Mutant melanosit kök hücrelerinden Murine Melanoma başlangıcı uzamsal ve temporal kontrol

Özet

Aşağıdaki prosedür, genetik olarak tasarlanan bir fare modelini kullanarak, murine dorsal deride melansitik tümör başlamasını uzamsal ve temporal kontrol etmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu protokol makroskopik ve mikroskopik kutanöz Melanom inisiyasyonu açıklanmaktadır.

Özet

Kutanöz Melanom en agresif cilt kanseri olarak bilinir. Risk faktörleri ve büyük genetik değişiklikler artan derinlik ile belgelenmeye devam etse de, kutanöz Melanom insidansı oranı son yıllarda hızlı ve sürekli bir artış göstermiştir. Etkili önleyici yöntemler bulmak için, Deride Melanom başlaması erken adımlarını anlamak önemlidir. Önceki veriler, Yetişkin deri dokularında foliküler melanosit kök hücrelerinin (MCSCs) Onkojenik mutasyonlar ve Genetik değişikliklerin ifade edildiğinde Orijin Melanom hücreleri olarak hareket edebilecektir göstermiştir. Meloma eğilimli MCSCs 'den kaynaklanan tumorigenesis, MCSCs 'nin sessiz bir şekilde aktif duruma geçişinde indüklenir. Melanoma eğilimli MCSCs bu geçiş ya saç folikül kök hücrelerinin modülasyon tarafından teşvik edilebilir ' aktivite devlet veya ultraviyole-b (UV-b) gibi ekstrensek çevresel faktörler aracılığıyla. Bu faktörler suni kimyasal epilasyon ile laboratuvarda manipüle edilebilir, hangi saç folikül kök hücreleri ve MCSCs bir sessiz aktif duruma geçiş neden, ve UV-B pozlama bir tezgah ışığı kullanarak. Bu yöntemler, murine dorsal deride kutanöz Melanom başlamasını başarılı bir uzamsal ve temporal kontrol sağlar. Bu nedenle, bu in vivo model sistemleri, kutanöz Melanom başlatılması erken adımlarını tanımlamak için değerli olacak ve tümör önleme için potansiyel yöntemleri test etmek için kullanılabilir.

Giriş

Melanom, melositik tümörlerin malign formu, deri kanseri ölümlerinin çoğunluğu için sorumlu kutanöz melanom ile deride en agresif kanserdir¹. Amerika Birleşik Devletleri 'nde, melanom yaygın tanısı; 2018²' de tahmin edilen yeni kanser vakaları arasında en yaygın kanser tipi olan 5 ila 6^inci olarak tahmin edilmektedir. Ayrıca, genel kanser olayları son yıllarda kademeli azalma eğilimi gösterirken, son birkaç on yıldır kutanöz Melanom insidansı oranları her iki cinsiyette de sürekli ve hızlı bir artış göstermektedir².

Kutanöz melanom daha verimli bir şekilde mücadele etmek için, klinik olarak etkili önleyici yöntemleri daha iyi belirlemek için köken hücrelerinden Melanom gelişiminin erken olaylarını açıkça anlamak önemlidir. Şimdi yetişkin kök hücrelerinin önemli ölçüde cilt dokularına dahil olmak üzere birçok farklı türde kanserlerin hücre kökeni olarak tümör oluşumuna katkıda bulunabilir bilinmektedir^3,4,5. Benzer şekilde, Yetişkin melanosit kök hücreleri (MCSCs) murine dorsal deri RAS/raf ve akt yollar⁶anormal aktivasyonu üzerine Orijin Melanom hücreleri olarak çalışabilir. Ancak, bu Onkojenik mutasyonlar tek başına verimli MCSCs tümör oluşumuna neden mümkün değildir. Melositik tümörler sonunda MCSCs doğal saç bisiklet sırasında aktif hale zaman gelişir. Ancak, bu protokolde, biz yapay tümör eğilimli MCSCs hücresel aktivasyonunu teşvik etmek için yöntemleri açıklayacağız, böylece Melanom başlatma hassas kontrolünü kolaylaştırmak^6/6.

