Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מדויק וחזק מבוסס תגובת שרשרת פולימראז ' המבוססת על ככמת ציטוסינוס-גואן ין-גואנין trinucleotide גאות חוזר על הפיגור שברירי X 1 גן מקלה אבחנה מולקולרית והקרנה של תסמונת X שביר והקשורות X שברירי הפרעות עם הזמן להסתובב קצר והשקעה בציוד.

Abstract

תסמונת X שביר (FXS) והפרעות הקשורות נגרמות על ידי התרחבות של ציטוסין-גואן-גואן-גואנין (CGG) טריטוקלאואדה חוזר באזור 5 ' בלתי מתורגם (UTR) של פיגור שברירי X 1 (FMR1) גן יזם. מקובל, ניתוח מקטע של אלקטרופורזה קפילר על מנתח גנטי משמש לשינוי גודל CGG חוזר של FMR1, אך ניתוח כתמי דרומי נוסף נדרש למדידה מדויקת כאשר מספר החזרה גבוה מ-200. כאן, אנו מציגים שיטה מדויקת ואיתנה של תגובת שרשרת פולימראז (PCR) לקוונפיקציה של ה-CGG חוזר על FMR1. השלב הראשון של בדיקה זו הוא ה-PCR הגברה של רצפי חוזר ב 5 ' UTR של FMR1 יזם באמצעות ערכת ה-pcr X שביר, ואחריו טיהור של מוצרי ה-PCR ושינוי גודל על מכשיר אלקטרופורזה מיקרופלואידיסי נימי, ו פרשנות הבאה של מספר ה-CGG חוזר על-ידי התייחסות לתקנים עם הידוע חוזר באמצעות תוכנת הניתוח. שיטת ה-PCR מבוססת ומסוגלת לזהות את הטווח המלא של CGG חוזר על FMR1 יזמים, כולל אלה עם מספר חוזר של יותר מ 200 (מסווג כמוטציה מלאה), 55 כדי 200 (premutation), 46 ל54 (ביניים), ו 10 כדי 45 (רגיל). זוהי שיטה חסכונית המאפשרת סיווג של FXS ו-X שברירי הפרעות הקשורות עם החוסן וזמן דיווח מהיר.

Introduction

תסמונת X שביר (FXS) ושברירי X הפרעות הקשורות, למשל, רעד תסמונת אטקסיה (FX-TAS), ואת אי ספיקה השחלות הראשונית (FX-פוי) נגרמים בעיקר על ידי ציטוסין-גואן-ין (CGG) טריאוקליאואס חוזר על התרחבות 5 ' לא תורגם אזור (UTR) של הפיגור שברירי X-1 (FMR1) גן על xq 27.31,2. חלבון FMR1 מקודד (FMRP) הוא חלבון רב-תפקודי מסוג RNA-binding המשויכים להתפתחות העצבית והפלסטיות הסינפטית על-ידי ויסות שילוב אלטרנטיבי, יציבות, והובלת הדנדריטים של mrna או סינתזה של מודליטינג של חלבונים חלקיים מתוך הסינפטית3,4,5,6,7.

