Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

اختبار دقيق وقوي قائم على سلسلة من ردود الفعل البوليمرية لتحديد كمية السيتوسين-غوانين-غوانين الترينوكلوتيد يكرر في الجين الهش X التخلف العقلي-1 يسهل التشخيص الجزيئي وفحص متلازمة X الهشة والهشة X ذات الصلة اضطرابات مع أقصر بدوره حول الوقت والاستثمار في المعدات.

Abstract

متلازمة X الهشة (FXS) والاضطرابات المرتبطة بها بسبب التوسع في السيتوسين-غوانين-غوانين (CGG) ترينوكلوتيد تكرار في منطقة 5 'غير مترجمة (UTR) من الهشاشة X التخلف العقلي-1(FMR1)الجينات المروج. تقليديا، يتم استخدام تحليل جزء الكهربائي الشعرية على محلل وراثي لتغيير الحجم من CGG يكرر FMR1، ولكن مطلوب تحليل لطخة الجنوبية إضافية للقياس الدقيق عندما يكون الرقم المتكرر أعلى من 200. هنا، نقدم دقيقة وقوية تفاعل البوليميراز سلسلة (PCR) -- طريقة تستند إلى القياس الكمي من CGG يكرر FMR1. الخطوة الأولى من هذا الاختبار هي تضخيم PCR من تكرار التسلسلات في 5'UTR من المروج FMR1 باستخدام مجموعة PCR X الهشة، تليها تنقية منتجات PCR وتجزئة التحجيم على جهاز الكهربائي الشعيرات الشعرية microfluidic، و تفسير لاحق لعدد CGG يكرر عن طريق الرجوع إلى المعايير مع تكرار المعروفة باستخدام برنامج التحليل. هذا الاختبار المستند إلى PCR قابل للتكرار وقادر على تحديد مجموعة كاملة من CGG يكرر من المروجين FMR1، بما في ذلك تلك التي مع عدد متكرر من أكثر من 200 (تصنف على أنها طفرة كاملة)، 55 إلى 200 (التحوير)، 46 إلى 54 (وسيط)، و 10 إلى 45 (عادي). وهي طريقة فعالة من حيث التكلفة تسهل تصنيف FXS والاضطرابات الهشة المرتبطة بـ X مع المتانة ووقت الإبلاغ السريع.

Introduction

متلازمة X الهشة (FXS) والاضطرابات الهشة X المرتبطة بها، على سبيل المثال، الهزة ومتلازمة ترنح (FX-TAS)، وقصور المبيض الأولي (FX-POI) هي أساسا بسبب السيتوسين-غوانين-غوانين (CGG) ترينوكلوتيد تكرار التوسع في 5 'غير مترجمة المنطقة (UTR) من التخلف العقلي X الهشة-1(FMR1)الجينات على Xq27.31،2. البروتين المشفر FMR1 (FMRP) هو بروتين ملزم بالحمض النووي الريبي المرتبط بالبوليريبوسوم يعمل في تطوير الخلايا العصبية واللدونة متشابك من خلال تنظيم الربط البديل، والاستقرار، والنقل الددري من mRNA أو التوليف تحوير من البروتينات المشاركات الجزئية3،4،5،6،7.

