Controle espacial e temporal da iniciação de melanoma murino de células-tronco de melanócitos mutantes

Resumo

O procedimento a seguir descreve um método para o controle espacial e temporal da iniciação do tumor melanocítico na pele dorsal murina, utilizando um modelo de camundongo geneticamente projetado. Este protocolo descreve macroscópica assim como a iniciação Cutaneous microscópica da melanoma.

Resumo

O melanoma cutâneo é bem conhecido como o câncer de pele mais agressivo. Embora os factores de risco e as alterações genéticas principais continuem a ser documentados com profundidade crescente, a taxa de incidência do melanoma Cutaneous mostrou um aumento rápido e contínuo durante décadas recentes. A fim encontrar métodos preventivos eficazes, é importante compreender as etapas adiantadas da iniciação da melanoma na pele. Os dados precedentes demonstraram que as pilhas de haste foliculares do melanócito (mcscs) nos tecidos adultos da pele podem actuar como pilhas da melanoma da origem ao expressar mutações oncogênico e alterações genéticas. O tumorigenesis que levanta-se de MCSCs melanoma-prone pode ser induzido quando MCSCs transição de um quiescente ao estado ativo. Essa transição em MCSCs propenso a melanoma pode ser promovida pela modulação do estado de atividade das células-tronco do folículo piloso ou por meio de fatores ambientais extríncicos, como ultravioleta-B (UV-B). Estes fatores podem ser manipulados artificialmente no laboratório pela depilação química, que causa a transição de pilhas de haste do folículo de cabelo e de mcscs de um quiescente ao estado ativo, e pela exposição de UV-B usando uma luz do de bancada. Estes métodos fornecem o controle espacial e temporal bem sucedido da iniciação Cutaneous da melanoma na pele dorsal murino. Conseqüentemente, estes sistemas in vivo do modelo serão valiosos para definir as etapas adiantadas da iniciação cutaneous do melanoma e poderiam ser usados para testar métodos potenciais para a prevenção do tumor.

Introdução

O melanoma, a forma maligna dos tumores melanocíticos, é o câncer mais agressivo na pele com melanoma cutâneo responsável pela maioria das mortes por câncer de pele¹. Nos Estados Unidos, o melanoma é comumente diagnosticado; prevê-se que seja o 5^º a 6^º tipo de cancro mais comum entre os novos casos de cancro estimados em 2018². Além disso, embora as incidências globais de câncer tenham demonstrado a tendência de redução gradual nas últimas décadas, as taxas de incidência de melanoma cutâneo nas últimas décadas demonstram um aumento contínuo e rápido em ambos os sexos².

Para combater o melanoma cutâneo de forma mais eficiente, é importante entender claramente os primeiros acontecimentos do desenvolvimento de melanoma de suas células de origem para melhor identificar métodos preventivos clinicamente efetivos. É sabido agora que as pilhas de haste adultas podem significativamente contribuir à formação do tumor como as origens celulares dos cancros em muitos tipos diferentes de órgãos que incluem os tecidos da pele^3,4,5. Similarmente, as pilhas de haste adultas do melanócito (mcscs) na pele dorsal murino podem trabalhar como pilhas da melanoma da origem em cima da ativação aberrante das vias Ras/Raf e de Akt ⁶. Entretanto, estas mutações oncogênico sozinho não são capazes de induzir eficientemente a formação do tumor dos mcscs quiescentes. os tumores melanocíticos eventualmente desenvolvem-se quando mcscs se torna ativo durante a ciclagem natural do cabelo. No entanto, neste protocolo, descreveremos métodos para induzir artificialmente a ativação celular de mcscs propenso a tumores, facilitando assim o controle preciso do início do melanoma^6,7.

Através dos métodos descritos aqui, o controle espacial e temporal da iniciação cutânea do melanoma de mcscs tumor-propenso expressando BRAF^V600E oncogênico junto com a perda de expressão de PTEN pode com sucesso ser executado, porque nós relataram anteriormente⁶. Este método incorpora os resultados precedentes que demonstram a ativação da pilha de haste do folículo de cabelo com a depilação assim como como a exposição da pele murino a UV-B pode facilitar a ativação do residente de mcscs ao folículo de cabelo e ao translocação deste celular subpopulação à epiderme interfolicular^6,8,9,10. Estes sistemas in vivo do modelo podem fornecer a informação valiosa a respeito de como as mudanças fisiológicas e ambientais podem alterar o status celular de MCSCs melanoma-prone, que por sua vez podem induzir a iniciação significativa do melanoma na pele.