Burada açıklanan yöntemlerle, tümör eğilimli MCSCs 'den gelen kutanöz Melanom başlamanın uzamsal ve temporal kontrolü, Onkojenik BRAF^V600E ile birlikte PTEN ifadesi kaybı ile başarıyla gerçekleştirilebilecek, biz daha önce⁶bildirdi. Bu yöntem, epilasyon yoluyla saç folikül kök hücre aktivasyonu gösteren önceki bulguları içerir yanı sıra nasıl UV-B için murine cilt pozlama bu hücresel saç folikül ve translokasyon MCSCs ikamet aktivasyonunu kolaylaştırabilir interfollicüler epidermis^6,8,9,10için alt nüfus. Bu in vivo model sistemler nasıl fizyolojik ve çevresel değişiklikler meloma eğilimli MCSCs hücresel durumunu değiştirebilir ile ilgili değerli bilgiler sağlayabilir, hangi sırayla ciltte Melanom önemli başlangıcı neden olabilir.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri Cornell Üniversitesi Kurumsal hayvan bakımı ve kullanım Komitesi (ıAYUC) uyarınca gerçekleştirilir.

1. hazırlık

1. 12 günlük postnatal farelerden kuyruk kliplerini toplayın ve 400 μL 'de 0,05 N NaOH 'da 1 saat için 95 °C ' de sindirin. Vortex ve 1 M Tris-HCl, pH 7 ' nin 32 μL 'i ekleyin. Jackson Laboratuvarı aracılığıyla sağlanan PCR protokollerine göre genotip fareler ve ilgi genotip ile fareler tanımlamak⁶.
   - Tyr-creer – gemizigotnyh (+/creer)
   - LSL-BRAF^V600E – heterozigot (+/LSL-V600E)
   - PTEN- homozigot Flox (Flox/Flox)
   - LSL-tdtomato -gemizigotnyh (+/LSL-tdtomato)
   Not: Primer dizileri malzeme tablosu'nda sağlanmaktadır.
2. Dorsal cildi tıraş etmek için bir saç kesici (elektrikli düzeltici) kullanın, aşağıda açıklanan tüm deneylere 2 ila 3 gün kala, fareler yaklaşık 7 haftadır. Herhangi bir yaralanma, MCSCs dahil olmak üzere saç folikül kök hücrelerini aktive edecek bir yara iyileşme tepkisi kabul edebilir gibi elektrik düzeltici kullanarak ince fare cilt zarar vermemek için dikkat alın.
3. Saç döngüsünün telojen içinde olup olmadığını ve bekleme döneminde cildin yaralanıp yaralandığını belirleyin. Cilt herhangi bir yaralanma belirtisi gösteriyorsa, fare bu prosedürler için kullanılmamalıdır.
   Not: Saç döngüsü genetik arka planlar arasında biraz farklılık gösterse de, bu yaşta dorsal deride saç döngüsü genellikle telojen devlet¹¹' de olur. Tyr-creer transgeni telojen deride MCSCs 'yi hedef alacak ve sonraki genetik değişiklikler mcsc 'nin tüm çağlarda farklılaşmış melanosit ve melositik tümörlerin de dahil olduğu sürekli olarak ifade edilecektir.