ويوصف التباين الديناميكي مع حجم تكرار CGG من >200 بأنها طفرة كاملة، مما يحفز فرط الميثيل الشاذ وإسكات النسخ اللاحقة للمروّج FMR1 8. يؤدي غياب أو نقص بروتين FMRP إلى تعطيل تطور الخلايا العصبية الطبيعية ويسبب FXS9، الذي يتميز بأعراض سريرية مختلفة، بما في ذلك الإعاقة الذهنية المعتدلة إلى الشديدة، وتأخر النمو، والسلوكيات المفرطة النشاط، ضعف الاتصالات ومظاهر التوحد10،11،12. العرض في المرضى FXS الإناث عموما أكثر اعتدالا من ذلك في الذكور. ويصنف حجم تكرار CGG الذي يتراوح بين 55 و200 و45 إلى 54 على أنه حالة ما قبل التحويل والمستوى المتوسط، على التوالي. بسبب درجة عالية من عدم الاستقرار، وCGG تكرار حجم في premutation أو الأليل المتوسطة يفترض أن يوسع عندما تنتقل من الآباء والأمهات إلى ذرية13،14. وهكذا، فإن الناقلين مع الأليلات ما قبل النضة في خطر كبير من وجود الأطفال المتضررين من FXS بسبب التوسع المتكرر، وفي بعض الحالات، يمكن أن توسع الأليلات المتوسطة حجمها المتكرر إلى مجموعة الطفرة الكاملة على مدى جيلين15، 16. وعلاوة على ذلك، فإن الذكور مع preprepre ينقل أيضا زيادة خطر تطوير في وقت متأخر من ظهور FX-TAS17،18،19، في حين أن الإناث قبل التحول هي مستعدة لكل من FX-TAS وFX-POI20، 21،22. في الآونة الأخيرة، أفيد أن اضطرابات طيف التوحد مع تأخر النمو ومشاكل في السلوكيات الاجتماعية يتم عرضها في الأطفال مع النفير FMR1 alleles23،24.

لتحديد بالضبط CGG تكرار حجم له أهمية كبيرة لتصنيف والتنبؤ من FXS والاضطرابات الهشة المرتبطة X25،26. تاريخيا، كان CGG تكرار المنطقة محددة تفاعل البوليميراز سلسلة (PCR) مع تجزئة جزء بالإضافة إلى تحليل وصمة عار الجنوبية المعيار الذهبي للتنميط الجزيئي للFMR1 CGG تكرار27. ومع ذلك، PCR محددة التقليدية هي أقل حساسية للطفرات الكبيرة مع أكثر من 100 إلى 130 يكرر وغير قادر على تضخيم الطفرات الكاملة27،28. وعلاوة على ذلك، يفشل الكتروفوريس الشعري على محلل وراثي تقليدي لتكرار التحجيم في الكشف عن منتجات PcR FMR1 مع أكثر من 200 CGG يكرر. يتيح تحليل اللطخة الجنوبية التمييز بين مجموعة أوسع من الحجم المتكرر، من الأرقام العادية إلى أرقام تكرار الطفرة الكاملة، وقد تم استخدامه على نطاق واسع لتأكيد الطفرات الكاملة (في الذكور) وتمييز الأليلات المتجانسة مع طفرة كاملة من على ما يبدو المتجانسة الأليلات مع أحجام تكرار العادية (في الإناث). ومع ذلك، فإن قرار التحديد الكمي للتكرار محدود. والأهم من ذلك، أن استراتيجية الاختبار هذه خطوة بخطوة هي استراتيجية كثيفة العمالة وتستغرق وقتاً طويلاً وغير فعالة من حيث التكلفة.

هنا، نقدم طريقة دقيقة وقوية تستند إلى PCR لتحديد كمي من CGG يكرر FMR1. الخطوة الأولى من هذا الاختبار هي تضخيم PCR من تسلسل تكرار في 5'UTR من المروج FMR1 باستخدام مجموعة PCR X الهشة. يتم تنقية منتجات PCR ويتم تنفيذ تغيير حجم الشظايا على أداة الكهربائي الشعرية الدقيقة، والتفسير اللاحق لعدد CGG يكرر باستخدام برنامج التحليل عن طريق الرجوع إلى المعايير مع تكرار المعروفة على أساس الأساس المنطقي أن طول جزء PCR يتناسب مباشرة مع عدد CGG يكرر. ويشمل نظام PCR الكواشف التي تسهل تضخيم منطقة تكرار trinucleotide الغنية جدا GC. هذا الاختبار المستند إلى PCR قابل للاستنساخ وقادر على تحديد جميع نطاقات CGG يكرر المروجين FMR1. هذا هو طريقة فعالة من حيث التكلفة التي يمكن أن تجد تطبيق واسع النطاق في التشخيص الجزيئي وفحص FXS والاضطرابات الهشة ذات الصلة X مع أقل بدوره حول الوقت والاستثمار في المعدات، وبالتالي، يمكن استخدامها في مجموعة أوسع من السريرية المختبرات.