Protocolo

Todos os procedimentos animais são realizados de acordo com o Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade Cornell (IACUC).

1. preparação

1. Colete clipes de cauda de 12 dias de camundongos pós-natal e digerir em 400 μL de 0, 5 N NaOH a 95 ° c por 1 h. Vortex e adicionar 32 μL de 1 M de Tris-HCl, pH 7. Camundongos genótipos de acordo com protocolos de PCR fornecidos pelo laboratório Jackson e identificam camundongos com genótipo de interesse⁶.
   - Tyr-CreER -hemizygous (+/creer)
   - LSL-BRAF^V600E – heterozygous (+/LSL-v600e)
   - PTEN – Flox homozygous (Flox/Flox)
   - LSL-tdtomato – hemizygous (+/LSL-tdtomato)
   Nota: As sequências de primer são fornecidas na tabela de materiais.
2. Use uma tosquiadeira de cabelo (ajustador elétrico) para raspar a pele dorsal 2 a 3 dias antes de todas as experiências descritas abaixo, e quando os ratos são aproximadamente 7 semanas da idade. Tome cuidado para não danificar a pele fina do mouse usando o aparador elétrico como qualquer lesão pode provocar uma resposta de cicatrização de feridas que ativará as células-tronco do folículo piloso, incluindo MCSCs.
3. Determine se o ciclo capilar está em telógeno e se a pele está ferida durante o período de espera. Se a pele mostra algum sinal de ferimento, o rato não deve ser usado para estes procedimentos.
   Nota: Embora o ciclo do cabelo possa diferir ligeiramente entre origens genéticas, nesta idade o ciclo do cabelo na pele dorsal é geralmente no estado do telógena¹¹. O transgene de Tyr-creer visará mcscs na pele do telógena, e as alterações genéticas subseqüentes serão expressas permanentemente em todas as linhagens do MCSC, incluindo melanócitos diferenciados e tumores melanocíticos.

2. tratamento de tamoxifen para recombination genético CRE-LOX

1. Preparação de tamoxifeno para injeção intraperitoneal (IP) ou administração tópica para Recombinação genética sistêmica ou localizada
   Nota: Em ordem para tamoxifeno para induzir recombinação, ele deve primeiro ser metabolizado pelo fígado para 4-hidroxitamoxifeno (4-OHT), que pode ligar e ativar o creer. A aplicação tópica de tamoxifeno não será metabolizada desta forma e 4-OHT deve ser usado diretamente. Somente um método de tamoxifeno a entrega é exigido para o suficiente recombination.
   1. Tamoxifeno: Prepare tamoxifeno em uma concentração de 10 mg mL^-1 dissolvido em óleo de milho. Para ajudar na dissolução da droga em solução, adicionar até 10% volume total de 100% etanol de grau molecular para a droga em forma de pó, vortex por 3 min e, em seguida, adicione o volume remanescente de óleo de milho. Continue a vórtice até que o material cristalino não seja mais aparente na solução. A solução de tamoxifen pode ser esterilizada passando através de um filtro de 0,2 μm. Prossiga para o passo 2.2.1 para o tratamento.
   2. 4-OHT: Prepare uma solução de estoque de hidroxitamoxifeno até 3 mg mL^-1 em 100% de etanol. Em seguida, uma solução de trabalho pode ser aplicada tanto quanto necessário para cobrir a área da pele de interesse (geralmente uma única aplicação).
      Nota: Uma solução de estoque de hidroxitamoxifeno pode ser dissolvida em etanol a 100% para uma concentração final de 5 mM. Em seguida, para preparar uma solução de trabalho, 5 μL de solução de estoque de 4OH-tamoxifen podem ser diluídos em 15 μL de etanol a 100%. Para 4 mm² área, 1 a 3 μL de solução de trabalho pode ser aplicada topicamente.
2. Tratamento de camundongos com tamoxifeno, seja sistemicamente ou topicamente
   1. Para tratamento sistémico, administrar 2 mg de tamoxifeno via injeção de IP uma vez por dia durante 3 dias utilizando uma agulha de 26 G.
      Nota: Usando este modelo, aproximadamente 93% ± 4% de MCSCs quiescente são etiquetados com tdTomato⁶.
   2. Para a ativação regional, realize um tratamento tópico com 4 OHT. Cubra a área da pele de interesse com a solução de trabalho. A quantidade de solução de trabalho pode ser determinada pelo tamanho da região de interesse, conforme descrito na etapa 2.1.2.
3. Em 48 h depois da última dose de tamoxifeno, avance para o passo 3 para a depilação química induzida por iniciação tumoral ou para a etapa 4 para a iniciação do tumor induzido por UV-B

