돌연변이 멜 뮤 린 줄기 세포에서 시작 하는의 공간적 및 시간적 제어

요약

다음 절차는 유전자 조작 된 마우스 모델을 사용 하 여 뮤 린 등 피부에 멜 라 세포 종양 개시의 공간적 및 시간적 제어를 위한 방법을 설명 합니다. 이 프로토콜은 거시적 뿐만 아니라 현미경 피부 흑색 종 개시를 설명 합니다.

초록

피부 흑색 종은 가장 공격적인 피부 암으로 잘 알려져 있습니다. 비록 위험 요인과 주요 유전 변화는 계속 해 서 증가 하는 깊이로 문서화 될 수 있지만, 피부 흑색 종의 발병 률은 최근 수십 년 동안 급속 하 고 지속적인 증가를 보이고 있다. 효과적인 예방 방법을 찾기 위해, 피부에 흑색 종 개시의 초기 단계를 이해 하는 것이 중요 합니다. 이전 데이터는 종양 생성 돌연변이 및 유전적 변경을 발현 할 때 성체 피부 조직에서 여 포 멜 라 닌 세포 (MCSCs)가 원산지의 흑색 종 세포로 작용할 수 있다는 것을 입증 하였다. 흑색 종에 걸리기 쉬운 MCSCs에서 발생 하는 종양은 대기에서 활성 상태로의 MCSCs 전이로 인해 유발 될 수 있다. 흑색 종 발생 가능한 MCSCs에서의 이러한 전환은 모 낭 줄기 세포의 활성 상태 또는 자외선-b와 같은 외적 환경적 요인을 통해 어느 하나의 변조에 의해 촉진 될 수 있다. 이러한 요인은 화학 탈모에 의해 실험실에서 인위적으로 조작 될 수 있으며,이는 모 낭 줄기 세포와 MCSCs를 정 동작 상태에서 활성 상태로, 그리고 벤치탑 광을 사용 하 여 UV-B 노출로 전환 시키는 원인이 됩니다. 이 방법 뮤 린 등 쪽 피부에 있는 피부 흑색 종 개시의 성공적인 공간 그리고 시간적 통제를 제공 합니다. 따라서, 이러한 생체 내 모델 시스템은 피부 흑색 종 개시의 초기 단계를 정의 하 고 종양 예방을 위한 잠재적인 방법을 시험 하는데 사용 될 수 있는 가치가 있을 것 이다.

서문

흑색 종, 멜 라 세포 종양의 악성 형태는 대부분의 피부 암 사망¹을 담당 하는 피부 흑색 종으로 피부의 가장 공격적인 암입니다. 미국에서, 흑색 종은 일반적으로 진단 됩니다; 2018²에서 추정 된 새로운 암 발병 사례 중 5^th 내지 6^번째 가장 흔한 암 유형으로 예상 된다. 더욱이, 전반적인 암 발생률은 최근 수십 년 동안 점진적으로 감소 하는 경향을 보이고 있지만, 지난 몇 십년 동안 피부 흑색 종 발생률은 두 성별 모두에서 지속적이 고 급속 한증가를 보여줍니다.

피부 흑색 종을 보다 효율적으로 퇴치 하기 위해, 임상적으로 효과적인 예방 방법을 더 잘 식별 하기 위해 원산지 세포에서 흑색 종 발달의 초기 사건을 명확 하 게 이해 하는 것이 중요 합니다. 현재 성체 줄기 세포는 피부 조직^3,4,5등 다양 한 유형의 장기에서 암의 세포 기원으로 종양 형성에 크게 기여할 수 있는 것으로 알려져 있습니다. 마찬가지로, 뮤 린 등 쪽 피부에 있는 성체 멜 라 닌 세포 (MCSCs)는 Ras/Raf 및 Akt 통로의 변종 활성화 시 기원의 흑색 종 세포로 서 일할 수 있다⁶. 그러나, 이러한 발암 돌연변이 단독은 정 맥 내에서 종양 형성을 효율적으로 유도할 수 없다. 멜 리 세포 종양은 결국 MCSCs 자연 헤어 사이클링 동안 활성화 될 때 개발. 그러나,이 프로토콜에서, 우리는 인위적으로 흑색 종 개시⁶의 정확한 통제를 촉진 하는 종양에 걸리기 쉬운 mcscs의 세포 활성화를 유도 하는 방법을 설명할 것입니다^,7.