Protocol

تم منح الموافقة الأخلاقية من قبل الجامعة الصينية المشتركة في هونغ كونغ-الأقاليم الجديدة الشرقية مجموعة البحوث السريرية لجنة (الرقم المرجعي: 2013.055)

1. تضخيم PCR

  1. قبل البدء، قم بإزالة مزيج المخزن المؤقت PCR، وعينات مخففة والحمض النووي (كل من الاختبار والحمض النووي المرجعي) (انظر جدول المواد)من الفريزر -20 درجة مئوية وإبقائها في درجة حرارة الغرفة لمدة 20-30 دقيقة للتأكد من ذوبان جميع الكواشف والحمض النووي بشكل كامل. دوامة وتدور لفترة وجيزة إلى أسفل قبل الاستخدام.
  2. قياس تركيز عينات الحمض النووي باستخدام مقياس الطيف الضوئي (انظر جدول المواد). وينبغي أن يكون تركيز الحمض النووي 25 نانوغرام/ميكرولتر؛ تخفيف مع تخفيف عينة إلى التركيز المناسب إذا لزم الأمر.
    ملاحظة: وينبغي استخراج الحمض النووي وتنقيته لإزالة المواد المسببة للتداخل، مثل البروتينات وتركيزات الملح العالية. وينبغي استخدام الحمض النووي غير المتدهور وعالي الجودة في تضخيم وتحليل الـ PCR اللاحق (A260/A280: 1.8-2.0 وA260/A230: >1.0).
  3. تسمية الآبار من لوحة PCR أو أنابيب PCR 0.2 مل لتحديد عينات الحمض النووي المرجعية والمختبرة.
  4. حساب عدد تفاعلات PCR المطلوبة لعينات الاختبار، وعينتين مرجعيتين وعينة تحكم سالبة. إعداد PCR ماجستير ميكس عن طريق إضافة 15 ميكرولتر من مزيج المخزن المؤقت PCR، 2.6 ميكرولتر من عينة مخفف و 0.4 ميكرولتر من البوليمرات لكل رد فعل.
    ملاحظة: عنصر تحكم سالب باستخدام نموذج مخفف ضروري لمراقبة أداء PCR. إعداد المزيج الرئيسي PCR في درجة حرارة الغرفة، لا ماصة على الجليد. مزيج المخزن المؤقت PCR لزج. خلط الأنبوب ثم تدور لفترة وجيزة إلى أسفل قبل الاستخدام.
  5. قم بتدوير المزيج الرئيسي PCR من الخطوة 1.4 لـ 10-20 s والدوران لأسفل. الاستغناء ببطء 18 درجة مئوية من الخليط في كل بئر أو أنبوب.
  6. دوامة وتدور أسفل عينات الحمض النووي. ماصة 2 μL من كل DNA في البئر المناسب أو أنبوب لحجم PCR النهائي من 20 درجة مئوية.
    ملاحظة: يجب أن يكون المبلغ الإجمالي للحمض النووي لكل رد فعل 50-100 نانوغرام. كميات الحمض النووي أكبر من 150 نانوغرام لكل 20 ميكرولتر تفاعل PCR قد يؤدي إلى تضخيم الفقراء من الأليلات تكرار كبيرة. بالنسبة للحمض الأدنى المركز، يمكن استبدال كمية مخفف العينة في المزيج الرئيسي PCR بمحلول الحمض النووي.
  7. ختم لوحة مع لوحة لاصقة السدادة، أو مع قبعات أنبوب.
  8. ضع لوحة PCR المختومة أو الأنابيب في الدراجات الحرارية مع غطاء ساخن. تشغيل البرنامج مع الإعدادات التالية: 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق، تليها 25 دورات من denaturing في 98 درجة مئوية لمدة 35 s، الصلب في 59 درجة مئوية لمدة 35 s، وتمديد في 72 درجة مئوية لمدة 4 دقائق؛ خطوة أخيرة عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
  9. بعد تضخيم PCR، تنقية وتحليل المنتجات على الفور، أو تخزين في +2 إلى +8 درجة مئوية بين عشية وضحاها. بدلا من ذلك، يمكن تخزين المنتج لمدة تصل إلى 30 يوما في -30 إلى -16 درجة مئوية.

2. تنقية منتجات PCR

  1. سخني الحاضنة شاكر إلى 65 درجة مئوية.
  2. بالنسبة لكل تفاعل PCR، أضف 80 ميكرولتر من المخزن المؤقت TE 1x (انظر جدول المواد)إلى 20 ميكرولتر لكل منتج من منتجات PCR من القسم 1.
  3. نقل خليط العينة إلى لوحة تنظيف PCR (انظر جدول المواد)باستخدام ماصة متعددة القنوات.
  4. الحفاظ على لوحة كشف ووضعها في شاكر حاضنة، وحضانة في 65 درجة مئوية في حين يهز في 1200 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق.
  5. بعد الحضانة، تعيين أداة فراغ في 250 مبار (أو 25 كيلوباسكال، 188 ملم زئبق، 7.4 في زئبق) وأسق الحل من خلال مرشح لمدة 15 دقيقة.
  6. تبريد الحاضنة شاكر وصولا الى 25 درجة مئوية.
  7. بعد الطموح الأول، إيقاف تشغيل الفراغ وإضافة 50 درجة مئوية من 1X TE العازلة إلى كل بئر. لا تخلط. قم بتسريع الحل لمدة 10 دقائق باستخدام إعدادات الفراغ في الخطوة 2.5.
  8. تجفيف الجزء السفلي من لوحة فلتر عن طريق الضغط عليه بحزم على كومة من المناشف الورقية.
  9. إضافة 20 درجة مئوية من 1X TE العازلة في المركز السفلي لكل بئر. ضع اللوحة في الحاضنة شاكر وحضانة في 25 درجة مئوية في حين يهز في 1200 دورة في الدقيقة لمدة 5 دقائق.
  10. بعد الحضانة، نقل > 15 درجة مئوية من كل الحمض النووي PCR تنقية من الخطوة 2.9 إلى لوحة PCR 96 جيدا جديدة. يمكن تحليل الحمض النووي النقي مباشرة، أو بدلا من ذلك يمكن تخزينها في -30 إلى -16 درجة مئوية حتى المطلوبة.

3. تجزئة جزء من منتجات PCR

  1. قبل البدء، السماح تركيز صبغ الحمض النووي، مصفوفة هلام الحمض النووي، علامة الحمض النووي، سلم الحمض النووي وعينات الحمض النووي النقي من الخطوة 2 إلى التوازن إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
  2. قم بإعداد محطة الفتيلة.
    1. استبدال الحقنة (انظر جدول المواد)عند استخدام دفعة جديدة من الكواشف.
    2. ضبط لوحة قاعدة، والإفراج عن رافعة مقطع حقنة والانزلاق حتى الموضع العلوي.
  3. بدء تشغيل برنامج التحجيم (انظر جدول المواد)وإعداد مزيج هلام صبغ.
  4. دوامة صبغ التركيز لمدة 10 s وتدور إلى أسفل. إضافة 25 درجة مئوية من الصبغة إلى قارورة مصفوفة هلام. دوامة الحل مختلطة بشكل جيد وتدور إلى أسفل.
    1. نقل مزيج هلام صبغ إلى مرشح تدور. وضع مرشح تدور في جهاز طرد مركزي صغير وتدور لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في 1500 × ز ± 20٪.
      ملاحظة: حماية الحل مع صبغ من الضوء وتخزينها في 4 درجة مئوية بعد الاستخدام. ويمكن استخدام مزيج هلام صبغ لحوالي 15 رقائق مرة واحدة أعدت. السماح لمزيج هلام صبغ لequilibrate إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة في كل مرة قبل الاستخدام.
  5. تحميل مزيج هلام صبغ.
    1. أدخل رقاقة الحمض النووي الجديدة على محطة فتيلة. إضافة 9 ميكرولتر من هلام صبغ مزيج في علامة جيدا مع "G". يرجى التأكد من وضع الغطاس عند علامة 1 مل ثم قم بإغلاق محطة فتيلة.
    2. اضغط على الغطاس حقنة أسفل حتى يتم الاحتفاظ بها من قبل مقطع. انتظر بالضبط 30 s ثم الافراج عن مقطع. انتظر 5 s، ومن ثم سحب ببطء الغطاس مرة أخرى إلى موقف 1 مل.
    3. فتح محطة فتيلة وإضافة 9 ميكرولتر من هلام صبغ مزيج في الآبار ملحوظ مع "G".
  6. إضافة 5 ميكرولتر من علامة في علامة ملحوظ جيدا مع رمز سلم وأيضا إضافة 5 ميكرولتر من علامة في كل من الآبار عينة 12. لا تترك أي آبار فارغة.
  7. إضافة 1 ميكرولتر من سلم الحمض النووي في علامة جيدا مع رمز سلم. إضافة 1 ميكرولتر من منتج PCR (الآبار المستخدمة) من الخطوة 3.1 أو 1 ميكرولتر من المياه النقية جداً (الآبار غير المستخدمة) في كل من الآبار عينة 12. وضع رقاقة أفقيا في محول دوامة خلاط ودوامة لمدة 1 دقيقة في الإعداد المشار إليه (2400 دورة في الدقيقة).
  8. إدراج رقاقة في أداة محلل حيوي وتشغيل رقاقة في الصك في غضون 5 دقائق.
  9. بعد اكتمال عملية الاكتمال، قم بإزالة الشريحة المستخدمة على الفور من الأداة.
  10. إضافة ببطء 350 درجة مئوية من الماء منزوع الأيونات في واحدة من الآبار من منظف القطب الكهربائي. فتح غطاء المحلل الحيوي ووضع منظف القطب في ذلك. أغلق الغطاء واحتضن حوالي 10 s. افتح الغطاء وإزالة منظف القطب الكهربائي. انتظر 10 ق أخرى للسماح للمياه على الأقطاب الكهربائية لتبخر ومن ثم إغلاق الغطاء.

4. تحليل نتائج تغيير حجم الأجزاء

ملاحظة: وينبغي تضخيم العينات المرجعية وتحليلها بواسطة نفس الدورات الحرارية والمحلل الحيوي في نفس الدفعة مع العينات غير المعروفة.

  1. بعد اكتمال تشغيل محلل حيوي تصدير بيانات الذروة من كل تشغيل كملف جدول .csv للتحليل اللاحق.
  2. بدء تشغيل برنامج التحليل وفتح ملف جدول الذروة .csv المصدرة من الخطوة 4.1.
  3. من خلال علامة التبويب قائمة مراقبة الجودة، راجع خط الانحدار المجهز بالنقاط الأربع (كما هو موضح كألماس أزرق على قطعة الأرض) من العينات المرجعية اثنين. يجب أن تكون قيمة R2 لبند الانحدار >0.98 (القيم النموذجية تتجاوز 0.999).
  4. من خلال علامة التبويب القائمة نتائج، تحقق من حجم التكرار لكل عينة يتم رسم طول (طول) جزءها تلقائيًا مقابل منحنى الانحدار الخطي القياسي المشتق من العينات المرجعية. كما يوفر البرنامج تصنيف كل عينة وفقا لإرشادات مختلفة.
  5. من خلال علامة التبويب تصدير القائمة تصدير تقرير النتائج لكل عينة مع تكرار الأرقام والتصنيف التشخيصي، بالإضافة إلى ملخص معلومات العينة وتقرير مراقبة الجودة لكل تشغيل.
    ملاحظة: يسمح برنامج التحليل باستخدام إرشادات التصنيف المخصصة، مثل المبادئ التوجيهية للكلية الأمريكية لعلم الوراثة الطبية (ACMG) أو الجمعية السريرية لعلم الوراثة الجزيئية/الجمعية الأوروبية لعلم الوراثة البشرية (CMGS/ESHG)، بالإضافة إلى التصنيف المحدد مسبقًا معايير.

النتائج

وترد في الشكل1ألف والشكل 1باءعلى التوالي نتائج تغيير حجم العينة المرجعية الأنثوية قبل التحوّل (NA20240، والأحجام المتكررة من 30 و80) والعينة المرجعية الأنثوية الكاملة للطفرة (NA20239، والأحجام المتكررة من 20 و200). بشكل عام، يتم تضمين قمتين علامة (علامة أقل 50 أزواج قاع...

Discussion

FXS هو السبب الثاني الأكثر شيوعا من الإعاقة الذهنية بعد trisomy 21، مما يمثل ما يقرب من نصف التخلف العقلي المرتبطة بـ X30، والتي قد تؤثر على ما يقرب من 1 من كل 4000 ذكر و1 من كل 8000 أنثى. والأهم من ذلك، ما يقرب من 1 من كل 250-1000 الإناث تحمل ما قبل النقوس، وهذا التردد هو 1 في 250-1600 في الذكور

Disclosures

وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

وقد تم دعم هذا البحث بمنح من مشروع إدارة الطوارئ التابع للجنة الوطنية للعلوم والطوارئ (المنحة رقم 81741004)، والمؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية في الصين (المنحة رقم 81860272)، وخطة البحوث الرئيسية لمؤسسة العلوم والتكنولوجيا الإقليمية في غوانغشي ( رقم المنحة AB16380219)، ومنحة مؤسسة ما بعد الدكتوراه الصينية (منحة رقم 2018M630993)، ومؤسسة قوانغشى للعلوم الطبيعية (المنحة رقم 2018GXNSFAA281067).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 0.2 mL PCR tubesAxygenPCR-02D-C
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 1X TE buffer, pH 8.0, Rnase-freeAmbionAM9849
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 2100 Bioanalyzer instrumentAgilentG2939AA
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 96-well PCR PlateThermo FisherAB0800
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Electrode cartridgeAgilentSupplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: IKA vortex mixerAgilentSupplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Sizing software 2100 Expert softwareAgilentSupplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Test chipsAgilentSupplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent DNA 7500 kitAgilent5067-1506For Fragment sizing
Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Ladder (yellow cap)AgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Markers (green cap)AgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA chipsAgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA Dye Concentrate (blue cap)AgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA Gel Matrix Vial (red cap)AgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Electrode CleanerAgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Spin FilterAgilentSupplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: SyringeAgilentSupplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Chip priming stationAgilent5065-4401Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Cubee Mini-centrifugeGeneReachaqbd-i
Filter plate vacuum Manifold: MultiScreenHTS Vacuum ManifoldMerck MilliporeMSVMHTS00Vacuum instrument for Filter plate vacuum Manifold for PCR product purification
Filter plate vacuum Manifold: Silicone stopperMerck MilliporeXX2004718Filter plate vacuum Manifold
Filter plate vacuum Manifold: Vacuum pumpMerck MilliporeWP6122050Filter plate vacuum Manifold
Filter plate vacuum Manifold: Waste collection vesselMerck MilliporeXX1004705Filter plate vacuum Manifold
FragilEase Fragile X PCR kitPerkinElmer3101-0010For PCR amplification
FragilEase Fragile X PCR kit: Sample DiluentPerkinElmerIn kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 )
FragilEase PCR Buffer mixPerkinElmerIn kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 ), containing primers. Primer sequences: TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCA (forward)
FAM-AAGCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCC (reverse)
FragilEase PolymerasePerkinElmerIn kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 )
FraXsoft analysis softwarePerkinElmer
NanoDrop ND-2000 SpectrophotometerThermo Fisher
Paper towels
PCR clean up plate: NucleoFast 96 PCR plateMACHEREY-NAGEL743100
reference DNA sampleCoriellNA20240 & NA20239
S1000 96-well Thermal CyclerBio-Rad1852196This can be replaced by other Thermal Cyclers (eg. Veriti™ 96-Well Thermal Cycler, Applied Biosystems, catalog number: 4375786)
TriNEST Incubator/Shaker instrumentPerkinElmer1296-0050
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled WaterLife Technologies10977015For 2100 Bioanalyzer electrode cleaning
Vortex-Genie 2Scientific IndustriesSI-0256 (Model G560E)Conventional vortex mixer

References

  1. Verkerk, A. J., et al. Identification of a gene (FMR-1) containing a CGG repeat coincident with a breakpoint cluster region exhibiting length variation in fragile X syndrome. Cell. 65, 905-914 (1991).
  2. Fu, Y. H., et al. Variation of the CGG repeat at the fragile X site results in genetic instability: resolution of the Sherman paradox. Cell. 67, 1047-1058 (1991).
  3. Antar, L. N., Li, C., Zhang, H., Carroll, R. C., Bassell, G. J. Local functions for FMRP in axon growth cone motility and activity-dependent regulation of filopodia and spine synapses. Molecular and Cellular Neurosciences. 32, 37-48 (2006).
  4. Didiot, M. C., et al. The G-quartet containing FMRP binding site in FMR1 mRNA is a potent exonic splicing enhancer. Nucleic Acids Research. 36, 4902-4912 (2008).
  5. Bechara, E. G., et al. A novel function for fragile X mental retardation protein in translational activation. PLoS Biology. 7, e16 (2009).
  6. Ascano, M., et al. FMRP targets distinct mRNA sequence elements to regulate protein expression. Nature. 492, 382-386 (2012).
  7. Kenny, P. J., et al. MOV10 and FMRP regulate AGO2 association with microRNA recognition elements. Cell Reports. 9, 1729-1741 (2014).
  8. Oberle, I., et al. Instability of a 550-base pair DNA segment and abnormal methylation in fragile X syndrome. Science. 252, 1097-1102 (1991).
  9. Hagerman, R., Lauterborn, J., Au, J., Berry-Kravis, E. Fragile X syndrome and targeted treatment trials. Results and Problems in Cell Differentiation. 54, 297-335 (2012).
  10. Hatton, D. D., et al. Autistic behavior in children with fragile X syndrome: prevalence, stability, and the impact of FMRP. American Journal of Medical Genetics Part A. 140A, 1804-1813 (2006).
  11. Mattei, J. F., Mattei, M. G., Aumeras, C., Auger, M., Giraud, F. X-linked mental retardation with the fragile X. A study of 15 families. Human Genetics. 59, 281-289 (1981).
  12. Backes, M., et al. Cognitive and behavioral profile of fragile X boys: correlations to molecular data. American Journal of Medical Genetics. 95, 150-156 (2000).
  13. Nolin, S. L., et al. Fragile X analysis of 1112 prenatal samples from 1991 to 2010. Prenatal Diagnosis. 31, 925-931 (2011).
  14. Nolin, S. L., et al. Expansion of the fragile X CGG repeat in females with premutation or intermediate alleles. American Journal of Human Genetics. 72, 454-464 (2003).
  15. Fernandez-Carvajal, I., et al. Expansion of an FMR1 grey-zone allele to a full mutation in two generations. Journal of Molecular Diagnostics. 11, 306-310 (2009).
  16. Terracciano, A., et al. Expansion to full mutation of a FMR1 intermediate allele over two generations. European Journal of Human Genetics. 12, 333-336 (2004).
  17. Garcia-Arocena, D., Hagerman, P. J. Advances in understanding the molecular basis of FXTAS. Human Molecular Genetics. 19, R83-R89 (2010).
  18. Juncos, J. L., et al. New clinical findings in the fragile X-associated tremor ataxia syndrome (FXTAS). Neurogenetics. 12, 123-135 (2011).
  19. Hagerman, R. J., et al. Intention tremor, parkinsonism, and generalized brain atrophy in male carriers of fragile X. Neurology. 57, 127-130 (2001).
  20. Conway, G. S. Premature ovarian failure and FMR1 gene mutations: an update. Annales d'endocrinologie. 71, 215-217 (2010).
  21. Conway, G. S., Hettiarachchi, S., Murray, A., Jacobs, P. A. Fragile X premutations in familial premature ovarian failure. Lancet. 346, 309-310 (1995).
  22. Van Esch, H., Buekenhout, L., Race, V., Matthijs, G. Very early premature ovarian failure in two sisters compound heterozygous for the FMR1 premutation. European Journal of Medical Genetics. 52, 37-40 (2009).
  23. Bourgeois, J. A., et al. A review of fragile X premutation disorders: expanding the psychiatric perspective. Journal of Clinical Psychiatry. 70, 852-862 (2009).
  24. Farzin, F., et al. Autism spectrum disorders and attention-deficit/hyperactivity disorder in boys with the fragile X premutation. Journal of Developmental and Behavioral Pediatrics. 27, S137-S144 (2006).
  25. Hantash, F. M., et al. FMR1 premutation carrier frequency in patients undergoing routine population-based carrier screening: insights into the prevalence of fragile X syndrome, fragile X-associated tremor/ataxia syndrome, and fragile X-associated primary ovarian insufficiency in the United States. Genetics in Medicine. 13, 39-45 (2011).
  26. Kraan, C. M., et al. FMR1 allele size distribution in 35,000 males and females: a comparison of developmental delay and general population cohorts. Genetics in Medicine. 20 (12), 1627-1634 (2018).
  27. Saul, R. A., Tarleton, J. C. FMR1-Related Disorders. GeneReviews. , (2012).
  28. Amos Wilson, J., et al. Consensus characterization of 16 FMR1 reference materials: a consortium study. Journal of Molecular Diagnostics. 10, 2-12 (2008).
  29. Kwok, Y. K., et al. Validation of a robust PCR-based assay for quantifying fragile X CGG repeats. Clinica Chimica Acta. 456, 137-143 (2016).
  30. Rousseau, F., Rouillard, P., Morel, M. L., Khandjian, E. W., Morgan, K. Prevalence of carriers of premutation-size alleles of the FMRI gene--and implications for the population genetics of the fragile X syndrome. American Journal of Human Genetics. 57, 1006-1018 (1995).
  31. Tassone, F., et al. FMR1 CGG allele size and prevalence ascertained through newborn screening in the United States. Genome Medicine. 4, 100 (2012).
  32. Dombrowski, C., et al. Premutation and intermediate-size FMR1 alleles in 10572 males from the general population: loss of an AGG interruption is a late event in the generation of fragile X syndrome alleles. Human Molecular Genetics. 11, 371-378 (2002).
  33. Cronister, A., Teicher, J., Rohlfs, E. M., Donnenfeld, A., Hallam, S. Prevalence and instability of fragile X alleles: implications for offering fragile X prenatal diagnosis. Obstetrics and Gynecology. 111, 596-601 (2008).
  34. Hayward, B. E., Kumari, D., Usdin, K. Recent advances in assays for the fragile X-related disorders. Human Genetics. 136, 1313-1327 (2017).
  35. Seltzer, M. M., et al. Prevalence of CGG expansions of the FMR1 gene in a US population-based sample. American Journal of Medical Genetics Part B Neuropsychiatrics Genetics. 259B, 589-597 (2012).
  36. Hayward, B. E., Usdin, K. Assays for determining repeat number, methylation status, and AGG interruptions in the Fragile X-related disorders. Methods in Molecular Biology. , 49-59 (1942).
  37. Orrico, A., et al. Mosaicism for full mutation and normal-sized allele of the FMR1 gene: a new case. American Journal of Medical Genetics. 78, 341-344 (1998).
  38. Schmucker, B., Seidel, J. Mosaicism for a full mutation and a normal size allele in two fragile X males. American Journal of Medical Genetics. 84, 221-225 (1999).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

151X 1X

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved