Пространственный и временный контроль Мурин Меланомы Инициация от мутантных меланоцитов стволовых клеток

Резюме

Следующая процедура описывает метод пространственного и временного контроля меланоцитарной опухоли инициации в куринной дорсальной кожи, используя генетически инженерии мыши модели. Этот протокол описывает макроскопические, а также микроскопические кожной меланомы инициации.

Аннотация

Кожная меланома хорошо известна как самый агрессивный рак кожи. Хотя факторы риска и основные генетические изменения продолжают фиксироваться с увеличением глубины, частота заболеваемости кожной меланомой в последние десятилетия быстро и непрерывно растет. Для того, чтобы найти эффективные профилактические методы, важно понимать ранние шаги начала меланомы в коже. Предыдущие данные показали, что фолликулярные меланоциты стволовых клеток (MCSCs) в тканях кожи взрослой кожи может выступать в качестве клеток меланомы происхождения при выражении онкогенных мутаций и генетических изменений. Tumorigenesis возникает от меланомы подверженных MCSCs может быть вызвано при переходе MCSCs от покоя к активному состоянию. Этот переход в меланомы подверженных MCSCs может быть повышена путем модуляции либо волосяного фолликула стволовых клеток состояние или через внутренние экологические факторы, такие как ультрафиолет-B (УФ-B). Эти факторы могут быть искусственно манипулировать в лаборатории путем химического депиляции, которая вызывает переход стволовых клеток волосяного фолликула и MCSCs от тихого к активному состоянию, и УФ-B воздействия с помощью скамейки света. Эти методы обеспечивают успешный пространственный и временный контроль кожной меланомы инициации в куринной донской кожи. Таким образом, эти системы in vivo будут полезны для определения ранних этапов начала кожной меланомы и могут быть использованы для тестирования потенциальных методов профилактики опухоли.

Введение

Меланома, злокачественная форма меланоцитических опухолей, является наиболее агрессивным раком в коже с кожной меланомой, ответственной за большинство случаев смерти от рака кожи¹. В Соединенных Штатах, меланома обычно диагностируется; по прогнозам, это будет 5-й до 6-й наиболее распространенный тип рака среди предполагаемых новых случаев рака в 2018^{году 2}. Кроме того, в то время как общие заболеваемости раком показали тенденцию постепенного сокращения в последние десятилетия, кожные показатели заболеваемости меланомой в течение последних нескольких десятилетий демонстрируют непрерывное и быстрое увеличение обоих полов².

Для более эффективной борьбы с кожной меланомой важно четко понимать ранние события развития меланомы из их клеток происхождения, чтобы лучше определить клинически эффективные профилактические методы. В настоящее время известно, что взрослые стволовые клетки могут значительно способствовать образованию опухоли, как клеточного происхождения рака во многих различных типах органов, включая ткани кожи^3,4,5. Аналогичным образом, взрослые стволовые клетки меланоцитов (MCSCs) в куринской нижней кожи может работать как клетки меланомы происхождения при аномальной активации Рас / Раф и Акт пути⁶. Тем не менее, эти онкогенные мутации сами по себе не в состоянии эффективно вызвать образование опухоли от тихих MCSCs. Меланоцитические опухоли в конечном итоге развиваться, когда MCSCs становятся активными во время естественного цикла волос. Однако, в этом протоколе, мы опишите методы искусственного индуцирования клеточной активации подверженных опухоли MCSCs, тем самым облегчая точный контроль меланомы инициации^6,7.

С помощью методов, описанных здесь, пространственный и временный контроль кожной меланомы инициации от опухолевых MCSCs, выражающих онкогенные Braf^V600E вместе с потерей экспрессии Pten может быть успешно выполнена, как мы ранее сообщали^{о 6}. Этот метод включает в себя предыдущие выводы, которые демонстрируют активации волосяного фолликула через депиляцию, а также как воздействие кожи мурина на УФ-В может способствовать активации MCSCs резидентов волосяного фолликула и транслокации этой клеточной субпопуляции до межфолликулярной эпидермис^6,8,^9,10. Эти системы in vivo могут предоставить ценную информацию о том, как физиологические и экологические изменения могут изменить клеточный статус меланомы подверженных MCSCs, которые, в свою очередь, может вызвать значительное начало меланомы в коже.