3. depilação química

1. Equipar uma sala de tratamento do rato contendo um sistema de isoflurano com os seguintes materiais necessários: creme de depilação, cotonetes, pano de papel e água.
2. Coloque o rato na câmara de indução e anestesiar com 3,5 a 4,5% de isoflurano e 1 L/min de oxigénio.
3. Uma vez que a taxa respiratória estabilizou, confirme que o rato está no plano apropriado da anestesia realizando uma pitada do dedo do pé e transfira o rato ao tubo principal que mantém a anestesia com 1 a 1,5% isoflurano e 1 L/oxigênio mínimo. Aplique a pomada do olho para manter os olhos da secagem quando a anestesia.
4. Use um cotonete de algodão para aplicar uma fina camada de creme de depilação para a região raspada da pele do mouse.
5. Uma vez que o creme foi aplicado uniformemente, use cotonetes limpos do algodão para começar a remoção. O tempo total que o creme está em contacto com a pele não deve exceder 1 min.
6. Limpe delicadamente a pele com um pano de papel úmido e assegure-se de que todo o creme residual esteja removido.
   Nota: O creme da remoção do cabelo pode causar a irritação à pele se não é removido completamente. Alguns camundongos, como aqueles em um fundo C57BL/6, podem ser propensos a desenvolver dermatite¹². Embora rara, alguns animais desenvolverão a dermatite dentro de 24 h após a aplicação do creme da remoção do cabelo ou a depilação mecânica. Certifique-se de verificar os ratos no dia após o tratamento para procurar quaisquer sinais de irritação cutânea regional.
7. Descarte os eixos de cabelo removidos e quaisquer materiais usados em um escaninho de risco biológico.
8. Coloque o mouse em uma gaiola de rato vazia e limpa até que a anestesia tenha desgastado.
9. Devolva os ratos para suas gaiolas.

4. irradiação UV-B

1. Equipar uma sala de tratamento de mouse contendo um sistema de isoflurano com os seguintes materiais necessários: sistema de luz UV-B, medidor de luz UV-B, cobertura protetora para o mouse, EPI de proteção UV-B adicional para pesquisador e temporizador.
2. Os camundongos devem ser irradiados na dose de interesse UV-B (i.e., 0-180 mJ/cm²). Use o medidor de luz UV-B para determinar o período de tempo apropriado para irradiar os camundongos.
   Nota: mW/cm² x tempo = dose
3. Anestesie o rato com isoflurano. Enquanto na câmara de indução, use 3,5 a 4,5% isoflurano e 1 L/min de oxigênio.
4. Uma vez que o rato é estabilizado, confirme efeitos da anestesia com uma pitada do dedo do pé e transfira o rato ao tubo principal da anestesia situado na câmara UV. Aplique a pomada do olho para impedir os olhos da secagem quando a anestesia. Manter a anestesia com 1 a 1,5% de isoflurano e 1 L/min de oxigénio.
5. Cubra a pele dorsal com material protetor UV-B para que apenas a região desejada será exposta.
   Nota: Neste momento, devem ser utilizados EPI apropriados. O tempo necessário para irradiar o mouse depende da intensidade da lâmpada usada, mas a anestesia pode precisar ser monitorada se o tempo necessário exceder 30 s.
6. Cubra a câmara UV usando a tampa UV-resistente ou todos os outros materiais apropriados.
7. Ligar a lâmpada UV-B e irradiar o mouse para o tempo determinado pelos pesquisadores para o objetivo específico.
8. Desligue o sistema UV e isoflurano, em seguida, coloque o mouse para uma gaiola de rato vazio até que a anestesia tenha desgastado.
9. Devolva os ratos para suas gaiolas.