הווריאציה הדינמית עם גודל החזרה CGG של > 200 מתוארת כמוטציה מלאה, אשר מעוררת את ההיפרלציה החריגה ובעקבות השתקה של FMR1 יזם8. העדר או חוסר של חלבון FMRP משבש את פיתוח עצבי נורמלי גורם FXS9, מאופיין בסימפטומים קליניים שונים, כולל מתון עד מוגבלות אינטלקטואלית חמורה, עיכוב התפתחותי, התנהגויות היפראקטיביות, קשרים עניים וביטויים אוטיסטים10,11,12. המצגת אצל הנקבה FXS לחולי הוא בדרך כלל מתון יותר מזה אצל זכרים. גודל החזרה CGG החל מ 55 אל 200 ו 45 כדי 54 מסווגים כסטטוס מוטציה וביניים, בהתאמה. בשל הרמה הגבוהה של חוסר יציבות, גודל החזרה cgg ב מוטציה או ביניים אלל ככל הנראה מתרחב כאשר מועברים מהורים לצאצאים13,14. לפיכך, נושאות עם אללים מוטציות בסיכון גבוה של הילדים מושפעים FXS בגלל התרחבות חוזר, ובמקרים מסוימים, אללים ביניים יכול להרחיב את גודל החזרה שלהם לטווח מוטציה מלא על פני שני דורות15, . שישה עשרה יתר על כן, זכרים עם premutation גם להעביר סיכון מוגבר לפתח מאוחר התפרצות FX-TAS17,18,19, בעוד נקבות premutation וטציה הם מראש עבור שני fx-TAS ו-fx-פוי20, 21,22. לאחרונה, דווח כי הפרעות הספקטרום האוטיסטי עם עיכוב התפתחותי ובעיות בהתנהגויות חברתיות מוצגות אצל ילדים עם premutation אללים 23,24.

כדי לקבוע את גודל החזרה cgg מדויק הוא של משמעות רבה עבור סיווג וחיזוי של FXS ו-X שברירי הפרעות הקשורות25,26. מבחינה היסטורית, התגובה הספציפית של CGG שרשרת פולימראז (PCR) עם שינוי גודל בתוספת ניתוח הכתם הדרומי היה תקן זהב עבור פרופיל מולקולרי של FMR1 cgg חוזר27. עם זאת, ה-PCR הספציפי המסורתי הוא פחות רגיש למוטציות גדולות עם יותר מ 100 כדי 130 חוזר ואינו מסוגל להגברה מוטציות מלאות27,28. יתר על כן, אלקטרופורזה קפילר על מנתח גנטי מסורתי לשינוי גודל נכשל לזהות FMR1 PCR מוצרים עם יותר מ-200 cgg חוזר. ניתוח הכתם הדרומי מאפשר הבידול של מגוון רחב יותר של גודל חוזר, מהרגיל למספרים חוזרים מוטציה מלאה, והיה בשימוש נרחב לאישור מוטציות מלאות (אצל גברים) וההבחנה heterozygous אללים עם מוטציה מלאה מ כנראה homozygous אללים עם גדלי חזרה נורמליים (אצל נקבות). עם זאת, הרזולוציה עבור כימות החזרה מוגבלת. חשוב מכך, אסטרטגיית הבדיקה של שלב אחר שלב היא אינטנסיבית לעבודה, גוזלת זמן וחסכונית.

כאן, אנו מציגים שיטה מדויקת ואיתנה המבוססת על PCR לכמת של CGG חוזר על FMR1. השלב הראשון של מבחן זה הוא הגברה PCR של רצפי חוזר ב 5 ' UTR של יזם FMR1 באמצעות ערכת X PCR שביר. מוצרי ה-PCR מטוהרים ושינוי גודל מבוצע על-ידי מכשיר אלקטרופורזה במיקרופלואידיסי, והפרשנות העוקבת של מספר cgg חוזרת באמצעות תוכנת הניתוח על-ידי התייחסות לתקנים הידועים ומבוססים על ה רציונל כי אורך קטע ה-PCR פרופורציונלי באופן ישיר למספר החזרה של CGG. מערכת ה-PCR כוללת ריאגנטים המקל על הגברה של האזור הגדול ביותר במערכת האנטי-GC העשיר. שיטת ה-PCR מבוססת ומסוגלת לזהות את כל הטווחים של CGG חוזר על FMR1 יזמים. זוהי שיטה חסכונית שיכולה למצוא יישום רחב באבחנה מולקולרית והקרנת של FXS ו-X שברירי הפרעות הקשורות עם פחות סיבוב הזמן וההשקעה בציוד ולכן, יכול להיות מנוצל בספקטרום רחב של קליני מעבדות.

