突变黑色素细胞干细胞引发小鼠黑色素瘤的时空控制

摘要

下面的过程描述了一种方法, 空间和时间控制黑素细胞肿瘤开始在小鼠背皮肤, 使用基因工程小鼠模型。该协议描述宏观以及微观皮肤黑色素瘤的启动。

摘要

皮肤黑色素瘤是众所周知的最具攻击性的皮肤癌。虽然风险因素和主要基因改变继续被记录以越来越深的深度, 但近几十年来, 皮肤黑色素瘤的发病率迅速而持续地增加。为了找到有效的预防方法, 重要的是要了解黑色素瘤在皮肤中开始的早期步骤。先前的数据表明, 在成人皮肤组织中的滤泡黑素细胞干细胞 (Mcsc) 可以作为黑色素瘤细胞的起源, 当表达致癌突变和基因改变。当 Mcsc 从静止状态过渡到活动状态时, 可诱发黑色素瘤易发性 Mcsc 引起的肿瘤发生。这种易黑色素瘤的 Mcsc 的转变可以通过调节毛囊干细胞的活性状态或通过外源环境因素, 如紫外线-b (UV-B) 来促进。这些因素可以在实验室中通过化学脱毛进行人工操作, 从而导致毛囊干细胞和 Mcsc 从静止状态过渡到活动状态, 并通过使用台式光进行 UV-B 照射。这些方法为小鼠背侧皮肤皮肤黑色素瘤的开始提供了成功的空间和时间控制。因此, 这些体内模型系统将有助于确定皮肤黑色素瘤萌发的早期步骤, 并可用于测试肿瘤预防的潜在方法。

引言

黑色素瘤是黑色素瘤的恶性形式, 是皮肤中最具攻击性的癌症, 皮肤黑色素瘤占皮肤癌^{死亡的大多数}1。在美国, 黑色素瘤通常被诊断出来;据预测, 在2018年估计的新癌症病例中, 它将是第5^至第6^种最常见的癌症类型2。此外, 虽然近几十年来癌症的总体发病率呈逐渐下降的趋势, 但在过去几十年中, 皮肤黑色素瘤发病率显示,^{2 男女的}皮肤黑色素瘤发病率都在持续和迅速增加。

为了更有效地对抗皮肤黑色素瘤, 重要的是要清楚地了解黑色素瘤发展的早期事件, 从他们的起源细胞, 以更好地确定临床上有效的预防方法。现在人们知道, 在包括皮肤组织 3^、4、5在内的许多不同类型的器官中, 成人干细胞作为癌症的细胞起源^,可以显著促进肿瘤的形成。同样, 在小鼠背皮的成人黑细胞干细胞 (Mcsc) 可以作为黑色素瘤细胞的起源时, 异常激活拉斯拉夫和阿克特途径⁶。然而, 仅这些致癌突变并不能有效地诱导静止的 Mcsc 形成肿瘤, 当 Mcsc 在自然头发循环过程中变得活跃时, 黑色素瘤最终会发展起来。然而, 在这个协议中, 我们将描述的方法, 人为地诱导细胞激活易发生肿瘤的 mcsc, 从而促进黑色素瘤的启动^精确控制 6^,7。

通过这里描述的方法, 空间和时间控制的皮肤黑色素瘤开始从肿瘤易发的 Mcsc表达致癌 Braf^{V600e 连同} pten表达的损失, 可以成功地执行, 因为我们此前曾有报道。这种方法结合了先前的研究结果, 表明毛囊干细胞通过脱毛激活, 以及如何小鼠皮肤暴露于 UV-B 可以促进激活 Mcsc 居民的毛囊和这个细胞的移位亚群到卵泡间表皮 6^,8,9,10。这些体内模型系统可以提供有关生理和环境变化如何改变易患黑色素瘤的 Mcsc 的细胞状态的宝贵信息, 进而导致皮肤中黑色素瘤的显著启动。