여기에 설명 된 방법을 통해 서, 피부 흑색 종의 공간적 및 시간적 제어는 종양 발생 가능성이 있는 MCSCs에서 시작 하 여 Pten 발현 손실과 함께 발암 성 braf^V600E 을 발현 하 여 성공적으로 수행 될 수 있습니다. 이전에 보고 된⁶. 이 방법은 탈모를 통해 모 낭 줄기 세포 활성화를 보여주는 이전 연구 결과를 통합 하 고 뮤 린 피부를 UV-B에 노출 시키는 방법 뿐만 아니라 모 낭에 거주 하는 MCSCs의 활성화와이 세포의 이식에 도움이 될 수 있습니다. 간 모 낭 표 피⁶,⁹,¹⁰에 대 한 하위 집단. 이러한 생체 내 모델 시스템은 피부에 흑색 종의 현저한 개시를 유도할 수 있는 흑색 종 경향이 있는 MCSCs의 세포 상태를 변화 시킬 수 있는 생리 적 및 환경적 변화가 어떻게 하는지에 관한 귀중 한 정보를 제공할 수 있다.

프로토콜

모든 동물 절차는 코넬 대학 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 따라 수행 됩니다.

1. 준비

1. 12 일간의 산 후 마우스에서 꼬리 클립을 수집 하 고 400 µ L의 0.05에서 NaOH를 95 ° c에서 1 시간 동안 µ를 첨가 하 고 1M(1 M), pH 7의 1m 인 트리 스-HCl을 32 추가 하였다. 유전자 형 마우스는 잭슨 실험실을 통해 제공 된 PCR 프로토콜에 따라, 마우스를 관심의 유전자 형으로 식별 하 고⁶.
   -티 르 -크 레 머- 헤이 거 대 한 (+/creer)
   - LSL-Braf^V600E -이종 접합 체 (+/lsl-600e)
   - Pten- 동형 접합 체 (flox/flox)
   - LSL-트 토마토 -헤이 큰 (+/l sl-td토마토)
   참고: 프라이 머 서 열은 재료의 표로제공 된다.
2. 머리 깎기 (전동 트리머)를 사용 하 여 아래에 설명 된 모든 실험을 시작 하기 2 ~ 3 일 전에 등 쪽 피부를 면도 하 고, 생쥐가 약 7 주 나 되는 경우. 전기 트리머를 사용 하 여 얇은 마우스 피부가 손상 되지 않도록 주의 하십시오. 모든 부상은 MCSCs를 포함 한 모 낭 줄기 세포를 활성화 하는 상처 치유 반응을 끌어낼 수 있습니다.
3. 헤어 사이클이 휴지기에 있는지, 그리고 대기 기간 동안 피부가 상처를 입는 지 확인 합니다. 피부에 부상의 징후가 나타나면 마우스를이 절차에 사용 하지 말아야 합니다.
   참고: 모발 주기는 유전 배경 사이에서 경미하게 다를 수 있더라도,이 나이에 등 쪽 피부에 있는 머리 주기는 일반적으로 휴지기 상태¹¹에서입니다. 티 르 -creer 이식 유전자는 휴지기 피부에 있는 mcscs를 표적으로 하 고, 연속적인 유전 변경은 분화 된 멜 라 닌 세포 및 멜 라 이드 종양을 포함 하 여 mcscs의 모든 선 지에서 영구히 발현 될 것입니다.