Protocol

אישור מוסרי הוענק על ידי האוניברסיטה הסינית המשותפת של הונג קונג – שטחים חדשים באשכול המחקר הקליני של הטריטוריות החדשות ועדת האתיקה (מספר אסמכתא: 2013.055)

1. הגברה הPCR

  1. לפני תחילת, להסיר את ערבוב מאגר ה-PCR, לדוגמה מדלל ו-DNA דגימות (שניהם DNA בדיקה והתייחסות) (לראות את הטבלה של חומרים) מ-20 ° c מקפיא ולשמור אותם בטמפרטורת החדר עבור 20 – 30 דקות כדי לוודא כל ריאגנטים ו-DNA הם הופלו במלואו. מערבולת ולקצר לסובב למטה לפני השימוש.
  2. מדוד את הריכוז של דגימות ה-DNA באמצעות ספקטרוסקופיה (ראה טבלת חומרים). ריכוז ה-DNA צריך להיות 25 ng/μL; לדלל עם דגימה מדלל לריכוז המתאים אם נדרש.
    הערה: יש לחלץ את הדנ א ולטהר אותו כדי להסיר חומרים מפריעים, כגון חלבונים וריכוזים גבוהים של מלח. לא מושפל, DNA באיכות גבוהה צריך לשמש עבור הגברה וניתוח של PCR הבאים (A260/A280:1.8 – 2.0 ו A260/A230: > 1.0).
  3. תוויות בארות של צלחת PCR או 0.2 mL PCR צינורות כדי לזהות התייחסות דגימות DNA נבדק.
  4. חשב את מספר תגובות ה-PCR הנדרשות לדגימות הבדיקה, 2 דוגמאות התייחסות ודגימת שליטה שלילית. הכנת מיקס מאסטר PCR על ידי הוספת 15 μL של ערבוב מאגר PCR, 2.6 μL של לדוגמה דילול ו 0.4 μL של פולימראז עבור כל תגובה.
    הערה: שליטה שלילית באמצעות מדלל דגימה חיונית כדי לנטר את ביצועי ה-PCR. הכינו את המיקס הראשי של ה-PCR בטמפרטורת החדר, אל פיפטה על הקרח. . שילוב מאגר ה-PCR הוא צמיגי ערבב את השפופרת ולאחר מכן הסתובב בקצרה לפני השימוש.
  5. מערבולת מאסטר ה-PCR ערבוב משלב 1.4 עבור 10 – 20 s ו ספין למטה. מוותר באיטיות על 18 μL של התערובת לתוך כל טוב או צינור.
  6. וורטקס ולסובב. את דגימות הדי. אנ. איי פיפטה 2 μL של כל דנ א לתוך הבאר המתאים או צינור לנפח PCR הסופי של 20 μL. מערבבים על ידי ליטוף למעלה ולמטה 5 פעמים.
    הערה: הסכום הכולל של הדנ א לכל תגובה צריך להיות 50 – 100 ng. כמויות ה-DNA גדול יותר מ 150 ng לתוך 20 μL התגובה הPCR עלולה לגרום הגברה נמוכה של האללים לחזור גדול. עבור DNAs נמוך מרוכז, כמות מדלל לדוגמה ב-PCR לערבב מאסטר ניתן להחליף על ידי פתרון DNA.
  7. חותם את הצלחת עם איטום לוחית דבק, או עם כובעי צינור.
  8. מניחים את לוחית ה-PCR האטומה או את החצוצרות בתוך הציקלייר התרמי עם מכסה מחומם. הפעל את התוכנית עם ההגדרות הבאות: 95 ° c עבור 5 דקות, ואחריו 25 מחזורים של הרפתקאות ב 98 ° צ' עבור 35 s, ריפוי ב 59 ° c עבור 35 s, ואת השלוחה ב 72 ° c עבור 4 דקות; צעד אחרון ב 72 ° c עבור 10 דקות. החזק את מוצרי ה-PCR ב-4 ° c בציקלייר עד להסרת עיבוד נוסף.
  9. לאחר הגברה, לטהר ולנתח את המוצרים מיד, או לאחסן ב + 2 עד 8 ° c בלילה. לחילופין, ניתן לאחסן את המוצר עד 30 יום ב-30 עד 16 ° c.