研究方案

所有动物手术都是根据康奈尔大学动物护理和使用机构委员会 (IACUC) 进行的。

1. 准备工作

1. 收集12天产后小鼠的尾夹, 在95°c 下在0.05Naoh 的400Μl 中消化 1 h. 涡流, 并加入32μl 的 1 m Rris-hcl, pH 值7。根据杰克逊实验室提供的 PCR 协议, 对有兴趣基因型的小鼠进行基因型鉴定⁶。
   - Tyrer-半形 (+/creer)
   - Lsl-braf^V600e– 杂合 (+/lsl-v600e)
   - Ptit-纯合浮式浮子 (flox/flox)
   - Lsl-tdtocomato–mavisygs (+/LSL-tdTomato)
   请注意:材料表中提供了底漆序列。
2. 在下面描述的所有实验前 2至3天, 以及当老鼠大约7周大的时候, 使用剪发器 (电动修剪器) 来剃光背皮。注意不要使用电修剪器伤害瘦老鼠的皮肤, 因为任何伤害都可能引起伤口愈合反应, 从而激活毛囊干细胞, 包括 Mcsc。
3. 确定头发周期是否在端粒, 以及皮肤是否在等待期间受伤。如果皮肤显示有任何受伤的迹象, 则不应将鼠标用于这些程序。
   请注意:虽然不同遗传背景的头发周期可能略有不同, 但在这个年龄, 背侧皮肤的头发周期通常处于端粒状态^{1 1}。Tyr-creer转基因基因将以端粒皮肤中的 Mcsc 为目标, 随后的基因改变将在 MCSC 的所有血统中永久表达, 包括分化的黑素细胞和黑色素瘤。

2. 他莫西芬治疗乳状细胞基因重组

1. 腹腔注射 (IP) 或局部给药进行全身或局部遗传重组的他莫西芬的制备
   请注意:为了使他莫西芬诱导重组, 它必须首先由肝脏代谢为 4-羟基他莫西芬 (4-OHT), 它可以结合和激活Creer。他莫西芬的局部应用不会以这种方式代谢, 4-OHT 必须直接使用。只有一种方法, 他莫西芬交付是足够的重组。
   1. 他莫西芬: 在溶解在玉米油中的浓度为10毫克 Ml-1^的情况下制备他莫西芬。为了帮助药物溶解到溶液中, 将100% 分子级乙醇的总体积以粉末的形式添加到药物中, 涡液 3分钟, 然后加入剩余的玉米油体积。继续涡旋, 直到晶体物质不再在溶液中显现出来。通过0.2μm 过滤器可以对他莫西芬溶液进行灭菌。继续执行步骤2.2.1 进行处理。
   2. 4-OHT: 在100% 乙醇中制备高达3毫克 Ml-1^的羟基他莫西芬库存溶液。然后, 工作解决方案可以根据需要尽可能多地应用于感兴趣的皮肤区域 (通常是单个应用程序)。
      请注意:羟基他莫西芬的库存溶液可以溶解在100% 乙醇中, 最终浓度为 5 mM。然后, 为制备工作溶液, 可以将5μl 的4OH-tamoxifen 库存溶液稀释为15Μl 的100% 乙醇。对于4毫米²区域, 可局部应用1至3μl 的工作溶液。
2. 用他莫西芬系统或局部地治疗小鼠
   1. 对于全身治疗, 使用 26 g 针, 每天通过 IP 注射服用2毫克他莫西芬, 每次3天。
      请注意:使用该模型, 约93% ±4% 的静止 Mcsc 标记为 tdTomato.
   2. 对于区域激活, 用4-OHT 进行局部治疗。用工作解决方案覆盖感兴趣的皮肤区域。工作解决方案的数量可以根据2.1.2 步骤中所述的感兴趣区域的大小来确定。
3. 在最后剂量他莫西芬后 48小时, 进行化学脱毛诱导肿瘤启动的步骤3或 UV-B 诱导肿瘤的启动步骤4

3. 化学降解

1. 为装有异氟醚系统的老鼠处理室配备以下所需材料: 脱毛膏、棉布、纸布和水。
2. 将小鼠放入诱导室, 用3.5% 至4.5% 的异氟醚和 1 lmmin 氧气麻醉。
3. 一旦呼吸速率稳定, 确认小鼠处于适当的麻醉平面, 方法是执行脚趾捏, 并将小鼠转移到主管, 用1至1.5% 的异氟醚和 1 L/min 氧气维持麻醉。使用眼药膏, 以防止眼睛干燥, 而在麻醉。
4. 使用棉签, 将一层薄薄的脱毛霜涂在老鼠皮肤的剃须区域。
5. 一旦奶油均匀地应用, 使用干净的棉签开始去除。乳霜与皮肤接触的总时间不应超过1分钟。
6. 用湿纸轻轻擦拭皮肤, 并确保任何残留的奶油已被去除。
   请注意:脱毛霜如果不完全去除, 会对皮肤造成刺激。有些老鼠, 如那些在 c57bl6 背景下, 可能容易发展性皮炎¹²。虽然罕见, 一些动物会在24小时内发展皮炎后, 脱毛膏的应用或机械脱毛。一定要在治疗后的第二天检查老鼠, 寻找任何局部皮肤刺激的迹象。
7. 将已取出的发轴和任何使用的材料丢弃到生物危害箱中。
8. 将鼠标放入一个空的、干净的老鼠笼子中, 直到麻醉消失。
9. 把老鼠送回笼子里。