2. 크리 록스 유전 재조합을 위한 타 목 타 펜 처리

1. 전신 또는 국 소화 된 유전 재조합을 위한 복 강 내 주입 (IP) 또는 국 소 투여를 위한 타 목 타 펜의 제조
   참고: 타 목 시 펜이 재결합을 유도 하기 위해서는, 처음에는 간에 서 4-하이드 록 시 타 펜 타 펜 (4OHT)으로 물질 대사로 변화 시켜야 하며,이는 Creer에 바인딩하고 활성화 될 수 있습니다. 타 목 시 펜의 국 소 적용은이 방법으로 대사 되지 않으며, 4-OHT가 직접 사용 해야 합니다. 충분 한 재결합을 위해서는 타 목 시 펜 전달의 한 가지 방법이 필요 합니다.
   1. 타 목 시 펜: 옥수수 기름에 용 해 된 10 밀리 그램^-1 의 농도에서에 스 타 목을 준비 하십시오. 약물의 용액으로의 용 해를 돕기 위해 분말 형태로 약물에 100%의 총 부피의 10%의 분자 등급 에탄올을 추가 하 고 3 분간 소용돌이 한 다음 남은 양의 옥수수 오일을 추가 합니다. 결정 재료가 더 이상 용액에서 명백 해질 때까지 소용돌이를 계속 합니다. 타 목 타 펜 용액은 0.2 µm 필터를 통과 시켜 멸 균 할 수 있다. 치료를 위해 2.2.1 단계를 진행 하십시오.
   2. 4-OHT: 100% 에탄올에서 최대 3mg/ml의 하이드 록 시 타 목의^원 액을 제조 한다. 그런 다음, 작업 용액은 관심 있는 피부 영역 (일반적으로 단일 응용 프로그램)을 충당 하기 위해 필요한 만큼 적용 할 수 있습니다.
      참고: 하이드 록 시 타 목 시 펜의 원 액을 100% 에탄올에 녹 인 후 최종 농도 5mm로 할 수 있다. 이어서, 작동 용액을 제조 하기 위하여, 4OH-타 목 타 정 원 액의 5 µ L을 100% 에탄올에 15 µ L로 희석 시킬 수 있다. 4mm² 영역에 대해서는 1 ~ 3 µ의 작업 용액을 국 소 적으로 적용할 수 있습니다.
2. 전신 또는 국 소 적으로 타 목 타 펜으로 생쥐 치료
   1. 전신 치료를 위해, 26G 바늘을 사용 하 여 3 일 동안 매일 한 번씩 IP 주입을 통해 타 목 타 펜 2 mg을 투여 하십시오.
      참고: 이 모델을 사용 하 여 정 동작 MCSCs의 약 93% ± 4%가 tdTomato⁶으로 표시 됩니다.
   2. 지역 활성화를 위해, 4-OHT와 하나의 국 소 치료를 수행 합니다. 작업 솔루션으로 관심의 피부 영역을 커버. 작업 용액의 양은 단계 2.1.2에서 기술 한 바와 같이 관심 영역의 크기에 의해 결정 될 수 있다.
3. 타 목 시 펜의 마지막 투여 량 다음에 48 h에서, 화학 탈모 유발 종양 개시를 위한 단계 3 또는 UV B 유도 종양 개시를 위한 4 단계로 진행

3. 화학적 탈모

1. 아이 소 루 레인 시스템이 포함 된 마우스 트리트먼트 룸에 다음과 같은 필수 자료가 장착 되어 있습니다: 헤어 제거 크림, 코 튼 면봉, 종이 피복 및 물.
2. 마우스를 유도 챔버에 넣고 3.5 4.5%의이 소 폴 루 레인 및 1L/min 산소로 마 취 시켰다.
3. 호흡 률이 안정화 되 면, 마우스가 발가락 핀치를 수행 하 여 적절 한 마 취 면에 있는지 확인 하 고 마우스를 메인 튜브에 1 ~ 1.5%의 아이 소 루 레인 및 1 L/min 산소와 함께 마 취 유지로 이동 시킨다. 눈가 마 취하에 있는 동안 건조에서 눈을 유지 하기 위해 안구 연 고를 적용 합니다.
4. 면봉을 사용 하 여 머리카락 제거 크림의 얇은 층을 마우스 피부의 면도 영역에 적용 하십시오.
5. 크림이 고르게 도포 되 면, 깨끗 한 면봉을 사용 하 여 제거를 시작 합니다. 크림이 피부와 접촉 하는 총 시간은 1 분을 초과 하지 않아야 합니다.
6. 젖은 종이 천으로 피부를 부드럽게 닦아 내 고 잔류 크림이 제거 되었는지 확인 합니다.
   참고: 모발 제거 크림은 완전히 제거 되지 않은 경우 피부에 자극을 유발할 수 있습니다. C57BL/6 배경에 있는 것과 같은 일부 생쥐는 피부염¹²를 개발 하는 경향이 있을 수 있습니다. 드문 경우 지만, 일부 동물은 제 모 크림 응용 프로그램 또는 기계적 탈모 후 24 시간 이내에 피부염을 개발할 것입니다. 지역 피부 자극의 흔적을 찾기 위해 치료 후 하루에 생쥐를 확인 하십시오.
7. 제거 된 머리 샤프트와 생물 학적 빈에 사용 된 모든 재료를 버리십시오.
8. 마 취가 닳아 없어질 때까지 마우스를 빈 깨끗 한 마우스 케이지에 놓습니다.
9. 생쥐를 케이지로 돌려 준다.