2. טיהור מוצרי ה-PCR

  1. מחממים את שייקר החממה עד 65 ° c.
  2. עבור כל תגובה PCR, להוסיף 80 μL של מאגר 1x TE (לראות את הטבלה של חומרים) ל 20 μl של כל מוצר ה-pcr מסעיף 1.
  3. העבר את התערובת לדוגמה לצלחת הניקוי של ה-PCR (ראה טבלת חומרים) באמצעות פיפטה רב-ערוצית.
  4. לשמור על הצלחת נחשף ולמקם אותו לתוך שייקר חממה, ו דגירה ב 65 ° צ' בעוד רועד ב 1,200 rpm עבור 10 דקות.
  5. לאחר הדגירה, להגדיר את כלי ואקום ב 250 mbar (או 25 kPa, 188 mmHg, 7.4 ב Hg) ו לשאוב את הפתרון דרך המסנן עבור 15 דקות.. וולס לא צריך להישאר נוזלי
  6. מצננים את שייקר החממה עד 25 ° c.
  7. לאחר השאיפה הראשונה, לכבות את הוואקום ולהוסיף 50 μL של מאגר 1x TE לכל טוב. אל תערבב. לשאוב את הפתרון עבור 10 דקות באמצעות הגדרות ואקום בשלב 2.5.
  8. נגב את תחתית לוחית הסינון על-ידי לחיצה בחוזקה על ערימת מגבות נייר.
  9. הוסף 20 μL של מאגר 1 x TE למרכז התחתון של כל באר. מניחים את הצלחת בשייקר החממה והדגירה ב -25 ° c תוך כדי טלטול ב 1,200 rpm עבור 5 דקות.
  10. לאחר הדגירה, להעביר > 15 μL של כל ה-DNA מטוהרים של PCR משלב 2.9 לצלחת חדש 96-היטב PCR. את הדנ א הטהור ניתן לנתח ישירות, או לחילופין ניתן לאחסן ב-30 עד 16 ° צ' עד הנדרש.

3. שינוי גודל של מוצרי PCR

  1. לפני ההתחלה, לאפשר להתרכז לצבוע DNA, DNA ג'ל מטריצה, סמן ה-DNA, סולם DNA ומטוהרים דגימות DNA משלב 2 כדי לequiלטמפרטורה החדר עבור 30 דקות.
  2. . הגדר את תחנת הקרקע
    1. החלף את המזרק (ראה טבלת חומרים) בעת שימוש בקבוצה חדשה של ריאגנטים.
    2. כוונן את לוח הבסיס, ושחרר את המנוף של קליפ המזרק והחלק אותו למצב העליון.
  3. הפעל את שינוי הגודל של תוכנה (ראה טבלת חומרים) ולהכין את תערובת ג'ל צבע.
  4. צבע מערבולת להתרכז 10 s ו ספין למטה. הוסף 25 μL של הצבע לבקבוקון מטריצת ג'ל. מערבולת הפתרון המעורב היטב ולהסתובב.
    1. העבר את תערובת ג'ל-צבע למסנן ספין. מניחים את מסנן ספין ב מיקרוצנטריפוגה ו ספין עבור 10 דקות בטמפרטורת החדר ב 1,500 x g ± 20%.
      הערה: הגן על הפתרון באמצעות צבע מאור ואחסן ב-4 ° צ' לאחר השימוש. תערובת ג'ל צבע ניתן להשתמש במשך כ 15 צ'יפס שהוכנו פעם אחת. הניחו לתערובת הג'ל לערבב את טמפרטורת החדר במשך 30 דקות בכל פעם לפני השימוש.
  5. לטעון את מיקס צבע ג'ל.
    1. הכנס שבב די. אן. איי חדש. בתחנת הקרקע הוסף 9 μL של תערובת ג'ל לצבע לתוך היטב מסומן עם "G". נא ודא שבוכנה ממוקמת בסימן של 1 מ"ל ולאחר מכן סגור את תחנת הקרקע.
    2. לחץ על המזרק עד שהוא מוחזק על-ידי הקליפ. לחכות בדיוק 30 ואז לשחרר את הקליפ. לחכות 5 s, ולאחר מכן לאט למשוך את הבוכנה בחזרה 1 mL מיקום.
    3. פתחו את תחנת הקרקע והוסיפו 9 μL של תערובת ג'ל לצבע לתוך הבארות המסומנות ב-"G".
  6. הוסף 5 μL של סמן לתוך היטב מסומן עם סמל הסולם וגם להוסיף 5 μL של סמן לתוך כל 12 בארות לדוגמה. . אל תשאירו בארות ריקות
  7. הוסף 1 μL של סולם DNA לתוך הבאר מסומן עם סמל הסולם. הוסף 1 μL של מוצר ה-PCR (בארות משומשים) משלב 3.1 או 1 μL של מים באולטרסאונד (בארות שאינן בשימוש) לכל אחת מ -12 בארות המדגם. לשים את השבב אופקית במתאם של מערבל מערבולת ומערבולת עבור 1 דקות בהגדרה המצוין (2,400 rpm).
  8. הכנס את השבב בכלי הביומנתח והפעל את השבב בתוך 5 דקות.
  9. לאחר שהבקרה תושלם, הסר מיד את השבב שבשימוש מכלי הנגינה.
  10. באיטיות להוסיף 350 μL של מים מפוהים לתוך אחת הבארות של מנקה האלקטרודה. פתחו את המכסה של הביומנתח והניחו את מנקה האלקטרודות לתוכו. סגור את המכסה ואת הדגירה עבור 10 s. פתח את המכסה ולהסיר את מנקה האלקטרודה. לחכות עוד 10 s כדי לאפשר את המים על האלקטרודות להתאדות ולאחר מכן לסגור את המכסה.

