Contrôle spatial et temporel de l’initiation du mélanome murin à partir de cellules souches de mélanocytes mutants

Résumé

La procédure suivante décrit une méthode de contrôle spatial et temporel de l’initiation de tumeurs mélanocytaires dans la peau dorsale murin, à l’aide d’un modèle de souris génétiquement modifiée. Ce protocole décrit l’initiation des mélanomes cutanés macroscopiques et microscopiques.

Résumé

Le mélanome cutané est bien connu comme le cancer de la peau le plus agressif. Bien que les facteurs de risque et les modifications génétiques majeures continuent d’être documentés avec une profondeur croissante, le taux d’incidence du mélanome cutané a montré une augmentation rapide et continue au cours des dernières décennies. Afin de trouver des méthodes préventives efficaces, il est important de comprendre les premiers pas de l’initiation du mélanome dans la peau. Des données antérieures ont démontré que les cellules souches de mélanocytes folliculaires (MCSCs) dans les tissus cutanés adultes peuvent agir comme des cellules d’origine du mélanome lorsqu’elles expriment des mutations oncogéniques et des altérations génétiques. La tumorigenèse causée par les MCSC sujettes aux mélanomes peut être induite lorsque les MCSCs passent d’un état de repos à actif. Cette transition dans les MCSCs sujettes aux mélanomes peut être favorisée par la modulation de l’état d’activité des cellules souches du follicule pileux ou par des facteurs environnementaux extrinsiques tels que l’ultraviolet-B (UV-B). Ces facteurs peuvent être manipulés artificiellement en laboratoire par dépilation chimique, ce qui provoque la transition des cellules souches de follicule pileux et des MCSCs d’un état de repos à actif, et par l’exposition UV-B utilisant une lumière de paillehaut. Ces méthodes permettent un contrôle spatial et temporel réussi de l’initiation du mélanome cutané dans la peau dorsale murin. Par conséquent, ces systèmes de modèles in vivo seront utiles pour définir les premiers pas de l’initiation du mélanome cutané et pourraient être utilisés pour tester les méthodes potentielles de prévention des tumeurs.

Introduction

Le mélanome, la forme maligne des tumeurs mélanocytaires, est le cancer le plus agressif dans la peau avec un mélanome cutané responsable de la majorité des décès par cancer de la peau¹. Aux États-Unis, le mélanome est couramment diagnostiqué; Il devrait s’agir du 5^ème au 6^ème type de cancer le plus fréquent parmi les nouveaux cas de cancer estimés en 2018². En outre, alors que les incidences globales sur le cancer ont montré la tendance de la réduction progressive au cours des dernières décennies, les taux d’incidence des mélanomes cutanés au cours des dernières décennies démontrent une augmentation continue et rapide des deux sexes².

Pour lutter plus efficacement contre le mélanome cutané, il est important de bien comprendre les premiers événements du développement du mélanome à partir de leurs cellules d’origine afin de mieux identifier les méthodes préventives cliniquement efficaces. Il est maintenant connu que les cellules souches adultes peuvent contribuer significativement à la formation de tumeurs comme les origines cellulaires des cancers dans de nombreux types différents d’organes, y compris les tissus de la peau^3,4,5. De même, les cellules souches de mélanocytes adultes (mcscs) dans la peau dorsale murin peuvent fonctionner comme des cellules de mélanome d’origine lors d’une activation aberrante des voies RAS/RAF et Akt ⁶. Cependant, ces mutations oncogéniques seules ne sont pas en mesure d’induire efficacement la formation de tumeurs des MCSC quiescents. les tumeurs mélanocytaires finissent par se développer lorsque les MCSCs deviennent actifs lors du cyclisme sur les cheveux naturels. Cependant, dans ce protocole, nous décrirons des méthodes pour induire artificiellement l’activation cellulaire des mcscs sujettes à la tumeur, facilitant ainsi un contrôle précis du mélanome initiation^6,7.

Grâce aux méthodes décrites ici, le contrôle spatial et temporel de l’initiation du mélanome cutané à partir de MCSCs à tendance tumorale exprimant des BRAF^V600E oncogéniques ainsi que la perte d’expression de PTEN peuvent être exécutés avec succès, car nous ont déjà rapporté⁶. Cette méthode incorpore les résultats antérieurs qui démontrent l’activation de cellules souches de follicule pileux par dépilation ainsi que comment l’exposition de la peau de murin à UV-B peut faciliter l’activation des mcscs résidant au follicule pileux et à la translocation de ce cellulaire sous-population à l’épiderme interfolliculaire^6,8,9,10. Ces systèmes de modèles in vivo peuvent fournir des informations précieuses sur la façon dont les changements physiologiques et environnementaux peuvent altérer l’État cellulaire des MCSC sujettes aux mélanomes, qui à leur tour peuvent induire une initiation significative du mélanome dans la peau.

Protocole

Toutes les procédures animales sont exécutées conformément au Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université Cornell (IACUC).

1. la préparation

1. Prélever des clips de queue à partir de souris postnatales de 12 jours et digérer dans 400 μL de 0,05 N NaOH à 95 ° c pendant 1 h. vortex et ajouter 32 μL de Tris-HCl 1 M, pH 7. Les souris génotypes selon les protocoles de PCR fournis par le laboratoire Jackson et identifient les souris ayant un génotype d’intérêt⁶.
   - Tyr-creer -hemizyzygote (+/creer)
   - LSL-BRAF^V600E – hétérozygote (+/LSL-V600E)
   - PTEN -Flox homozygote (Flox/Flox)
   - LSL-tdtomate – hemizyte (+/LSL-tdtomate)
   Remarque: Les séquences d’amorce sont fournies dans le tableau des matériaux.
2. Utilisez une tondeuse à cheveux (tondeuse électrique) pour raser la peau dorsale 2 à 3 jours avant toutes les expériences décrites ci-dessous, et lorsque les souris ont environ 7 semaines d’âge. Prenez soin de ne pas endommager la peau mince de la souris à l’aide de la tondeuse électrique comme toute blessure peut susciter une réponse de guérison de la plaie qui activera les cellules souches de follicule pileux, y compris MCSCs.
3. Déterminez si le cycle capillaire est en telogène et si la peau est blessée pendant la période d’attente. Si la peau montre un signe de blessure, la souris ne doit pas être utilisée pour ces procédures.
   Remarque: Bien que le cycle des cheveux peut légèrement différer entre les milieux génétiques, à cet âge, le cycle des cheveux dans la peau dorsale est généralement dans l’État télogène¹¹. Le transgène Tyr-CreER ciblera les MCSC dans la peau télogène, et les altérations génétiques ultérieures seront exprimées de façon permanente dans toutes les lignées du CMCC, y compris les mélanocytes différenciés et les tumeurs mélanocytaires.

2. traitement du tamoxifène pour la recombinaison génétique Cre-lox

1. Préparation du tamoxifène pour injection intrapéritonéale (IP) ou administration topique pour une recombinaison génétique systémique ou localisée
   Remarque: Pour que le tamoxifène induise une recombinaison, il doit d’abord être métabolisé par le foie en 4-hydroxytamoxifen (4-OHT), qui peut se lier et activer le creer. L’application topique du tamoxifène ne sera pas métabolisée de cette façon et 4-OHT doit être utilisé directement. Une seule méthode de livraison du tamoxifène est nécessaire pour une recombinaison suffisante.
   1. Tamoxifène: préparer le tamoxifène à une concentration de 10 mg mL^-1 dissous dans l’huile de maïs. Pour aider à la dissolution du médicament en solution, ajouter jusqu’à 10% de volume total de 100% d’éthanol de qualité moléculaire au médicament sous forme de poudre, Vortex pendant 3 min, puis ajouter le volume restant d’huile de maïs. Continuez à tourbillonner jusqu’à ce que le matériau cristallin ne soit plus apparent en solution. La solution de tamoxifen peut être stérilisée en passant par un filtre de 0,2 μm. Passez à l’étape 2.2.1 pour le traitement.
   2. 4-OHT: préparer une solution d’action de l’hydroxytamoxifène jusqu’à 3 mg ml^-1 dans 100% éthanol. Ensuite, une solution de travail peut être appliquée autant que nécessaire pour couvrir la zone d’intérêt de la peau (généralement une seule application).
      Remarque: Une solution de stock d’hydroxytamoxifène peut être dissoute dans de l’éthanol à 100% pour une concentration finale de 5 mm. Ensuite, pour préparer une solution de travail, 5 μL de solution d’action 4OH-tamoxifen peuvent être diluées dans 15 μL de 100% d’éthanol. Pour une surface de 4 mm² , 1 à 3 μl de solution de travail peuvent être appliqués par voie topique.
2. Traiter les souris avec le tamoxifène soit de façon systémique, soit par voie topique
   1. Pour le traitement systémique, administrer 2 mg de tamoxifène par injection IP une fois par jour pendant 3 jours à l’aide d’une aiguille de 26 G.
      Remarque: À l’aide de ce modèle, environ 93% ± 4% des MCSC quiescents sont étiquetés avec tdTomato⁶.
   2. Pour l’activation régionale, effectuer un traitement topique avec 4-OHT. Couvrez la zone d’intérêt de la peau avec la solution de travail. La quantité de solution de travail peut être déterminée par la taille de la région d’intérêt, comme décrit à l’étape 2.1.2.
3. À 48 h après la dernière dose de tamoxifène, passez à l’étape 3 pour l’initiation de la tumeur induite par la dépilation chimique ou à l’étape 4 pour l’initiation de tumeurs induites par UV-B