4. UV-B 조사

1. 아이 소 루 레인 시스템이 포함 된 마우스 트리트먼트 룸에 다음과 같은 필수 자료가 장착 되어 있습니다. 자외선-b 광 시스템, 자외선-B 라이트 미터, 마우스 보호용 커버, 연구원을 위한 추가 UV-B 보호 PPE 및 타이머.
2. 마우스는 관심의 UV-B 용량 (즉, 0-180 mJ/2cm²)에서 조사 되어야 한다. UV-B 라이트 미터를 사용 하 여 마우스를 조사 하는 적절 한 시간 길이를 결정 합니다.
   참고: mW/센티미터² x 시간 = 복용량
3. 마우스를 아이 소 루 레인으로 마 취 시킵니다. 유도 챔버에 있는 동안, 3.5를 4.5% 아이 소 루 레인 및 1L/min 산소에 사용 하십시오.
4. 마우스가 안정 되 면, 발가락 핀치와 마 취 효과를 확인 하 고 UV 챔버에 있는 주요 마 취 튜브에 마우스를 전송 합니다. 눈이 마 취하는 동안 건조에서 눈을 방지 하기 위해 안구 연 고를 적용 합니다. 아이 소 루 레인 1 ~ 1.5%와 1 L/min 산소로 마 취를 유지 합니다.
5. 등 쪽 피부를 UV-B 보호 물질로 덮어 서 원하는 부위만 노출 시킵니다.
   참고: 이때 적절 한 PPE를 활용 해야 합니다. 마우스를 조사 하는 데 필요한 시간은 사용 된 전구의 강도에 따라 다르지만 필요한 시간이 30 초를 초과 하면 마 취를 모니터링 해야 할 수 있습니다.
6. Uv 방지 뚜껑 또는 다른 적합 한 재료를 사용 하 여 UV 챔버를 덮으 십시오.
7. 자외선 B 램프를 켜고 특정 목적을 위해 연구자에 의해 결정 된 시간 동안 마우스를 조사.
8. UV 시스템과 아이 소 포컬을 끄고, 마 취가 닳아 없어질 때까지 마우스를 빈 마우스 케이지에 놓습니다.
9. 생쥐를 케이지로 돌려 준다.