протокол

Все процедуры для животных выполняются в соответствии с Комитетом по институциональному уходу и использованию животных Корнельского университета (IACUC).

1. Подготовка

1. Соберите хвостовые зажимы от 12-дневных послеродовых мышей и переварить в 400 л 0,05 N NaOH при 95 градусах по Цельсию на 1 ч. Вихрь и добавьте 32 зл от 1 M Tris-HCl, pH 7. Генотип мышей в соответствии с протоколами ПЦР, предоставляемых через лабораторию Джексона и определить мышей с генотипом интереса⁶.
   - Тир-Креер - гемизигоус (/ CreER)
   - LSL-Braf^V600E - гетерозиготный (
   - Pten - гомозиготный флокс (флокс/флокс)
   - LSL-tdTomato - hemizygous (
   ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Праймер последовательности приведены в таблице материалов.
2. Используйте клипер для волос (электрический триммер) для бритья сонной кожи от 2 до 3 дней до всех экспериментов, описанных ниже, и когда мыши примерно 7 недель. Позаботьтесь, чтобы не повредить тонкую кожу мыши с помощью электрического триммера, как любая травма может вызвать реакцию заживления ран, которые активируют стволовые клетки волосяного фолликула, в том числе MCSCs.
3. Определите, если волос цикл в telogen и является ли кожа ранена в период ожидания. Если кожа показывает какие-либо признаки травмы, мышь не должна использоваться для этих процедур.
   ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Хотя цикл волос может немного отличаться между генетическими фонами, в этом возрасте цикл волос в сонной коже, как правило, в состоянии телегена¹¹. Tyr-CreER transgene будет направлена MCSCs в тероген кожи, и последующие генетические изменения будут постоянно выражается во всех линиях MCSC, в том числе дифференцированных меланоцитов и меланоцитов опухолей.

2. Тамоксифен Лечение Cre-Lox генетической рекомбинации

1. Подготовка тамоксифена для интраперитонеальной инъекции (ИС) или местного введения для системной или локализованной генетической рекомбинации
   ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Для того, чтобы тамоксифен, чтобы вызвать рекомбинацию, он должен сначала быть метаболизируется печенью до 4-гидрокситамоксифен (4-OHT), который может связываться и активировать CreER. Актуальное применение тамоксифена не будет метаболизироваться таким образом и 4-OHT должны непосредственно использоваться. Для достаточной рекомбинации требуется только один способ доставки тамоксифена.
   1. Тамоксифен уровень, подготовка тамоксифена при концентрации 10 мг мл^-1, растворенного в кукурузном масле. Чтобы помочь в растворении препарата в раствор, добавить до 10% общий объем 100% молекулярного класса этанола к препарату в виде порошка, вихрь в течение 3 мин, а затем добавить оставшийся объем кукурузного масла. Продолжайте вихрь до тех пор, пока кристаллический материал больше не проявляется в растворе. Тамоксифен раствор может быть стерилизован путем прохождения через фильтр 0,2 мкм. Приступить к шагу 2.2.1 для лечения.
   2. 4-OHT, подготовка стокового раствора гидрокситамоксифена до 3 мг мл мл^-1 в 100% этанола. Затем, рабочее решение может быть применено столько, сколько необходимо для покрытия области кожи интерес (как правило, одно приложение).
      ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Запасной раствор гидрокситамоксифена может быть растворен в 100% этаноле при окончательной концентрации 5 ММ. Затем, чтобы подготовить рабочий раствор, 5 л 4OH-тамоксифен бульона раствор может быть разбавлен в 15 зл 100% этанола. Для 4 мм² области, от 1 до 3 л рабочего решения могут быть местно применены.
2. Лечение мышей тамоксифеном либо системно, либо местно
   1. Для системного лечения, управлять 2 мг тамоксифена через инъекции IP один раз в день в течение 3 дней с помощью 26 G иглы.
      ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Используя эту модель, примерно 93% и 4% потянительных MCSCs помечены tdTomato⁶.
   2. Для региональной активации, выполнить один актуальный лечения с 4-OHT. Обложка области кожи интерес с рабочим решением. Объем рабочего решения может определяться размером региона интереса, как описано в шаге 2.1.2.
3. На 48 ч после последней дозы тамоксифена, перейти к шагу 3 для химического депиляции индуцированной опухоли инициации или шаг 4 для УФ-B индуцированной инициации опухоли

3. Химическая депиляция

1. Оборудуйте комнату для обработки мышей, содержащую изофларанную систему со следующими необходимыми материалами, сливками для удаления волос, ватными тампонами, бумажной тканью и водой.
2. Поместите мышь в индукционную камеру и анестезируйте с 3,5 до 4,5% изофлуран и 1 л / мин кислорода.
3. После того, как частота дыхания стабилизировалась, подтвердите, что мышь находится в надлежащей плоскости анестезии, выполняя щепотку ног и перенесите мышь в основную трубку, поддерживающую анестезию с 1 до 1,5% изофлураном и кислородом 1 л/мин. Нанесите глазную мазь, чтобы глаза не высыхать под наркозом.
4. Используйте ватный тампон, чтобы нанести тонкий слой крема для удаления волос на бритую область кожи мыши.
5. После того, как крем был равномерно применен, использовать чистые ватные тампоны, чтобы начать удаление. Общее время, в течение которого крем находится в контакте с кожей, не должно превышать 1 мин.
6. Аккуратно протрите кожу влажной бумажной тканью и убедитесь, что любой остаточный крем был удален.
   ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Крем для удаления волос может вызвать раздражение кожи, если она не полностью удалена. Некоторые мыши, такие как на фоне C57BL/6, могут быть склонны к развитию дерматита^12. Хотя редко, некоторые животные будут развиваться дерматит в течение 24 ч после удаления волос крем применения или механического депиляции. Убедитесь в том, чтобы проверить мышей на следующий день после лечения, чтобы искать какие-либо признаки регионального раздражения кожи.
7. Отбросьте удаленные волосяные валы и любые материалы, используемые в биоопасный ящик.
8. Поместите мышь в пустую, чистую клетку мыши, пока анестезия не стирается.
9. Верните мышей в клетки.

4. Облучение УФ-В

1. Оборудуйте комнату для обработки мышей, содержащую изофларановую систему со следующими необходимыми материалами, с помощью следующей системы света УФ-В, ультрафиолетового светового метра, защитного покрытия для мыши, дополнительного УФ-Б защитного СИЗ для исследователя и таймера.
2. Мыши следует облучать в дозе УФ-В интересах (т.е. 0-180 мДж/см^2). Используйте ультрафиолетовый световой измеритель для определения соответствующего периода времени для облучения мышей.
   ПРИМЕЧАНИЕ ПРИМЕЧАНИЕ. mW/см² x время и доза
3. Анестезируйка мыши с изофлюраном. В то время как в индукционной камере, использовать от 3,5 до 4,5% изофлуран и 1 л / мин кислорода.
4. После того, как мышь стабилизировалась, подтвердите эффект анестезии с ног щепотку и передать мышь в основной анестезии трубки, расположенной в УФ-камеры. Нанесите глазную мазь, чтобы предотвратить высыхание глаз под наркозом. Поддерживайте анестезию с 1 до 1,5% изофлураном и 1 л/мин кислородом.
5. Обложка сонной кожи с UV-B защитный материал, так что только желаемая область будет подвергаться.
   ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ В настоящее время следует использовать соответствующий СИЗ. Продолжительность времени, необходимого для облучения мыши, зависит от интенсивности используемой лампочки, но анестезию, возможно, потребуется контролировать, если требуемое время превышает 30 с.
6. Обложка УФ-камеры с помощью УФ-резистентной крышкой или любых других подходящих материалов.
7. Включите лампу UV-B и облучаем мышь на время, определенное исследователями для конкретной цели.
8. Выключите УФ-систему и изолюран, а затем поместите мышь в пустую клетку мыши, пока анестезия не стирается.
9. Верните мышей в клетки.

5. Обработка тканей

1. Изоляция кожи
   1. Получить следующие до начала работы, некропсии инструменты, фильтровальная бумага и бумажные полотенца.
   2. Эвтаназия мышей в соответствии с протоколами IACUC утвержденных, и подтвердить смерть до начала разбирательства.
   3. Использование клипера для волос, брить любые волосы из области сонной кожи. Слегка щеткой области с ворсом свободной ткани, чтобы очистить область.
   4. Сделайте небольшой разрез острыми ножницами чуть выше основания хвоста.
   5. Вставьте большие тупые ножницы в разрез и отделите подкожные соединительные ткани.
   6. Тщательно изолировать область кожи интересующий путем резки с острыми ножницами вдоль края ткани.
   7. Поместите ткани кожи на чистое бумажное полотенце и использовать тупые щипцы, чтобы растянуть кожу так, чтобы она придерживается полотенце и преподается. Этот шаг служит для обеспечения дополнительной поддержки ткани, так что она может манипулировать и обрабатываться при сохранении своей формы.
      ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Будьте осторожны, чтобы обрабатывать только внешние области ткани кожи, так как щипки могут привести к повреждению кожи, которые можно увидеть гистологически.
2. Фиксация тканей
   1. Сложите кусок фильтровальной бумаги пополам и этикетку соответствующим образом. Поместите кожу вместе с бумажным полотенцем поддержку в сложенную бумагу непосредственно рядом с складкой, гарантируя, что образец гладкий и не сложить или мятый. Печать фильтровальной бумаги, скрепив открытые стороны, а затем обрезать так, что остальная бумага может быть использована для будущих образцов.
      ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Этот шаг выполняется так, что кожа сохраняет свою форму во время фиксации.
   2. Полностью погрузите образец ткани в 10% нейтральный буферный формалин на 3-5 ч при комнатной температуре или на ночь при температуре 4 градусов по Цельсию.
   3. После фиксации, удалить образцы из формалина, мыть в деионизированной воде (2x, 5 мин каждый) и приступить к производству тканей блоков. Тщательно удалите любой остаточный материал из ткани кожи (т.е. остаточную бумагу).
3. Изготовление замороженных тканевых блоков(рисунок 1)
   1. Обрезать края образца кожи так, чтобы они не зубчатые, а затем сделать 3 sagittal сокращений. Ширина этих полос не должна быть больше, чем высота криомолд (5 мм). Далее, сделать поперечные порезы, чтобы иметь куски кожи, которые не больше, чем ширина криомолд (20 мм) и могут быть встроены. Повторите с оставшейся половиной стрижки кожи, или сохранить ткани для других целей (поочередно, сохранить половину до фиксации).
      ПРИМЕЧАНИЕ ОТНОсяСЬ к СВЕДЕНИ Важно держать части кожи в правильной ориентации.
   2. Ориентируйте криомольд (25 x20 x 5 мм 3) в портретной ориентации и поместите от 4 до 5 кусочков кожи поверх OCT. После того, как все части на месте, используйте 2 пары тонких щипцы, чтобы принести длинный край кожи на дно криомолд. Кожа должна теперь стоять в OCT перпендикулярно к основанию формы. Позаботьтесь, чтобы свести к минимуму образование воздушных карманов в ПРЕДЕЛАх OCT во время этого шага (Рисунок 1).
   3. Заполните форму с OCT на вторую губу, и место на плоской поверхности сухого льда. Используйте щиптем, чтобы настроить любые части кожи, которые, возможно, перешли во время передачи, как блок начинает замерзать. Как только нижний слой затвердеет, манипуляции с тканями будут невозможны.
   4. Вырезать 8-10 мкм слайды для анализа.
4. Создание формалин фиксированный параффин встроенных (FFPE) тканевых блоков
   1. Поместите 2 части фиксированной кожи в маркированную кассету и обезвождение в увеличении концентраций этанола (75% этанола в течение 30 мин, 85% за 30 мин, 90% за 30 мин, 95% за 30 мин, 100% для 2x 30 мин, ксилена или ксилена заменить 2x 30 мин). Инкубировать с парафином при 58-60 ", сначала в течение 30 минут, а затем на ночь.
   2. Встраивай ткань в форму 24 x 24 мм² из нержавеющей стали с жидким парафином и затвердевай при -5 градусах Цельсия. Ориентация ткани должна быть похожа на замороженные блоки ткани, так что продольные секции через несколько волосяных фолликулов могут быть визуализированы(Рисунок 1).
   3. После того, как парафин затвердел, удалить плесень и нарезать 5-10 мкм разделов для анализа.

Результаты

Кожная меланома инициации индуцированной химической депиляции

Процедура химического депиляции изображена на рисунке 2. Когда мыши 7-недельный послеродовой, их дорсальная кожа находится в телегене. Во время telo...

Обсуждение

Hallmark генетические изменения часто встречаются в кожной меланомы опухолей были хорошо описаны¹³. Наиболее доминирующей мутацией драйвера является Braf^V600E, а генетически модифицированная модель мыши для Braf V600E-опосредованноемеланома была создана группо?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tamoxifen	Sigma	T5648-1G	For systemic injection
Tamoxifen	Cayman Chemical	13258	For systemic injection
Corn oil	Sigma	45-C8267-2.5L-EA
4OH-tamoxifen	Sigma	H7904-25MG	For topical treatment
26 G 1/2" needles	various		Veterinary grade
1 mL syringe	various		Veterinary grade
Pet hair trimmer	Wahl	09990-502
Hair removal cream	Nair	n/a	Available at most drug stores
Cotton swabs	various
Ultraviolet light bulb	UVP	95-0042-08	model XX-15M midrange UV lamp
200 proof ethanol	various		pure ethanol
Histoplast PE	Fisher Scientific	22900700	paraffin pellets
Neutral Buffered Formalin, 10%	Sigma	HT501128-4L
Clear-Rite 3	Thermo Scientific	6901	xylene substitute
O.C.T. Compound	Thermo	23730571
Tissue Cassette	Sakura	89199-430	for FFPE processing
Cryomolds	Sakura	4557	25 x 20 mm
FFPE metal mold	Leica	3803082	24 mm x 24 mm
Isoflurane	various		Veterinary grade
Anesthesia inhalation system	various		Veterinary grade
Fine scissor	FST	14085-09	Straight, sharp/sharp
Fine scissor	FST	14558-09	Straight, sharp/sharp
Metzenbaum	FST	14018-13	Straight, blunt/blunt
Forcep	FST	11252-00	Dumont #5
Forcep	FST	11018-12	Micro-Adson
Tyr-CreER; LSL-BrafV600E; Pten-f/f	Jackson Labs	13590
LSL-tdTomato	Jackson Labs	007914	ai14
Cre-1		n/a	GCATTACCGGTCGATGCAACGA GTGATGAG
Cre-2		n/a	GAGTGAACGAACCTGGTCGAA ATCAGTGCG
Braf-V600E-1		n/a	TGAGTATTTTTGTGGCAACTGC
Braf-V600E-2		n/a	CTCTGCTGGGAAAGCGGC
Kras-G12D-1		n/a	AGCTAGCCACCATGGCTTGAGT AAGTCTGCA
Kras-G12D-2		n/a	CCTTTACAAGCGCACGCAGACT GTAGA
Pten-1		n/a	ACTCAAGGCAGGGATGAGC
Pten-2		n/a	AATCTAGGGCCTCTTGTGCC
Pten-3		n/a	GCTTGATATCGAATTCCTGCAGC
tdTomato-1		n/a	AAGGGAGCTGCAGTGGAGTA
tdTomato-2		n/a	CCGAAAATCTGTGGGAAGTC
tdTomato-3		n/a	GGCATTAAAGCAGCGTATCC
tdTomato-4		n/a	CTGTTCCTGTACGGCATGG