3. dépilation chimique

1. Équipez une salle de traitement de souris contenant un système d’isoflurane avec les matériaux suivants requis: crème d’épilation, écouvillons de cotons, chiffon de papier, et l’eau.
2. Placer la souris dans la chambre d’induction et anesthésier avec 3,5 à 4,5% d’isoflurane et 1 L/min d’oxygène.
3. Une fois que la fréquence respiratoire s’est stabilisée, confirmez que la souris est dans le plan approprié de l’anesthésie en effectuant un pincement d’orteil et transférez la souris au tube principal maintenant l’anesthésie avec 1 à 1,5% isoflurane et 1 L/min d’oxygène. Appliquez une pommade oculaire pour empêcher les yeux de sécher pendant l’anesthésie.
4. Utilisez un coton-tige pour appliquer une fine couche de crème épilation à la région rasée de la peau de la souris.
5. Une fois que la crème a été appliquée uniformément, utilisez des écouvillons de coton propres pour commencer l’enlèvement. Le temps total pendant lequel la crème est en contact avec la peau ne doit pas dépasser 1 min.
6. Essuyez délicatement la peau avec un chiffon de papier humide et assurez-vous que toute la crème résiduelle a été enlevée.
   Remarque: Crème épilation peut causer une irritation de la peau si elle n’est pas complètement enlevée. Certaines souris, comme celles sur un fond C57BL/6, peuvent être sujettes à la dermatite de développement¹². Bien que rare, certains animaux développeront la dermatite dans les 24 h après application de crème épilation ou épilation mécanique. Assurez-vous de vérifier les souris le lendemain du traitement pour rechercher des signes d’irritation cutanée régionale.
7. Jetez les arbres à cheveux enlevés et tous les matériaux utilisés dans un casier à Biohazard.
8. Placez la souris dans une cage de souris vide et propre jusqu’à ce que l’anesthésie s’est usée.
9. Retournez les souris dans leur cage.

4. irradiation UV-B

1. Équipez une salle de traitement de souris contenant un système d’isoflurane avec les matériaux suivants requis: système de lumière UV-B, indicateur de lumière UV-B, couverture protectrice pour la souris, EPI de protection UV-B supplémentaires pour le chercheur, et une minuterie.
2. Les souris doivent être irradiées à la dose d’intérêt UV-B (c.-à-d., 0-180 mJ/cm²). Utilisez le compteur de lumière UV-B pour déterminer la durée de temps appropriée pour irradier les souris.
   Note: mW/cm² x temps = dose
3. Anesthésier la souris avec l’isoflurane. Dans la chambre d’induction, utiliser 3,5 à 4,5% d’isoflurane et 1 L/min d’oxygène.
4. Une fois que la souris est stabilisée, confirmez les effets d’anesthésie avec un pincement d’orteil et transférez la souris au tube principal d’anesthésie situé dans la chambre UV. Appliquez la pommade oculaire pour empêcher les yeux de sécher pendant l’anesthésie. Maintenir l’anesthésie avec 1 à 1,5% d’isoflurane et 1 L/min d’oxygène.
5. Recouvrir la peau dorsale d’un matériau protecteur UV-B afin que seule la région désirée soit exposée.
   Remarque: À ce moment, des EPI appropriés devraient être utilisés. La longueur de temps nécessaire pour irradier la souris dépend de l’intensité de l’ampoule utilisée, mais l’anesthésie peut avoir besoin d’être surveillée si le temps requis dépasse 30 s.
6. Couvrez la chambre UV en utilisant un couvercle résistant aux UV ou tout autre matériau approprié.
7. Allumez la lampe UV-B et irradiez la souris pour le temps déterminé par les chercheurs pour l’objectif spécifique.
8. Éteignez le système UV et l’isoflurane, puis placez la souris dans une cage de souris vide jusqu’à ce que l’anesthésie soit usée.
9. Retournez les souris dans leur cage.

5. traitement tissulaire

1. Isolement de la peau
   1. Obtenir les éléments suivants avant le démarrage: instruments à necropsie, papier filtre et essuie-tout.
   2. Euthanasiez les souris selon les protocoles approuvés par l’IACUC et confirmez la mort avant de procéder.
   3. À l’aide d’une tondeuse à cheveux, rasez tous les poils de la zone de la peau dorsale. Badigeonner légèrement la zone avec un tissu sans peluches pour dégager la zone.
   4. Faire une petite incision avec des ciseaux pointus juste au-dessus de la base de la queue.
   5. Insérez de grands ciseaux émoussés dans l’incision et séparez les tissus conjonctifs sous-cutanés.
   6. Isoler soigneusement la région de la peau d’intérêt en coupant avec des ciseaux pointus le long du bord du tissu.
   7. Placez le tissu cutané sur une serviette en papier propre et utilisez des pinces ternes pour étirer la peau afin qu’elle adhère à la serviette et qu’elle soit enseignée. Cette étape sert à fournir un soutien supplémentaire pour le tissu afin qu’il puisse être manipulé et traité tout en conservant sa forme.
      Remarque: Veillez à ne manipuler que les régions extérieures du tissu cutané, car les forceps peuvent causer des dommages à la peau qui peut être vu histologiquement.
2. Fixation tissulaire
   1. Pliez un morceau de papier filtre en deux et étiquetez-le convenablement. Placez la peau en même temps que le papier absorbant dans le papier plié immédiatement adjacent au pli, en veillant à ce que l’échantillon soit lisse et non plié ou froissé. Sceller le papier filtre en agrafant les côtés ouverts, puis couper de sorte que le papier restant puisse être utilisé pour des échantillons futurs.
      Remarque: Cette étape est réalisée de sorte que la peau conserve sa forme pendant la fixation.
   2. Immerger complètement l’échantillon de tissu dans du formol tamponné neutre de 10% pendant 3 à 5 h à température ambiante ou pendant la nuit à 4 ° c.
   3. Après la fixation, retirez les échantillons du formol, lavez-les dans de l’eau désionisée (2x, 5 min chacun) et continuez à faire des blocs de tissu. Enlevez soigneusement tout résidu du tissu cutané (c.-à-d. le papier résiduel).
3. Fabrication de blocs de tissu congelés (figure 1)
   1. Coupez les bords de l’échantillon de peau afin qu’ils ne soient pas dentelés, puis faites 3 coupes sagittales. La largeur de ces bandes ne doit pas être supérieure à la hauteur du cryomold (5 mm). Ensuite, faites des coupes transversales pour avoir des morceaux de peau qui ne sont pas plus longs que la largeur du cryomold (20 mm) et peuvent être incorporés. Répéter avec la moitié restante de la peau dorsale, ou sauver le tissu pour d’autres usages (alternativement, économiser la moitié avant la fixation).
      Remarque: Il est important de garder les morceaux de peau dans l’orientation appropriée.
   2. Orienter le cryomold (25 x 20 x 5 mm³) en orientation portrait et placer 4 à 5 morceaux de peau sur le dessus de l’oct. Une fois que toutes les pièces sont en place, utilisez 2 paires de pinces fines pour amener le long bord de la peau au fond du cryomold. La peau doit maintenant être debout dans l’OCT perpendiculaire à la base du moule. Prenez soin de minimiser la formation de poches d’air dans l’OPO pendant cette étape (figure 1).
   3. Remplissez le moule avec le PTOM sur la deuxième lèvre et placez-le sur la surface plane de la glace carbonique. Utilisez des pinces pour ajuster les morceaux de peau qui ont pu se décaler pendant le transfert lorsque le bloc commence à geler. Une fois que la couche inférieure est solidifiée, la manipulation des tissus sera impossible.
   4. Coupez les diapositives 8-10 μM pour analyse.
4. Fabrication de blocs de tissu formol à paraffine fixe incorporé (FFPE)
   1. Placer 2 morceaux de peau fixe dans une cassette étiquetée et déshydrater dans les concentrations croissantes d’éthanol (75% d’éthanol pendant 30 min, 85% pendant 30 min, 90% pendant 30 min, 95% pendant 30 min, 100% pour 2x 30 min, xylène ou xylène substitut pour 2x 30 min). Incuber avec de la paraffine à 58-60 °, d’abord pendant 30 min, puis pendant la nuit.
   2. Incorporer le tissu dans un moule de tissu en acier inoxydable de 24 x 24 mm² avec de la paraffine liquide et solidifier à-5 ° c. L’orientation tissulaire doit être semblable à celle des blocs de tissu congelés de sorte que les sections longitudinales sur plusieurs follicules pileux peuvent être visualisées (figure 1).
   3. Une fois la paraffine solidifiée, retirer le moule et couper en sections de 5-10 μM pour analyse.

Résultats

Initiation du mélanome cutané induite par dépilation chimique

La procédure de dépilation chimique est représentée dans la figure 2. Lorsque les souris sont 7 semaines postnatales, leur peau dorsale est en télogène. Au cours de la télogène, les cellules souches du follicule pileux et les MCSCs sont connues pour être dans un état de repos. La peau ne doit pas montrer de c...

Discussion

Les altérations génétiques de marque fréquemment trouvées dans les tumeurs cutanées de mélanome ont été bien décrites¹³. La mutation de conducteur la plus dominante est BRAF^V600E, et un modèle de souris génétiquement modifié pour le mélanome de BRAF^V600Ea été généré par le groupe Bosenberg¹⁴ et déposé dans le laboratoire de Jackson. En utilisant ce modèle de souris, notre étude récente a démontré l’exigenc...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tamoxifen	Sigma	T5648-1G	For systemic injection
Tamoxifen	Cayman Chemical	13258	For systemic injection
Corn oil	Sigma	45-C8267-2.5L-EA
4OH-tamoxifen	Sigma	H7904-25MG	For topical treatment
26 G 1/2" needles	various		Veterinary grade
1 mL syringe	various		Veterinary grade
Pet hair trimmer	Wahl	09990-502
Hair removal cream	Nair	n/a	Available at most drug stores
Cotton swabs	various
Ultraviolet light bulb	UVP	95-0042-08	model XX-15M midrange UV lamp
200 proof ethanol	various		pure ethanol
Histoplast PE	Fisher Scientific	22900700	paraffin pellets
Neutral Buffered Formalin, 10%	Sigma	HT501128-4L
Clear-Rite 3	Thermo Scientific	6901	xylene substitute
O.C.T. Compound	Thermo	23730571
Tissue Cassette	Sakura	89199-430	for FFPE processing
Cryomolds	Sakura	4557	25 x 20 mm
FFPE metal mold	Leica	3803082	24 mm x 24 mm
Isoflurane	various		Veterinary grade
Anesthesia inhalation system	various		Veterinary grade
Fine scissor	FST	14085-09	Straight, sharp/sharp
Fine scissor	FST	14558-09	Straight, sharp/sharp
Metzenbaum	FST	14018-13	Straight, blunt/blunt
Forcep	FST	11252-00	Dumont #5
Forcep	FST	11018-12	Micro-Adson
Tyr-CreER; LSL-BrafV600E; Pten-f/f	Jackson Labs	13590
LSL-tdTomato	Jackson Labs	007914	ai14
Cre-1		n/a	GCATTACCGGTCGATGCAACGA GTGATGAG
Cre-2		n/a	GAGTGAACGAACCTGGTCGAA ATCAGTGCG
Braf-V600E-1		n/a	TGAGTATTTTTGTGGCAACTGC
Braf-V600E-2		n/a	CTCTGCTGGGAAAGCGGC
Kras-G12D-1		n/a	AGCTAGCCACCATGGCTTGAGT AAGTCTGCA
Kras-G12D-2		n/a	CCTTTACAAGCGCACGCAGACT GTAGA
Pten-1		n/a	ACTCAAGGCAGGGATGAGC
Pten-2		n/a	AATCTAGGGCCTCTTGTGCC
Pten-3		n/a	GCTTGATATCGAATTCCTGCAGC
tdTomato-1		n/a	AAGGGAGCTGCAGTGGAGTA
tdTomato-2		n/a	CCGAAAATCTGTGGGAAGTC
tdTomato-3		n/a	GGCATTAAAGCAGCGTATCC
tdTomato-4		n/a	CTGTTCCTGTACGGCATGG