5. 조직 처리

1. 피부 분리
   1. 시작 하기 전에 다음을 구하십시오: 악기, 필터 종이 및 종이 타월.
   2. IACUC 승인 프로토콜에 따라 마우스를 안락사 시키고, 진행 하기 전에 사망을 확인 한다.
   3. 머리 깎기를 사용 하 여 등 쪽 피부 부분에서 어떤 머리를 면도. 보풀이 없는 티슈로 가볍게 닦 고 지역을 지웁니다.
   4. 꼬리의 기저 부 바로 위에 날카로운가 위로 작은 절 개를 하십시오.
   5. 절 개에 큰 무딘가 위를 삽입 하 고 진 피 결합 조직을 분리 합니다.
   6. 조직의 가장자리를 따라 날카로운가 위를 절단 하 여 관심 있는 피부 영역을 조심 스럽게 분리 합니다.
   7. 깨끗 한 종이 타월 위에 피부 조직을 놓고 무딘 집게를 사용 하 여 피부를 스트레칭 하 여 수건에 부착 하 고가 르 쳤 다. 이 단계는 그것의 모양을 유지 하면서 조작 하 고 처리 할 수 있도록 조직에 대 한 추가 지원을 제공 하는 역할을 한다.
      참고: 조직 학적으로 볼 수 있는 피부에 손상을 일으킬 수 있기 때문에 피부 조직의 외부 영역을 처리 하는 것에 주의 하십시오.
2. 조직 고정
   1. 필터 용지를 반으로 접어 적절 하 게 라벨을 부착 합니다. 종이 타월과 함께 피부를 주름에 바로 인접 한 접힌 용지에 놓고 샘플이 부드럽고 접혀 있지 않도록 합니다. 열린 면을 스테이플 하 여 여과 지를 밀봉 한 다음 나머지 용지가 향후 샘플에 사용 될 수 있도록 트림 합니다.
      참고: 이 단계는 고정 하는 동안 피부가 모양을 유지 하도록 수행 됩니다.
   2. 실 온에서 3 ~ 5 시간 동안 10% 중성 완충 포 르 말린으로 조직 샘플을 완전히 서브 머지 하 고 4°c에서 밤새 한다.
   3. 고정 후, 포 르 말린에서 샘플을 제거 하 고, 탈 이온 수 (각 5 분)에 세척 하 고 조직 블록을 만들기로 진행 합니다. 피부 조직 (즉, 잔여 종이)에서 잔류 물질을 조심 스럽게 제거 하십시오.
3. 냉동 조직 블록 만들기 (그림 1)
   1. 피부 샘플의 가장자리를 정돈 하 여 톱니가 고르지 않도록 하 고 3 개의 궁탈 컷을 만듭니다. 이러한 스트립의 폭은 냉동 몰드 (5mm)의 높이 이상 이어야 한다. 다음으로, 하 부 금형 (20mm)의 폭 보다 더 길고, 포함 될 수 있는 피부 조각을 갖도록 횡 방향 절단을 합니다. 등 쪽 피부의 나머지 절반을 반복 하거나 다른 용도로 조직을 저장 하십시오 (또는 고정 하기 전에 반을 저장 하십시오).
      참고: 적절 한 방향으로 피부 조각을 유지 하는 것이 중요 합니다.
   2. 세로 방향으로 동결 금형 (25 x 20 x 5mm)의 방향을 지정 하 고 10 월에 4 ~ 5 개 피부를 놓습니다. 모든 조각이 제자리에 되 면, 두 쌍의 미세 집게를 사용 하 여 피부의 긴 가장자리를 저온 금형의 바닥으로 가져옵니다. 이제 피부가 몰드의 베이스에 수직인 OCT에 서 있어야 합니다. 이 단계에서 10 월 내에에 어 포켓의 형성을 최소화 하기 위해 주의를 기울여야 합니다 (그림 1).
   3. 10 월에 두 번째 립에 금형을 채우고 드라이 아이스의 평평한 표면에 놓습니다. 집게를 사용 하 여 블록이 동결 되기 시작 하면 이동 중에 이동 했을 수 있는 모든 피부 조각을 조정 하십시오. 바닥 층이 응고 되 면, 조직의 조작은 불가능 할 것 이다.
   4. 컷 8-10 µm 슬라이드를 분석 합니다.
4. 포 르 말린 고정 파라핀 임베디드 (FFPE) 조직 블록을 만들기
   1. 고정 된 피부 2 개를 표지 된 카세트에 넣고 에탄올의 농도를 30 분으로 증가 시 킴으로써 (75% 에탄올, 30 분에 대 한 85%, 30 분에 대 한 90%, 2 배 30 분에 대 한 100 95%, 자일 렌 또는 자일 렌은 2x 30 분으로 대체 합니다. 58-60 ˚에서 파라핀으로 30 분 동안 먼저 배양 한 다음 밤새 사용 합니다.
   2. 액체 파라핀으로 24 x 24 mm² 스테인레스 스틸 티슈 몰드에 조직을 내장 하 고-5°c에서 응고 시켰다. 조직 방향은 여러 모 낭에 걸쳐 세로 섹션을 시각화 할 수 있도록 냉동 조직 블록의 것과 비슷해야 합니다 (그림 1).
   3. 파라핀이 응고 되 면 몰드를 제거 하 고 분석을 위해 5-10 μ m 섹션으로 자릅니다.

결과

화학 탈모에 의해 유도 된 피부 흑색 종 개시

화학 탈모의 절차는 그림 2에 묘사 되어 있습니다. 생쥐가 7 주 후 나 탈 때, 등 쪽 피부가 telogen에 있습니다. Telogen 동안, 모 낭 줄기 세포 및 MCSCs는 정 동작, 휴식 상태에 있는 것으로 알려져 있다. 피부는 면도 후 중요 한 머리카락의 성장을 표시 ?...

토론

피부 흑색 종 종양에서 자주 발견 되는 홀 마크 유전 변경은 잘 설명 되어 있습니다¹³. 가장 지배적 인 드라이버 돌연변이는 Braf^V600E이 고, braf^V600E매개 흑색 종을 위한 유전적으로 조작 된 마우스 모델은 보 센 버그 그룹¹⁴ 에 의해 생성 되 고 잭슨 실험실에서 증 착 되었다. 이 마우스 모델을 사용 하 여, 우리의 최근 연구는 등 쪽 피?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tamoxifen	Sigma	T5648-1G	For systemic injection
Tamoxifen	Cayman Chemical	13258	For systemic injection
Corn oil	Sigma	45-C8267-2.5L-EA
4OH-tamoxifen	Sigma	H7904-25MG	For topical treatment
26 G 1/2" needles	various		Veterinary grade
1 mL syringe	various		Veterinary grade
Pet hair trimmer	Wahl	09990-502
Hair removal cream	Nair	n/a	Available at most drug stores
Cotton swabs	various
Ultraviolet light bulb	UVP	95-0042-08	model XX-15M midrange UV lamp
200 proof ethanol	various		pure ethanol
Histoplast PE	Fisher Scientific	22900700	paraffin pellets
Neutral Buffered Formalin, 10%	Sigma	HT501128-4L
Clear-Rite 3	Thermo Scientific	6901	xylene substitute
O.C.T. Compound	Thermo	23730571
Tissue Cassette	Sakura	89199-430	for FFPE processing
Cryomolds	Sakura	4557	25 x 20 mm
FFPE metal mold	Leica	3803082	24 mm x 24 mm
Isoflurane	various		Veterinary grade
Anesthesia inhalation system	various		Veterinary grade
Fine scissor	FST	14085-09	Straight, sharp/sharp
Fine scissor	FST	14558-09	Straight, sharp/sharp
Metzenbaum	FST	14018-13	Straight, blunt/blunt
Forcep	FST	11252-00	Dumont #5
Forcep	FST	11018-12	Micro-Adson
Tyr-CreER; LSL-BrafV600E; Pten-f/f	Jackson Labs	13590
LSL-tdTomato	Jackson Labs	007914	ai14
Cre-1		n/a	GCATTACCGGTCGATGCAACGA GTGATGAG
Cre-2		n/a	GAGTGAACGAACCTGGTCGAA ATCAGTGCG
Braf-V600E-1		n/a	TGAGTATTTTTGTGGCAACTGC
Braf-V600E-2		n/a	CTCTGCTGGGAAAGCGGC
Kras-G12D-1		n/a	AGCTAGCCACCATGGCTTGAGT AAGTCTGCA
Kras-G12D-2		n/a	CCTTTACAAGCGCACGCAGACT GTAGA
Pten-1		n/a	ACTCAAGGCAGGGATGAGC
Pten-2		n/a	AATCTAGGGCCTCTTGTGCC
Pten-3		n/a	GCTTGATATCGAATTCCTGCAGC
tdTomato-1		n/a	AAGGGAGCTGCAGTGGAGTA
tdTomato-2		n/a	CCGAAAATCTGTGGGAAGTC
tdTomato-3		n/a	GGCATTAAAGCAGCGTATCC
tdTomato-4		n/a	CTGTTCCTGTACGGCATGG