4. UV-B 辐照

1. 为装有异氟醚系统的老鼠处理室配备以下所需材料: UV-B 光系统、UV-B 光表、鼠标保护层、供研究人员使用的额外 UV-B 防护能和计时器。
2. 小鼠应按感兴趣的 UV-B 剂量 (即 0-180 mjcm 2) 照射.使用 UV-B 光表来确定照射小鼠的适当时间长度。
   注: mwcm² x 时间 = 剂量
3. 用异氟烷对鼠标进行麻醉。在诱导室时, 使用 3.5% 至4.5% 的异氟醚和 1 lmmin 氧气。
4. 一旦小鼠稳定, 用脚趾捏确认麻醉效果, 并将鼠标转移到位于 UV 室的主麻醉管。使用眼药膏, 以防止眼睛干燥, 而在麻醉。用1至1.5% 异氟醚和 1 L/min 氧气保持麻醉。
5. 用 UV-B 防护材料覆盖背侧皮肤, 以便只暴露所需的区域。
   请注意:目前, 应利用适当的个人防护设备。照射鼠标所需的时间长度取决于所使用的灯泡的强度, 但如果所需时间超过 30秒, 可能需要对麻醉进行监测。
6. 使用抗紫外线盖或任何其他合适的材料覆盖 UV 室。
7. 打开 UV-B 灯, 在研究人员为特定目的确定的时间内照射鼠标。
8. 关闭紫外线系统和异氟烷, 然后将鼠标放在一个空的老鼠笼子, 直到麻醉磨损。
9. 把老鼠送回笼子里。

5. 组织加工

1. 皮肤隔离
   1. 在开始之前获得以下信息: 尸检仪器、滤纸和纸巾.
   2. 根据 IACUC 批准的协议对小鼠进行安乐死, 并在手术前确认死亡。
   3. 使用剪发器, 刮掉背部皮肤区域的任何头发。用无绒毛组织轻轻刷该区域, 以清除该区域。
   4. 用锋利的剪刀在尾巴底部上方做一个小切口。
   5. 将大的钝剪刀插入切口, 并分离真皮下结缔组织。
   6. 用锋利的剪刀沿着组织边缘切割, 仔细隔离感兴趣的皮肤区域。
   7. 将皮肤组织放在干净的纸巾上, 用沉闷的钳子伸展皮肤, 使其粘附在毛巾上并接受教育。此步骤用于为组织提供额外的支持, 以便在保持其形状的同时对其进行操作和处理。
      请注意:要小心只处理皮肤组织的外部区域, 因为钳子可能会对皮肤造成损伤, 从组织学上可以看到。
2. 组织固定
   1. 将一张滤纸折成两半, 并适当贴标签。将皮肤与纸巾一起放在紧邻折痕的折叠纸上, 确保样品光滑, 不折叠或皱皱。通过将开口侧钉上, 然后修剪过滤纸, 使剩余的纸张可用于未来的样品。
      请注意:执行此步骤是为了使皮肤在固定过程中保持其形状。
   2. 在室温下或4°c 下, 将组织样品完全浸入10% 中性缓冲福尔沙林 3 ~ 5小时。
   3. 固定后, 从福尔拉林取出样本, 用去离子水清洗 (每片 2x, 5分钟), 然后进行组织块。小心地去除皮肤组织中的任何残留材料 (即残留纸张)。
3. 制作冷冻组织块 (图 1)
   1. 修剪皮肤样品的边缘, 使其不锯齿状, 然后作出3矢状削减。这些条带的宽度不应超过冰片的高度 (5 毫米)。接下来, 横向切割的皮肤片断不超过冷冻机的宽度 (20 毫米), 可以嵌入。重复与背部皮肤的剩余一半, 或保存组织的其他用途 (交替, 保存一半之前固定)。
      请注意:保持皮肤碎片在适当的方向是很重要的。
   2. 将低温器 (25 x 20 x 5 毫米³) 定向至纵向, 并在 oct 顶部放置4至5块皮肤。一旦所有的件都到位, 使用2对细钳, 把皮肤的长边缘到冷冻机的底部。皮肤现在应该站在 OCT 垂直于模具的底部。在此步骤中, 请注意最大限度地减少 OCT 内气囊的形成 (图 1)。
   3. 用 OCT 将模具灌满第二唇, 放在干冰的平面上。使用钳子来调整任何皮肤碎片, 可能已经转移在转移过程中, 块开始冻结。一旦底层凝固, 组织的操作将是不可能的。
   4. 切割8-10μm 幻灯片进行分析。
4. 福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE) 组织块的制作
   1. 将2块固定皮肤放入标记盒式磁带中, 并在乙醇浓度不断增加的情况下脱水 (75% 乙醇 30分钟, 85% 30分钟, 90% 30分钟, 95% 30分钟, 100% 为2x30 分钟, 二甲苯或二甲苯替代品 2x 30分钟)。在58-60°与石蜡一起孵化, 先持续 30分钟, 然后隔夜。
   2. 将组织嵌入一个 24 x^{24 mm 2}不锈钢组织模具中, 用液体石蜡, 并在-5°c 时固化。组织方向应与冷冻组织块相似, 以便可以直观地显示多个毛囊的纵向部分 (图 1)。
   3. 石蜡凝固后, 取出模具, 切割成5-10μm 的部分进行分析。

结果

化学脱毛引起的皮肤黑色素瘤

化学脱毛的过程如图 2所示。当老鼠出生后7周时, 它们的背侧皮肤就会出现端粒。在端粒期间, 毛囊干细胞和 Mcsc 已知处于静止、静止状态。剃须后, 皮肤不应显示出明显的头发生长。另一方面, 化学脱毛可以诱导毛囊干细胞激活, 进而显示出感兴趣区域的显著头?...

讨论

在皮肤黑色素瘤肿瘤中经常发现的 hallmark 基因改变已经被很好地描述了¹³。最主要的驱动突变是Braf^V600e,和基因工程小鼠模型的 braf v600e 介导黑色素瘤是由博森伯格组14产生, 并沉积在杰克逊实验室. 利用这个小鼠模型, 我们最近的研究证明了细胞激活的要求, 肿瘤易发的 Mcsc 显著启动braf V600e介导的黑色素瘤在背皮肤

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tamoxifen	Sigma	T5648-1G	For systemic injection
Tamoxifen	Cayman Chemical	13258	For systemic injection
Corn oil	Sigma	45-C8267-2.5L-EA
4OH-tamoxifen	Sigma	H7904-25MG	For topical treatment
26g 1/2" needles	various		Veterinary grade
1 mL syringe	various		Veterinary grade
Pet hair trimmer	Wahl	09990-502
Hair removal cream	Nair	n/a	Available at most drug stores
Cotton swabs	various
Ultraviolet light bulb	UVP	95-0042-08	model XX-15M midrange UV lamp
200 proof ethanol	various		pure ethanol
Histoplast PE	Fisher Scientific	22900700	paraffin pellets
Neutral Buffered Formalin, 10%	Sigma	HT501128-4L
Clear-Rite 3	Thermo Scientific	6901	xylene substitute
O.C.T. Compound	Thermo	23730571
Tissue Cassette	Sakura	89199-430	for FFPE processing
Cryomolds	Sakura	4557	25 x 20 mm
FFPE metal mold	Leica	3803082	24 x 24 mm
Isoflurane	various		Veterinary grade
Anesthesia inhalation system	various		Veterinary grade
Fine scissor	FST	14085-09	Straight, sharp/sharp
Fine scissor	FST	14558-09	Straight, sharp/sharp
Metzenbaum	FST	14018-13	Straight, blunt/blunt
Forcep	FST	11252-00	Dumont #5
Forcep	FST	11018-12	Micro-Adson
Tyr-CreER; LSL-BrafV600E; Pten-f/f	Jackson Labs	13590
LSL-tdTomato	Jackson Labs	007914	ai14
Cre-1		n/a	GCATTACCGGTCGATGCAACGAGTGATGAG
Cre-2		n/a	GAGTGAACGAACCTGGTCGAAATCAGTGCG
Braf-V600E-1		n/a	TGAGTATTTTTGTGGCAACTGC
Braf-V600E-2		n/a	CTCTGCTGGGAAAGCGGC
Kras-G12D-1		n/a	AGCTAGCCACCATGGCTTGAGTAAGTCTGCA
Kras-G12D-2		n/a	CCTTTACAAGCGCACGCAGACTGTAGA
Pten-1		n/a	ACTCAAGGCAGGGATGAGC
Pten-2		n/a	AATCTAGGGCCTCTTGTGCC
Pten-3		n/a	GCTTGATATCGAATTCCTGCAGC
tdTomato-1		n/a	AAGGGAGCTGCAGTGGAGTA
tdTomato-2		n/a	CCGAAAATCTGTGGGAAGTC
tdTomato-3		n/a	GGCATTAAAGCAGCGTATCC
tdTomato-4		n/a	CTGTTCCTGTACGGCATGG