTAGGGCCTCTTGTGCC
Pten-3		n/a	GCTTGATATCGAATTCCTGCAGC
tdTomato-1		n/a	AAGGGAGCTGCAGTGGAGTA
tdTomato-2		n/a	CCGAAAATCTGTGGGAAGTC
tdTomato-3		n/a	GGCATTAAAGCAGCGTATCC
tdTomato-4		n/a	CTGTTCCTGTACGGCATGG