2. CRE-LOX Genetik rekombinasyon için Tamoxifen tedavisi

1. İntraperitoneal enjeksiyon (IP) veya sistemik veya lokalize Genetik rekombinasyon için topikal yönetim için tamoksifen hazırlanması
   Not: Tamoksifen için yeniden kombinasyon sağlamak için, ilk 4-hydroxytamoxifen için karaciğer tarafından metabolize edilmelidir (4-OHT), hangi bağlamak ve creeretkinleştirin. Tamoksifen topikal uygulama bu şekilde metabolize olmayacaktır ve 4-OHT doğrudan kullanılmalıdır. Yeterli rekombinasyon için tek bir tamoksifen Teslimat yöntemi gereklidir.
   1. Tamoksifen: 10 mg ml^-1 , Mısır yağında çözünmüş bir konsantrasyonda tamoksifen hazırlayın. Çözelti içine ilacın çözünme yardımcı olmak için,% 10 toplam hacmi% 100 moleküler dereceli etanol toz formunda ilaç, 3 dakika için Vortex ve sonra Mısır yağı kalan hacmi ekleyin. Kristalin malzeme artık çözüm belirgin olana kadar Vortex devam edin. Tamoxifen çözeltisi 0,2 μm filtre üzerinden geçerek sterilize edilebilir. Tedavi için adım 2.2.1 ilerleyin.
   2. 4-OHT:% 100 etanol içinde 3 mg mL^-1 ' e kadar hydroxytamoxifen stok çözümünü hazırlayın. Daha sonra, çalışma çözümü (genellikle tek bir uygulama) ilgi cilt alanı kapsayacak şekilde gerekli kadar uygulanabilir.
      Not: Hydroxytamoxifen bir stok çözümü 5 mM son konsantrasyon için% 100 etanol içinde çözülebilir. Daha sonra, çalışma çözümü hazırlamak için, 5 μL 4OH-Tamoxifen stok solüsyonu 15 μL 100% etanol içine seyreltilebilir. 4 mm² alan için 1 Ila 3 μL çalışma çözeltisi topikal olarak uygulanabilir.
2. Tamoksifen ile fareleri sistematik veya topikal olarak tedavi etmek
   1. Sistemik tedavi için, 2 mg tamoksifen IP enjeksiyonu ile günlük olarak 3 gün boyunca 26 G iğne kullanarak yönetin.
      Not: Bu modeli kullanarak, yaklaşık 93% ± 4 ' ü sessiz MCSCs tdTomato⁶ile etiketlenmiştir.
   2. Bölgesel aktivasyon için 4-OHT ile bir topikal tedavi gerçekleştirin. Çalışma çözeltisi ile ilgi cilt alanı kapak. Çalışma çözümü miktarı, adım 2.1.2 ' de açıklandığı gibi ilgi bölgenin boyutuna göre belirlenebilir.
3. Tamoxifen son doz aşağıdaki 48 h at, 3 adım için kimyasal epilasyon indüklenen tümör başlatma veya adım 4 UV-B kaynaklı tümör başlatma için devam

3. kimyasal epilasyon

1. Aşağıdaki gerekli malzemeler ile bir izofluran sistemi içeren bir fare tedavi odası donatmak: epilasyon krem, pamuk SWABS, kağıt bez, ve su.
2. Fare indüksiyon odasına yerleştirin ve 3,5 ile anestezize 4,5% Isoflurane ve 1 L/min oksijen.
3. Solunum hızı stabilize edildikten sonra, fare bir ayak tutam gerçekleştirerek anestezi uygun düzlemde olduğunu onaylayın ve 1 ila 1,5% Isoflurane ve 1 L/min oksijen ile anestezi korumak ana tüp için fareyi transfer. Anestezi altında iken kurutmadan gözleri tutmak için göz merhem uygulayın.
4. Fare cildin tıraş bölgesine epilasyon krem ince bir tabaka uygulamak için bir pamuk çubuk kullanın.
5. Krem eşit uygulandığında, kaldırma başlamak için temiz pamuk bezlerden kullanın. Krem cilt ile temas toplam süresi 1 dakika geçmemelidir.
6. Cildi nemli bir kağıt bezle hafifçe silin ve herhangi bir kalan krem çıkarıldığından emin olun.
   Not: Tamamen kaldırılırsa epilasyon krem cilt tahriş neden olabilir. C57BL/6 arka planda olanlar gibi bazı fareler, dermatit¹²geliştirmeye eğilimli olabilir. Nadir olsa da, bazı hayvanlar içinde dermatit gelişecektir 24 saç kaldırma krem uygulama veya mekanik epilasyon sonra h. Herhangi bir bölgesel cilt tahrişi belirtileri aramak için tedavi sonrası gün fareler kontrol ettiğinizden emin olun.
7. Çıkarılan saç şaftlarının ve biyolojik tehlike kutusuna kullanılan herhangi bir malzemeyi atın.
8. Anestezi aşınıncaya kadar fareyi boş, temiz bir fare kafesi içine yerleştirin.
9. Fareler kafeslerine geri dönün.

4. UV-B ışınlama

1. Aşağıdaki gerekli malzemelerle bir izofluran sistemi içeren bir fare tedavi odası donatın: UV-b ışık sistemi, UV-b ışık ölçer, fare için koruyucu kaplama, araştırmacı için ek UV-b koruyucu PPE, ve bir zamanlayıcı.
2. Fareler, UV-B dozunda ışınlanmış olmalıdır (i.e., 0-180 mJ/cm²). Fareleri ışınmak için uygun süreyi belirlemek için UV-B ışık ölçer kullanın.
   Not: MW/cm² x zaman = doz
3. Isoflurane ile fare anestezize. İndüksiyon odasında iken, 3,5 kullanın 4,5% Isoflurane ve 1 L/min oksijen.
4. Fare stabilize edildikten sonra, bir ayak tutam ile anestezi etkilerini onaylamak ve UV odasında bulunan ana anestezi tüpü fare transfer. Anestezi altında sırasında kurutulması gözleri önlemek için göz merhem uygulayın. 1 ila 1,5% isofluran ve 1 L/min oksijen ile anestezi koruyun.
5. Sadece istenilen bölgenin maruz kalabilmesi için dorsal cildi UV-B koruyucu malzemeyle Kapla.
   Not: Şu anda uygun KKD kullanılmalıdır. Fareyi ışınlamam için gereken süre, kullanılan ampulün yoğunluğuna bağlıdır, ancak gerekli süre 30 s 'yi aşarsa anestezinin izlenmesi gerekebilir.
6. UV odasına UV geçirmez kapak veya diğer uygun malzemeleri kullanarak kapak yapın.
7. UV-B lambası açın ve belirli bir amaç için araştırmacılar tarafından belirlenen zaman için fareyi ışınlamak.
8. UV sistemi ve İsoflurane kapatın, sonra anestezi yıpranmış kadar boş bir fare kafesi fare yerleştirin.
9. Fareler kafeslerine geri dönün.

5. doku Işleme

1. Cilt yalıtımı
   1. Başlamadan önce aşağıdaki elde: Otopsi aletleri, filtre kağıt ve kağıt havlu.
   2. IAŞUC onaylı protokollere göre fareler ötenize ve devam etmeden önce ölümü onaylayın.
   3. Saç kesici kullanarak, dorsal cilt bölgesinden herhangi bir saç tıraş. Alanı temizlemek için hafif bir tüy serbest doku ile alanı hafifçe fırçalayın.
   4. Kuyruk tabanının hemen üzerinde keskin makas ile küçük bir kesi olun.
   5. Kesi içine büyük künt makas takın ve subdermal bağ dokularına ayırın.
   6. Dikkatle doku kenarı boyunca keskin makas ile keserek ilgi cilt bölgesini izole.
   7. Temiz bir kağıt havlu üzerine cilt dokusu yerleştirin ve böylece havlu yapışır ve öğretilir cildi germek için donuk forseps kullanın. Bu adım, onun şeklini korurken manipüle edilebilir ve işlenmiş böylece doku için ek destek sağlamak için hizmet vermektedir.
      Not: Forseps histolojik olarak görülebilir cilde zarar verebilir gibi sadece cilt dokusu dış bölgeleri işlemek için dikkatli olun.
2. Doku fikreme
   1. Fold yarım filtre kağıt bir parça ve uygun etiket. Cildinizi kağıt havlusu ile birlikte hemen kırışık bitişiğinde katlanmış kağıt içine yerleştirin, numunenin pürüzsüz ve katlanmış veya kırılmış olmadığından emin olmak. Açık kenarları zımbalayarak filtre kağıdını mühürleyin ve ardından kalan kağıdın gelecekteki örnekler için kullanılabilmesi için kırpın.
      Not: Bu adım, böylece cilt sabitleme sırasında şeklini korur gerçekleştirilir.
   2. Doku örneğini, oda sıcaklığında 3 ila 5 saat veya 4 °C ' de bir gecede% 10 nötr tampon formalin içinde tamamen taşabilir.
   3. Fikyasyon sonrasında, formalin örneklerini çıkarın, deiyonize suda yıkayın (2x, 5 dk her) ve doku blokları yapmaya devam edin. Cilt dokusundan herhangi bir kalıntı malzemesi dikkatle çıkarın (yani, kalıntı kağıt).
3. Dondurulmuş doku blokları yapma (Şekil 1)
   1. Böylece onlar pürüzlü değildir ve sonra 3 sagittal kesikler yapmak cilt örneğinin kenarları Trim. Bu şeritlerin genişliği, cryomold (5 mm) yüksekliğinden daha fazla olmamalıdır. Daha sonra, kısırlık (20 mm) genişliğinden daha uzun olmayan ve gömülü olabilir cilt parçaları var enine kesikler olun. Dorsal cildin kalan yarısı ile tekrarlayın veya diğer kullanımlar için doku kaydetmek (dönüşümlü olarak, sabitleme önce yarım kaydedin).
      Not: Cilt parçalarını uygun yönde tutmak önemlidir.
   2. Cryomold (25 x 20 x 5 mm³) ' i dikey yönde YÖNLENDIRMEK ve Ekim 'in üstüne 4 ila 5 adet cilt yerleştirin. Bir kez tüm parçalar yerinde, cryomold alt cilt uzun kenarı getirmek için ince forseps 2 Çift kullanın. Cilt artık kalıp tabanına dik EKIM 'de ayakta olmalıdır. Bu adımda OCT içinde hava ceplerinin oluşumunu en aza indirmek için özen (Şekil 1).
   3. İkinci dudak için OCT ile kalıp doldurun ve Kuru buzun düz yüzeyine yerleştirin. Blok dondurmaya başlar gibi transfer sırasında kaymış olabilir herhangi bir cilt parçaları ayarlamak için forseps kullanın. Alt tabaka katılaşmış sonra, dokuların manipülasyon imkansız olacaktır.
   4. Kesme 8-10 μm slaytlar analiz için.
4. Formalin sabit parafin Embedded (FFPE) doku blokları yapma
   1. Bir etiketli kaset içine sabit Cilt 2 adet yerleştirin ve etanol konsantrasyonları artan susuz (75% etanol 30 dakika için, 85% için 30 dakika, 90% için 30 dakika, 95% için 30 dk,% 100 2x 30 dakika, ksilya veya ksilon yerine 2x 30 dakika). Parafin ile 58-60 °, ilk 30 dakika ve sonra bir gecede inküye.
   2. Dokusunu 24 x 24 mm² paslanmaz çelik doku kalıbı ile sıvı parafin ve-5 °c ' de kuvvetlendirmek ile katıştırın. Doku yönünü dondurulmuş doku blokları benzer olmalıdır böylece birden fazla saç folikülleri arasında boyuna bölümler görselleştirilebilir (Şekil 1).
   3. Parafin katılaşmış bir kez, kalıp kaldırmak ve analiz için 5-10 μm bölümlere kesilmiş.

Sonuçlar

Kimyasal epilasyon ile indüklenen kutanöz Melanom başlatılması

Kimyasal epilasyon prosedürü Şekil 2' de tasvir edilir. Fareler 7 haftalık postnatal olduğunda, onların dorsal deri telogen içinde. Telogen sırasında, saç folikül kök hücreleri ve MCSCs bir sessiz, istirahat durumda olduğu bilinmektedir. Cilt tıraş sonrası önemli bir saç büyümesi göstermemelidi...

Tartışmalar

Kutanöz Melanom tümörlerinde sık görülen Hallmark genetik değişiklikler¹³' ü iyi nitelendirdi. En dominant sürücü mutasyonu BRAF^V600E, ve BRAF^V600E-aracılı melanom için genetiği tasarlanan fare modeli Bosenberg grubu tarafından oluşturulan¹⁴ ve Jackson Laboratuvarı yatırıldı. Bu fare modelini kullanarak, son çalışmada dorsal cilt⁶ BRAF^V600E-aracılı Melanom önemli ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tamoxifen	Sigma	T5648-1G	For systemic injection
Tamoxifen	Cayman Chemical	13258	For systemic injection
Corn oil	Sigma	45-C8267-2.5L-EA
4OH-tamoxifen	Sigma	H7904-25MG	For topical treatment
26g 1/2" needles	various		Veterinary grade
1 mL syringe	various		Veterinary grade
Pet hair trimmer	Wahl	09990-502
Hair removal cream	Nair	n/a	Available at most drug stores
Cotton swabs	various
Ultraviolet light bulb	UVP	95-0042-08	model XX-15M midrange UV lamp
200 proof ethanol	various		pure ethanol
Histoplast PE	Fisher Scientific	22900700	paraffin pellets
Neutral Buffered Formalin, 10%	Sigma	HT501128-4L
Clear-Rite 3	Thermo Scientific	6901	xylene substitute
O.C.T. Compound	Thermo	23730571
Tissue Cassette	Sakura	89199-430	for FFPE processing
Cryomolds	Sakura	4557	25 x 20 mm
FFPE metal mold	Leica	3803082	24 x 24 mm
Isoflurane	various		Veterinary grade
Anesthesia inhalation system	various		Veterinary grade
Fine scissor	FST	14085-09	Straight, sharp/sharp
Fine scissor	FST	14558-09	Straight, sharp/sharp
Metzenbaum	FST	14018-13	Straight, blunt/blunt
Forcep	FST	11252-00	Dumont #5
Forcep	FST	11018-12	Micro-Adson
Tyr-CreER; LSL-BrafV600E; Pten-f/f	Jackson Labs	13590
LSL-tdTomato	Jackson Labs	007914	ai14
Cre-1		n/a	GCATTACCGGTCGATGCAACGAGTGATGAG
Cre-2		n/a	GAGTGAACGAACCTGGTCGAAATCAGTGCG
Braf-V600E-1		n/a	TGAGTATTTTTGTGGCAACTGC
Braf-V600E-2		n/a	CTCTGCTGGGAAAGCGGC
Kras-G12D-1		n/a	AGCTAGCCACCATGGCTTGAGTAAGTCTGCA
Kras-G12D-2		n/a	CCTTTACAAGCGCACGCAGACTGTAGA
Pten-1		n/a	ACTCAAGGCAGGGATGAGC
Pten-2		n/a	AATCTAGGGCCTCTTGTGCC
Pten-3		n/a	GCTTGATATCGAATTCCTGCAGC
tdTomato-1		n/a	AAGGGAGCTGCAGTGGAGTA
tdTomato-2		n/a	CCGAAAATCTGTGGGAAGTC
tdTomato-3		n/a	GGCATTAAAGCAGCGTATCC
tdTomato-4		n/a	CTGTTCCTGTACGGCATGG