4. ניתוח תוצאות שינוי גודל הקטע

הערה: דגימות התייחסות צריך להיות מוגבר ומנותח על ידי הציקלer תרמית אותו bioanalyzer באותה אצווה עם דגימות לא ידוע.

  1. לאחר שהפעלת bioanalyzer משלימה, יצא את נתוני השיא מכל הפעלה כקובץ בטבלת csv לצורך הניתוח העוקב.
  2. הפעל את תוכנת הניתוח ופתח את קובץ השיא מיוצא של הטבלה. csv משלב 4.1.
  3. באמצעות הכרטיסייה תפריט QC , סקור את קו הרגרסיה המצויד בארבע הנקודות (המוצגות כיהלומים כחולים על המגרש) משתי דגימות הייחוס. ערך R2 של קו הרגרסיה אמור להיות > 0.98 (ערכים טיפוסיים חורגים מ-0.999).
  4. באמצעות הכרטיסיה תפריט תוצאות , בדוק את גודל החזרה של כל מדגם שאורכם (s) של הקטעים מותווים באופן אוטומטי מול עקומת הרגרסיה הליניארית הנגזרת מדגימות הייחוס. התוכנה גם מספקת את הסיווג של כל מדגם בהתאם להנחיות שונות.
  5. באמצעות הכרטיסיה תפריט ייצוא , יצא את דוח התוצאה עבור כל מדגם עם מספרי החזרה והסיווג האבחוני, כמו גם סיכום של מידע לדוגמה ודוח QC עבור כל הפעלה.
    הערה: ניתוח תוכנה מאפשר את השימוש בהנחיות סיווג מותאם אישית, כגון המכללה האמריקנית לגנטיקה רפואית (ACMG) או החברה המולקולרית גנטיקה מולקולרית/החברה האירופית של גנטיקה אנושית (CMGS/אשתג) הנחיות, כמו גם סיווג מוגדר מראש קריטריונים.