5. processamento de tecidos

1. Isolamento da pele
   1. Obter o seguinte antes de começar: instrumentos de necropsia, papel de filtro e toalhas de papel.
   2. Eutanizar os camundongos de acordo com IACUC protocolos aprovados, e confirmar a morte antes de prosseguir.
   3. Usando uma tosquiadeira de cabelo, raspar todo o cabelo da área dorsal da pele. Escove levemente a área com um tecido sem fiapos para limpar a área.
   4. Faça uma pequena incisão com tesouras afiadas logo acima da base da cauda.
   5. Insira grandes tesouras sem corte na incisão e separe os tecidos conectivos subdérmicos.
   6. Cuidadosamente isolar a região da pele de interesse por corte com tesouras afiadas ao longo da borda do tecido.
   7. Coloc o tecido da pele em uma toalha de papel limpa e use o fórceps maçante para esticar a pele de modo que adere à toalha e seja ensinado. Esta etapa serve para fornecer o apoio adicional para o tecido de modo que possa ser manipulado e processado ao manter sua forma.
      Nota: Tenha cuidado para lidar apenas com as regiões externas do tecido da pele, como o fórceps pode causar danos à pele que pode ser visto histologicamente.
2. Fixação do tecido
   1. Dobre um pedaço de papel de filtro ao meio e rotule apropriadamente. Coloc a pele junto com o revestimento protetor de papel da toalha no papel dobrado imediatamente adjacente ao vinco, assegurando-se de que a amostra seja Lisa e não dobrada ou amassado. Sele o papel de filtro grampeando os lados abertos, e então apare de modo que o papel restante possa ser usado para amostras futuras.
      Nota: Esta etapa é executada de modo que a pele conserve sua forma durante a fixação.
   2. Submergir inteiramente a amostra do tecido no formalina tamponado neutro de 10% para 3 a 5 h na temperatura ambiente ou durante a noite em 4 ° c.
   3. Após a fixação, retire as amostras de formalina, lave em água deionizada (2x, 5 min cada) e proceder para fazer blocos de tecido. Retire cuidadosamente qualquer material residual do tecido da pele (ou seja, papel residual).
3. Fazer blocos de tecido congelado (Figura 1)
   1. Aparar as bordas da amostra de pele para que eles não são irregulares e, em seguida, fazer 3 cortes sagital. A largura destas tiras não deve ser mais do que a altura do cryomold (5 milímetros). Em seguida, faça cortes transversais para ter pedaços de pele que não são mais longos do que a largura do crio-mofo (20 mm) e pode ser incorporado. Repita com a metade restante da pele dorsal, ou excepto o tecido para outros usos (alternadamente, excepto a metade antes da fixação).
      Nota: É importante manter as peças da pele na orientação adequada.
   2. Oriente a crimolina (25 x 20 x 5 mm³) em uma orientação Retrato e coloque 4 a 5 pedaços de pele em cima da OCT. Uma vez que todas as peças estão no lugar, use 2 pares de fórceps fino para trazer a borda longa da pele para a parte inferior do cryomold. A pele deve agora estar em pé na OCT perpendicular à base do molde. Tome cuidado para minimizar a formação de bolsas de ar dentro da OCT durante esta etapa (Figura 1).
   3. Encha o molde com OCT para o segundo lábio, e coloque na superfície plana de gelo seco. Use fórceps para ajustar todas as partes da pele que podem ter deslocado durante a transferência como o bloco começa a congelar. Uma vez que a camada inferior é solidificada, a manipulação dos tecidos será impossível.
   4. Corte 8-10 μm slides para análise.
4. Fazendo formalin fixo parafina incorporado (FFPE) blocos de tecido
   1. Coloque 2 pedaços de pele fixa em uma gaveta rotulada e desidrata-se em concentrações crescentes de etanol (75% etanol por 30 min, 85% por 30 min, 90% por 30 min, 95% por 30 min, 100% para 2x 30 min, xileno ou xileno substituto para 2x 30 min). Incubar com parafina a 58-60 °, primeiro por 30 min, e depois durante a noite.
   2. Incorpore o tecido em um molde do tecido do aço inoxidável de 24 x 24 milímetros² com parafina líquida e solidificar em-5 ° c. A orientação tecidual deve ser semelhante à dos blocos de tecido congelado para que as secções longitudinais em vários folículos pilosos possam ser visualizadas (Figura 1).
   3. Uma vez que a parafina solidified, retire o molde e corte em seções de 5-10 μm para a análise.

Resultados

Iniciação cutânea por melanoma induzida por depilação química

O procedimento de depilação química é representado na Figura 2. Quando os camundongos são 7 semanas pós-natal, sua pele dorsal está em telógeno. Durante o telogen, as pilhas de haste do folículo de cabelo e os MCSCs são sabidos para estar em um estado quiescente, descansando. A pele não deve mostrar nenhu...

Discussão

As alterações genéticas do Hallmark freqüentemente encontradas em tumores Cutaneous da melanoma foram descritas bem¹³. A mutação de condutor mais dominante é o BRAF^V600E, e um modelo de rato geneticamente concebido para o melanoma mediado por BRAF^V600Efoi gerado pelo grupo Bosenberg¹⁴ e depositado no laboratório Jackson. Usando este modelo do rato, nosso estudo recente demonstrou a exigência da ativação celular de MCSCs tum...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tamoxifen	Sigma	T5648-1G	For systemic injection
Tamoxifen	Cayman Chemical	13258	For systemic injection
Corn oil	Sigma	45-C8267-2.5L-EA
4OH-tamoxifen	Sigma	H7904-25MG	For topical treatment
26g 1/2" needles	various		Veterinary grade
1 mL syringe	various		Veterinary grade
Pet hair trimmer	Wahl	09990-502
Hair removal cream	Nair	n/a	Available at most drug stores
Cotton swabs	various
Ultraviolet light bulb	UVP	95-0042-08	model XX-15M midrange UV lamp
200 proof ethanol	various		pure ethanol
Histoplast PE	Fisher Scientific	22900700	paraffin pellets
Neutral Buffered Formalin, 10%	Sigma	HT501128-4L
Clear-Rite 3	Thermo Scientific	6901	xylene substitute
O.C.T. Compound	Thermo	23730571
Tissue Cassette	Sakura	89199-430	for FFPE processing
Cryomolds	Sakura	4557	25 x 20 mm
FFPE metal mold	Leica	3803082	24 x 24 mm
Isoflurane	various		Veterinary grade
Anesthesia inhalation system	various		Veterinary grade
Fine scissor	FST	14085-09	Straight, sharp/sharp
Fine scissor	FST	14558-09	Straight, sharp/sharp
Metzenbaum	FST	14018-13	Straight, blunt/blunt
Forcep	FST	11252-00	Dumont #5
Forcep	FST	11018-12	Micro-Adson
Tyr-CreER; LSL-BrafV600E; Pten-f/f	Jackson Labs	13590
LSL-tdTomato	Jackson Labs	007914	ai14
Cre-1		n/a	GCATTACCGGTCGATGCAACGAGTGATGAG
Cre-2		n/a	GAGTGAACGAACCTGGTCGAAATCAGTGCG
Braf-V600E-1		n/a	TGAGTATTTTTGTGGCAACTGC
Braf-V600E-2		n/a	CTCTGCTGGGAAAGCGGC
Kras-G12D-1		n/a	AGCTAGCCACCATGGCTTGAGTAAGTCTGCA
Kras-G12D-2		n/a	CCTTTACAAGCGCACGCAGACTGTAGA
Pten-1		n/a	ACTCAAGGCAGGGATGAGC
Pten-2		n/a	AATCTAGGGCCTCTTGTGCC
Pten-3		n/a	GCTTGATATCGAATTCCTGCAGC
tdTomato-1		n/a	AAGGGAGCTGCAGTGGAGTA
tdTomato-2		n/a	CCGAAAATCTGTGGGAAGTC
tdTomato-3		n/a	GGCATTAAAGCAGCGTATCC
tdTomato-4		n/a	CTGTTCCTGTACGGCATGG