תוצאות

התוצאות לשינוי גודל של התייחסות נקבה טרום מוטציה מדגם (NA20240, לחזור על גודל של 30 ו 80) ואת מוטציה מלאה נקבה התייחסות מדגם (NA20239, גודל חוזר של 20 ו 200) מוצגים באיור 1a ואיור 1a, בהתאמה. בדרך כלל, שני פסגות סמן (נמוך סמן 50 בסיס זוגות [bp] ו-סמן העליון 10,380 bp) נכללים בפרופיל גו...

Discussion

FXS הוא הגורם השכיח ביותר השני של ליקוי אינטלקטואלי לאחר טריזומיה 21, חשבונאות עבור כמעט אחד מחצית של פיגור שכלי מנטלי של X30, אשר עשוי להשפיע על כ 1 ב 4,000 זכרים 1 ב 8,000 נקבות. חשוב יותר, כמעט 1 ב 250 – 1000 הנקבות לשאת premutation, ואת התדר הזה הוא 1 ב 250 – 1600 בזכרים26,31...

Disclosures

. למחברים אין מה לגלות

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי מענקים NSFC ניהול חירום הפרויקט (גרנט No. 81741004), הארגון הלאומי למדע הטבע של סין (גרנט No. 81860272), תוכנית המחקר העיקרי של המדע המחוזי הקרן טכנולוגיה של גואנגשי ( . גרנט לא AB16380219), בקרן המדע הפוסט-דוקטורט של סין (גרנט No. 2018M630993), והקרן למדע הטבע גואנגשי (מענק No. 2018GXNSFAA281067).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 0.2 mL PCR tubesAxygenPCR-02D-C
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 1X TE buffer, pH 8.0, Rnase-freeAmbionAM9849
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 2100 Bioanalyzer instrumentAgilentG2939AA
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: 96-well PCR PlateThermo FisherAB0800
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Electrode cartridgeAgilentSupplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: IKA vortex mixerAgilentSupplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Sizing software 2100 Expert softwareAgilentSupplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent 2100 Bioanalyzer instrument: Test chipsAgilentSupplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Agilent DNA 7500 kitAgilent5067-1506For Fragment sizing
Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Ladder (yellow cap)AgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA 7500 Markers (green cap)AgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA chipsAgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA Dye Concentrate (blue cap)AgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: DNA Gel Matrix Vial (red cap)AgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Electrode CleanerAgilentIn kit: Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: Spin FilterAgilentSupplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Agilent DNA 7500 kit: SyringeAgilentSupplies of Agilent DNA 7500 kit (catalog number: 5067-1506)
Chip priming stationAgilent5065-4401Supplies equipment of the 2100 Bioanayzer instrument
Cubee Mini-centrifugeGeneReachaqbd-i
Filter plate vacuum Manifold: MultiScreenHTS Vacuum ManifoldMerck MilliporeMSVMHTS00Vacuum instrument for Filter plate vacuum Manifold for PCR product purification
Filter plate vacuum Manifold: Silicone stopperMerck MilliporeXX2004718Filter plate vacuum Manifold
Filter plate vacuum Manifold: Vacuum pumpMerck MilliporeWP6122050Filter plate vacuum Manifold
Filter plate vacuum Manifold: Waste collection vesselMerck MilliporeXX1004705Filter plate vacuum Manifold
FragilEase Fragile X PCR kitPerkinElmer3101-0010For PCR amplification
FragilEase Fragile X PCR kit: Sample DiluentPerkinElmerIn kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 )
FragilEase PCR Buffer mixPerkinElmerIn kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 ), containing primers. Primer sequences: TCAGGCGCTCAGCTCCGTTTCGGTTTCA (forward)
FAM-AAGCGCCATTGGAGCCCCGCACTTCC (reverse)
FragilEase PolymerasePerkinElmerIn kit: FragilEase Fragile X PCR kit (catalog number: 3101-0010 )
FraXsoft analysis softwarePerkinElmer
NanoDrop ND-2000 SpectrophotometerThermo Fisher
Paper towels
PCR clean up plate: NucleoFast 96 PCR plateMACHEREY-NAGEL743100
reference DNA sampleCoriellNA20240 & NA20239
S1000 96-well Thermal CyclerBio-Rad1852196This can be replaced by other Thermal Cyclers (eg. Veriti™ 96-Well Thermal Cycler, Applied Biosystems, catalog number: 4375786)
TriNEST Incubator/Shaker instrumentPerkinElmer1296-0050
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled WaterLife Technologies10977015For 2100 Bioanalyzer electrode cleaning
Vortex-Genie 2Scientific IndustriesSI-0256 (Model G560E)Conventional vortex mixer

References

  1. Verkerk, A. J., et al. Identification of a gene (FMR-1) containing a CGG repeat coincident with a breakpoint cluster region exhibiting length variation in fragile X syndrome. Cell. 65, 905-914 (1991).
  2. Fu, Y. H., et al. Variation of the CGG repeat at the fragile X site results in genetic instability: resolution of the Sherman paradox. Cell. 67, 1047-1058 (1991).
  3. Antar, L. N., Li, C., Zhang, H., Carroll, R. C., Bassell, G. J. Local functions for FMRP in axon growth cone motility and activity-dependent regulation of filopodia and spine synapses. Molecular and Cellular Neurosciences. 32, 37-48 (2006).
  4. Didiot, M. C., et al. The G-quartet containing FMRP binding site in FMR1 mRNA is a potent exonic splicing enhancer. Nucleic Acids Research. 36, 4902-4912 (2008).
  5. Bechara, E. G., et al. A novel function for fragile X mental retardation protein in translational activation. PLoS Biology. 7, e16 (2009).
  6. Ascano, M., et al. FMRP targets distinct mRNA sequence elements to regulate protein expression. Nature. 492, 382-386 (2012).
  7. Kenny, P. J., et al. MOV10 and FMRP regulate AGO2 association with microRNA recognition elements. Cell Reports. 9, 1729-1741 (2014).
  8. Oberle, I., et al. Instability of a 550-base pair DNA segment and abnormal methylation in fragile X syndrome. Science. 252, 1097-1102 (1991).
  9. Hagerman, R., Lauterborn, J., Au, J., Berry-Kravis, E. Fragile X syndrome and targeted treatment trials. Results and Problems in Cell Differentiation. 54, 297-335 (2012).
  10. Hatton, D. D., et al. Autistic behavior in children with fragile X syndrome: prevalence, stability, and the impact of FMRP. American Journal of Medical Genetics Part A. 140A, 1804-1813 (2006).
  11. Mattei, J. F., Mattei, M. G., Aumeras, C., Auger, M., Giraud, F. X-linked mental retardation with the fragile X. A study of 15 families. Human Genetics. 59, 281-289 (1981).
  12. Backes, M., et al. Cognitive and behavioral profile of fragile X boys: correlations to molecular data. American Journal of Medical Genetics. 95, 150-156 (2000).
  13. Nolin, S. L., et al. Fragile X analysis of 1112 prenatal samples from 1991 to 2010. Prenatal Diagnosis. 31, 925-931 (2011).
  14. Nolin, S. L., et al. Expansion of the fragile X CGG repeat in females with premutation or intermediate alleles. American Journal of Human Genetics. 72, 454-464 (2003).
  15. Fernandez-Carvajal, I., et al. Expansion of an FMR1 grey-zone allele to a full mutation in two generations. Journal of Molecular Diagnostics. 11, 306-310 (2009).
  16. Terracciano, A., et al. Expansion to full mutation of a FMR1 intermediate allele over two generations. European Journal of Human Genetics. 12, 333-336 (2004).
  17. Garcia-Arocena, D., Hagerman, P. J. Advances in understanding the molecular basis of FXTAS. Human Molecular Genetics. 19, R83-R89 (2010).
  18. Juncos, J. L., et al. New clinical findings in the fragile X-associated tremor ataxia syndrome (FXTAS). Neurogenetics. 12, 123-135 (2011).
  19. Hagerman, R. J., et al. Intention tremor, parkinsonism, and generalized brain atrophy in male carriers of fragile X. Neurology. 57, 127-130 (2001).
  20. Conway, G. S. Premature ovarian failure and FMR1 gene mutations: an update. Annales d'endocrinologie. 71, 215-217 (2010).
  21. Conway, G. S., Hettiarachchi, S., Murray, A., Jacobs, P. A. Fragile X premutations in familial premature ovarian failure. Lancet. 346, 309-310 (1995).
  22. Van Esch, H., Buekenhout, L., Race, V., Matthijs, G. Very early premature ovarian failure in two sisters compound heterozygous for the FMR1 premutation. European Journal of Medical Genetics. 52, 37-40 (2009).
  23. Bourgeois, J. A., et al. A review of fragile X premutation disorders: expanding the psychiatric perspective. Journal of Clinical Psychiatry. 70, 852-862 (2009).
  24. Farzin, F., et al. Autism spectrum disorders and attention-deficit/hyperactivity disorder in boys with the fragile X premutation. Journal of Developmental and Behavioral Pediatrics. 27, S137-S144 (2006).
  25. Hantash, F. M., et al. FMR1 premutation carrier frequency in patients undergoing routine population-based carrier screening: insights into the prevalence of fragile X syndrome, fragile X-associated tremor/ataxia syndrome, and fragile X-associated primary ovarian insufficiency in the United States. Genetics in Medicine. 13, 39-45 (2011).
  26. Kraan, C. M., et al. FMR1 allele size distribution in 35,000 males and females: a comparison of developmental delay and general population cohorts. Genetics in Medicine. 20 (12), 1627-1634 (2018).
  27. Saul, R. A., Tarleton, J. C. FMR1-Related Disorders. GeneReviews. , (2012).
  28. Amos Wilson, J., et al. Consensus characterization of 16 FMR1 reference materials: a consortium study. Journal of Molecular Diagnostics. 10, 2-12 (2008).
  29. Kwok, Y. K., et al. Validation of a robust PCR-based assay for quantifying fragile X CGG repeats. Clinica Chimica Acta. 456, 137-143 (2016).
  30. Rousseau, F., Rouillard, P., Morel, M. L., Khandjian, E. W., Morgan, K. Prevalence of carriers of premutation-size alleles of the FMRI gene--and implications for the population genetics of the fragile X syndrome. American Journal of Human Genetics. 57, 1006-1018 (1995).
  31. Tassone, F., et al. FMR1 CGG allele size and prevalence ascertained through newborn screening in the United States. Genome Medicine. 4, 100 (2012).
  32. Dombrowski, C., et al. Premutation and intermediate-size FMR1 alleles in 10572 males from the general population: loss of an AGG interruption is a late event in the generation of fragile X syndrome alleles. Human Molecular Genetics. 11, 371-378 (2002).
  33. Cronister, A., Teicher, J., Rohlfs, E. M., Donnenfeld, A., Hallam, S. Prevalence and instability of fragile X alleles: implications for offering fragile X prenatal diagnosis. Obstetrics and Gynecology. 111, 596-601 (2008).
  34. Hayward, B. E., Kumari, D., Usdin, K. Recent advances in assays for the fragile X-related disorders. Human Genetics. 136, 1313-1327 (2017).
  35. Seltzer, M. M., et al. Prevalence of CGG expansions of the FMR1 gene in a US population-based sample. American Journal of Medical Genetics Part B Neuropsychiatrics Genetics. 259B, 589-597 (2012).
  36. Hayward, B. E., Usdin, K. Assays for determining repeat number, methylation status, and AGG interruptions in the Fragile X-related disorders. Methods in Molecular Biology. , 49-59 (1942).
  37. Orrico, A., et al. Mosaicism for full mutation and normal-sized allele of the FMR1 gene: a new case. American Journal of Medical Genetics. 78, 341-344 (1998).
  38. Schmucker, B., Seidel, J. Mosaicism for a full mutation and a normal size allele in two fragile X males. American Journal of Medical Genetics. 84, 221-225 (1999).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

151guaninetrinucleotideX 1Xpremutation

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved